李莉，宋琳，安淑榮，樸鐘源，楚魏，柯秋怡

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040

2.惠州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 惠州 516007

3.惠州市第三人民醫(yī)院 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬惠州醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科二區(qū)，廣東 惠州 516002

阿爾茨海默病是一種涉及認(rèn)知功能障礙和精神行為異常的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其早期臨床表現(xiàn)為短期記憶障礙，伴有進(jìn)行性加重，后期還會(huì)出現(xiàn)認(rèn)知、判斷和定向功能的異常[1-2]，對(duì)患者及其家庭造成了不可磨滅的影響，也大大加重了社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)。但是阿爾茨海默病的病理機(jī)制復(fù)雜目前尚未完全清楚，相繼出現(xiàn)了以β-淀粉樣蛋白（Aβ）、tau 蛋白、膽堿能損傷、免疫炎癥和腸道微生物群等為代表的學(xué)說。隨著全球老齡化的到來，阿爾茨海默病已經(jīng)成為重大公共衛(wèi)生問題。有研究表明，我國65 歲以上癡呆患病率6.6%，并呈每5 年增長1倍以上的趨勢(shì)，80 歲以上老年人癡呆患病率也達(dá)到了22%，預(yù)計(jì)21 世紀(jì)中葉癡呆患者會(huì)隨老年人口的增加達(dá)到2 000 萬[3]。

金釵石斛DendrobiumnobileLindl.、霍山石斛D.huoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng 同屬于蘭科石斛屬藥用植物，歷史悠久。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載石斛補(bǔ)五藏，虛勞羸瘦，強(qiáng)陰，長期服用可以厚腸胃，達(dá)到輕身延年的功效。《名醫(yī)別錄》記載：“益精，補(bǔ)內(nèi)絕不足，平胃氣，定志除驚”?！端幮员静荨酚涊d石斛益氣除熱，可以健陽，補(bǔ)腎積精，益腎氣，益力。現(xiàn)代研究表明，石斛具有保護(hù)神經(jīng)、抗衰老等作用[4]。王龍海[5]、李菲等[6]發(fā)現(xiàn)石斛可以通過抑制神經(jīng)元凋亡和tau 蛋白過度磷酸化、調(diào)節(jié)小鼠海馬線粒體和突觸等多種途徑改善與年齡相關(guān)的記憶力下降，與阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制及主要臨床表現(xiàn)高度契合。此外，金釵石斛主要成分為生物堿類、菲類以及聯(lián)芐類等，而霍山石斛主要成分為大分子多糖及小分子物質(zhì)聯(lián)芐類、黃酮等，所以由于產(chǎn)地分布較為廣泛，氣候、溫度、日照、水分、土壤等因素均會(huì)導(dǎo)致不同品種石斛中的有效成分、具體起作用的成分、作用靶點(diǎn)甚至作用通路都會(huì)存在一定程度差異，但這種差異尚未完全清楚，一定程度限制了臨床治療用藥，所以探究金釵石斛與霍山石斛藥用價(jià)值的差異有廣泛的研究前景[6-11]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的優(yōu)勢(shì)在于從系統(tǒng)生物學(xué)理論出發(fā)，可以通過多成分、多靶點(diǎn)探究藥物的作用機(jī)制，這種方法與中藥具有復(fù)雜成分的特點(diǎn)高度契合，所以可以利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建石斛與疾病的“藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型，可以揭示金釵石斛與霍山石斛中復(fù)雜的作用機(jī)制，進(jìn)而從整體層面研究和把握中藥對(duì)疾病的影響，對(duì)二者成分、作用靶點(diǎn)以及作用通路進(jìn)行比較，其成果可為臨床治療用藥、新藥研發(fā)等提供思路和理論支持[12]。

1 材料與方法

1.1 中藥活性成分的查找與篩選

通過中國知網(wǎng)、萬方、PubMed 收集金釵石斛、霍山石斛成分[10-11,13-17]，在PubChem 數(shù)據(jù)庫檢索和ChemDraw20 軟件中繪制金釵石斛和霍山石斛的化學(xué)分子結(jié)構(gòu)式，保存各結(jié)構(gòu)式（*sdf）的結(jié)構(gòu)。將獲得的結(jié)構(gòu)圖導(dǎo)入SWISS ADME 平臺(tái)，按照符合滿足“Gl absorption＝high”“可透過血腦屏障＝y(tǒng)es”以及滿足類藥性五原則的標(biāo)準(zhǔn)篩選中藥活性成分。

1.2 預(yù)測(cè)中藥活性成分的潛在靶點(diǎn)

將篩選出的符合要求的活性成分分別輸入到SwissTartgetPrediction 數(shù)據(jù)庫，下載活性成分相關(guān)信息，獲得probability＞0 的靶點(diǎn)，將收集到的靶點(diǎn)進(jìn)行整合、去除重復(fù)值等，分別獲得金釵、霍山石斛活性成分的潛在靶點(diǎn)。

1.3 疾病靶點(diǎn)的收集

將“Alzheimer’s disease”輸入到GeneCards 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，多次取中位數(shù)，最后選取relevance sore＞12 的靶點(diǎn)；輸入到OMIM 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，獲得所有阿爾茨海默病相關(guān)靶點(diǎn)，將二者進(jìn)行分列、合并、去重處理，即獲得相應(yīng)疾病靶點(diǎn)。

1.4 藥物成分及其預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的比較

將金釵、霍山石斛的活性成分輸入到Venny 2.1.0，做出金釵石斛與霍山石斛成分Venn 圖；將金釵石斛、霍山石斛各自預(yù)測(cè)總靶點(diǎn)分別與疾病靶點(diǎn)輸入到Venny 2.1.0 做Venn 圖，即各自與疾病的交集靶點(diǎn)；將金釵石斛、霍山石斛各成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)分別與疾病靶點(diǎn)輸入到Venny 2.1.0 做Venn 圖；將金釵石斛-疾病交集靶點(diǎn)與霍山石斛-疾病交集靶點(diǎn)輸入到Venny 2.1.0 做Venn 圖。

1.5 “活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

準(zhǔn)備金釵石斛、霍山石斛活性成分-疾病-靶點(diǎn)相關(guān)文件，導(dǎo)入到Cytoscape 3.9.1 軟件，利用其繪制活性成分-疾病-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)圖，計(jì)算degree 值，節(jié)點(diǎn)大小及顏色深淺按degree 值大小調(diào)節(jié)，degree 值越大，節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深。

1.6 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

分別將金釵石斛核心靶點(diǎn)、金釵石斛-疾病與霍山石斛-疾病交集靶點(diǎn)、霍山石斛核心靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，將物種設(shè)置為“Homo Sapien”“minimum required interaction scor”中選擇“medium confidence＞0.4”，選擇“hide disconnected nodes in the network”，其他默認(rèn)系統(tǒng)設(shè)置，下載TSV 文件。將其導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件，在CytoNCA 插件中篩選出degree 值大于平均數(shù)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，制作PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 基因本體（GO）功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

分別將金釵石斛核心靶點(diǎn)、金釵石斛-疾病與霍山石斛-疾病交集靶點(diǎn)、霍山石斛核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 進(jìn)行GO 功能以及KEGG 通路富集分析，GO 富集分析主要包括生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）以及分子功能（MF），篩選GO 功能富集分析前10 項(xiàng)結(jié)果制成柱狀圖進(jìn)行可視化；篩選KEGG通路富集分析前20 條通路制成氣泡圖進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 中藥活性成分的查找與篩選

在數(shù)據(jù)庫收集到金釵石斛成分共185 個(gè)，霍山石斛成分119 個(gè)，將獲得（*sdf）的結(jié)構(gòu)導(dǎo)入到SWISS ADME 平臺(tái)，滿足1.1 項(xiàng)下篩選要求后，獲得金釵石斛有效活性成分84 個(gè)，霍山石斛有效活性成分56 個(gè)，見表1、2。

表1 金釵石斛活性成分Table 1 Active components of D. nobile

表2 霍山石斛活性成分Table 2 Active components of D. huoshanense

2.2 中藥活性成分靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

選擇SwissTartgetPrediction 平臺(tái)預(yù)測(cè)的各活性成分中probability＞0 的靶點(diǎn)，獲得金釵石斛有效活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)776 個(gè)，霍山石斛有效活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)762 個(gè)。

2.3 疾病靶點(diǎn)的收集

GeneCards 數(shù)據(jù)庫中預(yù)測(cè)的阿爾茨海默病疾病靶點(diǎn)12 814 個(gè)，篩選后獲得疾病靶點(diǎn)1 312 個(gè)；OMIM 中預(yù)測(cè)阿爾茨海默病疾病靶點(diǎn)278 個(gè)，將二者合并、去重后共獲得疾病靶點(diǎn)1 474 個(gè)。

2.4 藥物成分及其預(yù)測(cè)靶點(diǎn)

將最終獲得金釵石斛和霍山石斛有效活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)分別與疾病靶點(diǎn)做Venn 圖，共獲得金釵石斛-疾病交集靶點(diǎn)255 個(gè)，霍山石斛-疾病靶點(diǎn)243 個(gè)；將以上二者做Venn 圖，獲得共同靶點(diǎn)208 個(gè)，在阿爾茨海默病預(yù)測(cè)靶點(diǎn)中，金釵石斛相對(duì)于霍山石斛差異靶點(diǎn)47 個(gè)，霍山石斛相對(duì)于金釵石斛差異靶點(diǎn)35 個(gè)，見圖1A～D。

圖1 藥物成分及其預(yù)測(cè)靶點(diǎn)Venn 圖Fig.1 Venn diagram of drug composition and predicted target

2.5 “活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

利用Cytoscape 3.9.1 軟件，按degree 值進(jìn)行調(diào)整后最終得到有422 個(gè)節(jié)點(diǎn)，3 387 條邊的“活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)圖中圓形節(jié)點(diǎn)（node）代表成分，方形節(jié)點(diǎn)代表預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)，邊（edge）表示活性成分和作用靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)圖中金釵石斛degree 值排名前10 位的活性成分為JC40、JC5、JC37、JC38、JC45、A6、JC41、JC43、JC21、JC30；霍山石斛degree 值排名前10位的活性成分為HS31、HS28、HS19、HS11、HS47、A6、HS8、HS7、HS44、HS45。以上可能為主要抗阿爾茨海默病主要活性成分，見圖2。

圖2 藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)圖Fig.2 Drug-active ingredient-disease-target graph

2.6 PPI 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/h3>

將金釵石斛-霍山石斛共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String 平臺(tái)，獲得節(jié)點(diǎn)數(shù)208，邊數(shù)為3 634 的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（P＜0.01）；將金釵石斛差異靶點(diǎn)輸入到String 平臺(tái)，獲得節(jié)點(diǎn)數(shù)47，邊數(shù)143 的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（P＜0.01）；將霍山石斛差異靶點(diǎn)輸入到String 平臺(tái)，獲得節(jié)點(diǎn)數(shù)35，邊數(shù)45 的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（P＜0.01），分別獲得TSV 文件，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件，在CytoNCA 插件中篩選degree 值較高靶點(diǎn)，重新調(diào)整網(wǎng)絡(luò)，獲得金釵石斛-霍山石斛共同靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)數(shù)為65，邊數(shù)為1 258 的PPI 網(wǎng)絡(luò)；金釵石斛差異靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)數(shù)為13，邊數(shù)為54 的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖；霍山石斛差異靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)數(shù)為8，邊數(shù)為14 的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3～5。

圖3 金釵石斛-霍山石斛共同靶點(diǎn)Fig.3 Common target of D. nobile-D. huoshanense

圖4 金釵石斛差異靶點(diǎn)Fig.4 Differential targets of D. nobile

圖5 霍山石斛差異靶點(diǎn)Fig.5 Different targets of D. huoshanense

2.7 GO 功能和KEGG 通路富集分析

分別將208 個(gè)金釵石斛-霍山石斛共同靶點(diǎn)、47 個(gè)金釵石斛差異靶點(diǎn)、35 個(gè)霍山石斛差異靶點(diǎn)呈遞到Matescape 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG 通路注釋分析和GO 功能分析。按數(shù)量值從大到小排列，篩取前20 條KEGG 通路注釋分析和GO 功能分析結(jié)果，顯示金釵石斛-霍山石斛共同靶點(diǎn)中治療阿爾茨海默病的相關(guān)通路有磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路、神經(jīng)退行性變的途徑-多種疾病、阿爾茨海默病、Ras 信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、Rap1 信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路、低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號(hào)通路等；金釵石斛差異靶點(diǎn)中治療阿爾茨海默病的相關(guān)通路有Toll 樣受體信號(hào)通路、阿爾茨海默病、神經(jīng)退行性變的途徑-多種疾病、細(xì)胞衰老等；霍山石斛差異靶點(diǎn)中治療阿爾茨海默病的相關(guān)通路有神經(jīng)退行性變的途徑-多種疾病、阿爾茨海默病、MAPK 信號(hào)通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路以及腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路等，見圖6～8。

圖6 金釵石斛-霍山石斛GO 功能富集和KEGG 通路分析Fig.6 Analysis of D. nobile and D. huoshanense common GO function enrichment KEGG pathway analysis

圖8 霍山差異靶點(diǎn)GO 功能富集和KEGG 通路分析Fig.8 GO functional enrichment and KEGG pathway analysis of Dendrobium huoshanense differential targets

3 討論

經(jīng)篩選，金釵石斛與霍山石斛共同成分共有8個(gè)，其中g(shù)igantol 結(jié)合靶點(diǎn)最多，并有研究表明gigantol 屬于石斛中的聯(lián)芐類化合物，具有較好的抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等作用，能夠通過激活PI3K-Akt 顯著防止H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，臨床中治療缺血性疾病有較好療效[18-19]；其次，金釵石斛的差異成分有N-isopentenyl-6-hydroxyden droxinium、3-O-methylgigantol、moscatilin、crepidatin、nobilin C 等，霍山石斛中還有 erianin、dihydroresveratrol、dendrocandin U、3-hydroxy-5,4'-dimethoxybibenz 等活性成分，均以聯(lián)芐類和生物堿類成分為主，以上可能為金釵石斛、霍山石斛治療阿爾茨海默病的主要活性成分。劉敬等[20]研究表明，毛蘭素的神經(jīng)保護(hù)作用可能與激活抗凋亡有關(guān)，為未來進(jìn)一步展開神經(jīng)系統(tǒng)疾病基礎(chǔ)及臨床研究奠定基礎(chǔ)。

金釵石斛-霍山石斛疾病交集靶點(diǎn)中聚ADP核糖聚合酶（PARP1）、細(xì)胞色素 P45019A1（CYP19A1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5 激活因子1（CDK5R1）、基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP1）、花生四烯酸-5-脂加氧酶（ALOX5）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、雌激素受體2（ESR2）等；金釵石斛差異靶點(diǎn)中法尼醇X 受體（NR1H14）、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶P1（GSTP1）、核受體亞家族3C 組成員2（NR3C2）等；霍山石斛差異靶點(diǎn)中Ⅴ組磷脂酶A2（PLA2G5）、溶質(zhì)載體家族2 成員1（SLC2A1）、DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）等。這些靶點(diǎn)可能為金釵石斛與霍山石斛治療阿爾茨海默病的作用靶點(diǎn)。PPI 網(wǎng)絡(luò)提示，Akt1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、白蛋白（ALB）、TNF、酪氨酸蛋白激酶（SRC）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、促分裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、表皮生長因子受體（EGFR）、胱天蛋白酶3（CASP3）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）為金釵石斛-霍山石斛共同作用PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中核心靶點(diǎn)；白細(xì)胞介素-6（IL-6）、Toll 樣受體4（TLR4）、生長調(diào)節(jié)致癌基因β（CXCLB）等為金釵石斛差異PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中核心靶點(diǎn)，連環(huán)蛋白 β1（CTNNB1）、熱休克蛋白 5（HSPA5）、微管相關(guān)蛋白tau（MAPT）等為霍山石斛差異PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中核心靶點(diǎn)。研究表明，激活PARP1 減少DNA 損傷，可以在一定程度上改善細(xì)胞衰老[21]；雌激素對(duì)阿爾茨海默病有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，CYP19A1 基因可編碼合成雌激素的關(guān)鍵酶，CYP19A1 基因的多態(tài)性與阿爾茨海默病相關(guān)，人類CYP19A1 rs2899472 基因突變會(huì)對(duì)Aβ42 和Tau 蛋白水平表達(dá)產(chǎn)生影響，能夠增加阿爾茨海默病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[22]。此外，Akt1 能夠通過調(diào)控Tau 蛋白發(fā)揮抗阿爾茨海默病作用；VEGFA 能夠有效促進(jìn)血管生成，在阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展尤其是缺血性阿爾茨海默病的過程中發(fā)揮著重要作用；MAPK3 參與多種應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提高Tau蛋白的磷酸化；CASP3 可能會(huì)引起Tau 蛋白異常磷酸化，從而引起神經(jīng)元纖維纏結(jié)，造成阿爾茨海默病；在Aβ 的持續(xù)刺激下小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和單核細(xì)胞會(huì)釋放大量致炎因子，包括IL-6、TNF-α 等，從而不斷地加重阿爾茨海默病的炎癥反應(yīng)[23-24]。金釵石斛和霍山石斛可能通過作用于以上靶點(diǎn)通過多種方式起到治療阿爾茨海默病的作用。

GO 功能與KEGG 富集分析結(jié)果顯示金釵石斛與霍山石斛可能是通過PI3K-Akt 信號(hào)通路、神經(jīng)退行性變的途徑-多種疾病、阿爾茨海默病等途徑，作用在樹突、軸突等位置，主要調(diào)節(jié)激酶活性蛋白激酶活性、激酶結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合，參與磷、酸化正調(diào)控、蛋白磷酸化等BP，發(fā)揮治療阿爾茨海默病的作用。此外，金釵石斛可以通過Toll 樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞衰老作用于神經(jīng)元細(xì)胞體，細(xì)胞體，樹突，軸突等位置治療阿爾茨海默病，霍山石斛可以通過MAPK 信號(hào)通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號(hào)通路等，作用于軸突、神經(jīng)突觸后等位置，通過調(diào)節(jié)蛋白激酶活性、激酶結(jié)合等，參與蛋白磷酸化調(diào)節(jié)發(fā)揮治療阿爾茨海默病的作用。研究表明，PI3K-Akt信號(hào)通路是神經(jīng)存活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑、參與調(diào)節(jié)大腦認(rèn)知功能的重要途徑，進(jìn)一步佐證了此項(xiàng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果[25]。

綜上所述，金釵石斛和霍山石斛可能會(huì)在凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)、血管生成、基因遺傳、炎癥反應(yīng)等多個(gè)方面，通過PI3K-Akt 信號(hào)通路、神經(jīng)退行性變的途徑-多種疾病、阿爾茨海默病等多個(gè)通路起到抗阿爾茨海默病作用，充分體現(xiàn)了中藥多維度、多靶點(diǎn)治療阿爾茨海默病的優(yōu)勢(shì)。此外，相對(duì)于霍山石斛，金釵石斛從細(xì)胞衰老、炎癥反應(yīng)方面抗阿爾茨海默病可能有一定優(yōu)勢(shì)；而霍山石斛除了相同通路外，還可能作用MAPK 信號(hào)通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路治療阿爾茨海默病。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突