謝慧臣,羅麗華,吳廣陽(yáng)

1.湖北民族大學(xué)(湖北 恩施 445000) 2.恩施自治州中心醫(yī)院(湖北 恩施 445000)

麩炒法是中藥傳統(tǒng)炮制方法,歷代本草專著多有記載,用料常是麥麩或麩皮。蒼術(shù)具有健脾、祛風(fēng)、燥濕等功效,但麩炒后的蒼術(shù)與生蒼術(shù)功效差異較大,說(shuō)明蒼術(shù)麩炒法可明顯改變蒼術(shù)的化學(xué)成分及含量[1]。查閱文獻(xiàn)后,發(fā)現(xiàn)目前關(guān)于蒼術(shù)炮制前后藥理作用差異機(jī)理的研究尚不足[2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)創(chuàng)建脾虛大鼠模型,從結(jié)腸、胰腺組織磷酸化鈣調(diào)素依賴蛋白激酶Ⅱ(p-CaMKⅡ)信號(hào)通路入手,以期闡明蒼術(shù)麩炒后較生品健脾作用增強(qiáng)的機(jī)理,為后續(xù)麩炒蒼術(shù)健脾作用機(jī)制的進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用打下一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、儀器、藥物與試劑雄性SD大鼠70只,3～4月齡,體質(zhì)量(150±20)g,購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司,許可證號(hào)SYXK(鄂)20180101,常規(guī)喂養(yǎng),自由進(jìn)食水。中藥均購(gòu)自湖北省恒信醫(yī)藥有限公司。小承氣湯方厚樸、大黃、枳實(shí)的組方比例為5∶4∶3,共5kg,生蒼術(shù)和麩炒蒼術(shù)各5kg,小承氣湯方、生蒼術(shù)和麩炒蒼術(shù)分別常規(guī)煎煮2次,每次45min,分別濾出藥液合并再濃縮,小承氣湯方濃縮液含生藥濃度6g/mL,生蒼術(shù)和麩炒蒼術(shù)濃縮液含生藥濃度2.0g/mL,低溫保存。磷酸化鈣調(diào)p-CaMKⅡ抗體(貨號(hào):ab23514)由武漢塞維爾生物科技有限公司提供;RNA提取液(貨號(hào):J253479)由Servicebio提供,引物由Thermo提供;引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列信息

Stepone plus GC-1500型熒光定量PCR儀(ABI);Adobe PhotoShop圖像分析軟件(Adobe);AutoLumo A2000Plus化學(xué)發(fā)光儀(鄭州安圖生物工程股份有限公司);NE600光學(xué)顯微鏡(西尼科光學(xué)儀器有限公司)。

1.2動(dòng)物分組、造模與給藥70只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、復(fù)方谷氨酰胺組、生蒼術(shù)及麩炒蒼術(shù)高、低劑量組?？嗪茪馀c饑飽失常法建立脾氣虛大鼠模型[3-4],除正常組外的其余6組大鼠每日灌服苦寒破氣方1次,劑量為生藥10mL/kg體質(zhì)量,隔日喂飼1次,劑量減半,共計(jì)21d。造模結(jié)束后即灌胃治療。蒼術(shù)與復(fù)方谷氨酰胺每日用量根據(jù)成人每日用量,通過(guò)體表面積公式換算得到蒼術(shù)麩炒前后高、低劑量組大鼠每日用量分別為10、2.5mL/kg,復(fù)方谷氨酰胺9mg/kg,治療前蒸餾水配制成溶液2mL灌胃,正常組、模型組每日給予生理鹽水2mL灌胃,持續(xù)治療14d。

1.3觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 觀察結(jié)腸、胰腺組織病理學(xué)改變 治療期滿后,水合氯醛腹腔注射麻醉,心臟采血6mL,離心后取上清液低溫保存,取結(jié)腸、胰腺一部分4%多聚甲醛固定,脫水、石蠟包埋、切片,HE染色,光鏡下觀察結(jié)腸、胰腺病理學(xué)改變。

1.3.2 激光共聚焦法檢測(cè)大鼠結(jié)腸、胰腺組織細(xì)胞中Ca2+表達(dá)水平 將冷凍結(jié)腸、胰腺組織取出切片,沖洗,染色,孵育,封片,根據(jù)Cal-520?鈣熒光指示劑說(shuō)明書(shū)操作,對(duì)標(biāo)本熒光標(biāo)記,激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度并連續(xù)攝片,圖像分析系統(tǒng)測(cè)定熒光強(qiáng)度并分析。

1.3.3 免疫組化法檢測(cè)大鼠結(jié)腸、胰腺磷酸化CaMKⅡ(p-CaMKⅡ)蛋白分布及表達(dá) 另取結(jié)腸、胰腺一部分4%多聚甲醛固定,脫水、石蠟包埋、切片,按照免疫組織化學(xué)SABC法步驟操作,觀察模型大鼠結(jié)腸、胰腺p-CaMKⅡ蛋白表達(dá),具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,結(jié)果以平均光密度值表達(dá)。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組大鼠結(jié)腸、胰腺組織中p-CaMKⅡ基因表達(dá) 取勻漿管,加入1mL Trizol Reagent,取100mg組織,勻漿,離心取上清,異丙醇混勻,離心,乙醇洗滌,加水溶解RNA,取10μL RNA溶液,加入逆轉(zhuǎn)錄酶,配制反應(yīng)體系,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PCR擴(kuò)增。采用ΔΔCT法,即2-K計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1生蒼術(shù)和麩炒蒼術(shù)對(duì)脾虛大鼠結(jié)腸、胰腺組織病理學(xué)的影響光鏡下可見(jiàn)正常組大鼠結(jié)腸形態(tài)組織學(xué)無(wú)明顯異常,黏膜光滑,細(xì)胞排列整齊,腸腺豐富,無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A),胰腺組織胰島數(shù)較多,島內(nèi)細(xì)胞豐滿,結(jié)構(gòu)清楚,排列整齊(圖2A);模型組大鼠結(jié)腸黏膜水腫破壞較嚴(yán)重,炎性滲出及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),腺體排列紊亂,肉芽組織增生(圖1B),胰腺組織胰島數(shù)明顯減少,細(xì)胞分布不均,島內(nèi)細(xì)胞大量呈空泡狀,結(jié)構(gòu)模糊,排列紊亂(圖2B);與模型組比較,生蒼術(shù)低劑量組光鏡下可見(jiàn)結(jié)腸黏膜及胰腺組織微觀結(jié)構(gòu)改善不明顯(圖1F、2F),其余各治療組光鏡下可見(jiàn)結(jié)腸腺體結(jié)構(gòu)、粘膜層、粘膜下層結(jié)構(gòu)不同程度修復(fù),炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少(圖1C-1E,1G),胰腺組織中胰島數(shù)及島內(nèi)細(xì)胞數(shù)不同程度回升,空泡狀細(xì)胞不同程度減少,細(xì)胞分布漸趨均勻,核大小漸趨一致(圖2C-2E,2G),其中麩炒蒼術(shù)高劑量組修復(fù)最為明顯。

A:正常組;B:模型組;C:復(fù)方谷氨酰胺組;D:麩炒蒼術(shù)低劑量組;E:麩炒蒼術(shù)高劑量組;F:生蒼術(shù)低劑量組;G:生蒼術(shù)高劑量組。圖1 生蒼術(shù)和麩炒蒼術(shù)對(duì)脾虛大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響(HE染色,×200)

A:正常組;B:模型組;C:復(fù)方谷氨酰胺組;D:麩炒蒼術(shù)低劑量組;E:麩炒蒼術(shù)高劑量組;F:生蒼術(shù)低劑量組;G:生蒼術(shù)高劑量組。圖2 生蒼術(shù)和麩炒蒼術(shù)對(duì)脾虛大鼠胰腺組織病理學(xué)的影響(HE染色,×200)

2.2生蒼術(shù)和麩炒蒼術(shù)對(duì)脾虛大鼠結(jié)腸、胰腺組織細(xì)胞中Ca2+熒光值的影響與正常組比較,模型組結(jié)腸組織細(xì)胞Ca2+熒光值升高,胰腺組織細(xì)胞Ca2+熒光值降低(P<0.01);與模型組比較,麩炒蒼術(shù)高、低劑量組、生蒼術(shù)高劑量組和復(fù)方谷氨酰胺組結(jié)腸組織細(xì)胞Ca2+熒光值降低,胰腺組織細(xì)胞Ca2+熒光值升高(P<0.05或P<0.01);與復(fù)方谷氨酰胺組比較,麩炒蒼術(shù)高劑量組結(jié)腸組織細(xì)胞Ca2+熒光值降低,胰腺組織細(xì)胞Ca2+熒光值升高(P<0.05或P<0.01);與生蒼術(shù)高劑量組比較,麩炒蒼術(shù)高劑量組結(jié)腸組織細(xì)胞Ca2+熒光值降低,胰腺組織細(xì)胞Ca2+熒光值升高(P<0.01),見(jiàn)表2,圖3、圖4。

A:正常組;B:模型組;C:復(fù)方谷氨酰胺組;D:麩炒蒼術(shù)低劑量組;E:麩炒蒼術(shù)高劑量組;F:生蒼術(shù)低劑量組;G:生蒼術(shù)高劑量組。圖3 生蒼術(shù)和麩炒蒼術(shù)對(duì)脾虛大鼠結(jié)腸組織細(xì)胞中Ca2+表達(dá)水平的影響(熒光圖,×400)

A:正常組;B:模型組;C:復(fù)方谷氨酰胺組;D:麩炒蒼術(shù)低劑量組;E:麩炒蒼術(shù)高劑量組;F:生蒼術(shù)低劑量組;G:生蒼術(shù)高劑量組。圖4 生蒼術(shù)和麩炒蒼術(shù)對(duì)脾虛大鼠胰腺組織細(xì)胞中Ca2+表達(dá)水平的影響(熒光圖,×400)

表2 生蒼術(shù)和麩炒蒼術(shù)對(duì)脾虛大鼠結(jié)腸、胰腺組織細(xì)胞中Ca2+濃度的影響

2.3生蒼術(shù)和麩炒蒼術(shù)對(duì)脾虛大鼠結(jié)腸、胰腺組織中p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)的影響與正常組比較,模型組結(jié)腸組織p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平升高,胰腺組織p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01);與模型組比較,麩炒蒼術(shù)高、低劑量組、生蒼術(shù)高劑量組和復(fù)方谷氨酰胺組結(jié)腸組織p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平降低,胰腺組織p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05或P<0.01);與復(fù)方谷氨酰胺組比較,麩炒蒼術(shù)高劑量組結(jié)腸組織p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平降低,胰腺組織p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05或P<0.01);與生蒼術(shù)高劑量組比較,麩炒蒼術(shù)高劑量組結(jié)腸組織p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平降低,胰腺組織p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平升高(P<0.01),見(jiàn)表3。

表3 生蒼術(shù)和麩炒蒼術(shù)對(duì)脾虛大鼠結(jié)腸、胰腺組織中p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)的影響

2.4生蒼術(shù)和麩炒蒼術(shù)對(duì)脾虛大鼠結(jié)腸、胰腺組織中p-CaMKⅡ基因表達(dá)的影響與正常組比較,模型組結(jié)腸組織p-CaMKⅡ基因表達(dá)升高,胰腺組織p-CaMKⅡ基因表達(dá)降低(P<0.01);與模型組比較,麩炒蒼術(shù)高、低劑量組、生蒼術(shù)高劑量組和復(fù)方谷氨酰胺組結(jié)腸組織p-CaMKⅡ基因表達(dá)水平降低,胰腺組織p-CaMKⅡ基因表達(dá)水平升高(P<0.05或P<0.01);與復(fù)方谷氨酰胺組比較,麩炒蒼術(shù)高劑量組結(jié)腸組織p-CaMKⅡ基因表達(dá)水平降低,胰腺組織p-CaMKⅡ基因表達(dá)水平升高(P<0.05或P<0.01);與生蒼術(shù)高劑量組比較,麩炒蒼術(shù)高劑量組結(jié)腸組織p-CaMKⅡ基因表達(dá)水平降低,胰腺組織p-CaMKⅡ基因表達(dá)水平升高(P<0.01),見(jiàn)表4。

表4 生蒼術(shù)和麩炒蒼術(shù)對(duì)脾虛大鼠結(jié)腸、胰腺組織中p-CaMKⅡ基因表達(dá)的影響

3 討論

目前脾虛證動(dòng)物模型的制備多采用與臨床真實(shí)環(huán)境更加接近的多因素復(fù)合造模方法,綜合相關(guān)文獻(xiàn)[5-6],本研究采用苦寒破氣加饑飽失常法構(gòu)建脾虛證模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)光鏡下模型大鼠結(jié)腸黏膜水腫破壞較嚴(yán)重,炎性滲出及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),腺體排列紊亂,結(jié)構(gòu)模糊,胰腺組織胰島數(shù)明顯減少,細(xì)胞分布不均,說(shuō)明上述脾虛證造模方法的科學(xué)性。而生蒼術(shù)和麩炒蒼術(shù)均能不同程度改善模型大鼠結(jié)腸和胰腺組織結(jié)構(gòu),且麩炒蒼術(shù)與生蒼術(shù)比較,療效更為突出,其中尤以麩炒蒼術(shù)高劑量組改善最為顯著。

細(xì)胞內(nèi)Ca2+作為重要的調(diào)節(jié)介質(zhì)和第二信使,參與細(xì)胞的能量代謝,對(duì)細(xì)胞的生存和凋亡具有重要影響。CaMKⅡ是重要的Ca2+信號(hào)介導(dǎo)分子,參與細(xì)胞的形態(tài)、凋亡、遷移、興奮收縮偶聯(lián)等多種細(xì)胞調(diào)節(jié)功能,有研究表明[7]Ca2+/CaMKⅡ信號(hào)通路與中醫(yī)“脾”的功能關(guān)系密切,目前常常把Ca2+/CaMKⅡ通路活性變化作為測(cè)試脾虛證治療效果的重要指標(biāo)。蛋白磷酸化和去磷酸化參與調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)的各個(gè)方面。研究發(fā)現(xiàn)[8]磷酸化CaMKⅡ可通過(guò)一定的通路調(diào)節(jié)胃腸平滑肌,使大鼠胃竇平滑肌松弛,調(diào)節(jié)和改善胃腸動(dòng)力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,脾虛證大鼠結(jié)腸組織p-CaMKⅡ蛋白和基因表達(dá)升高,表明脾虛證大鼠腸道Ca2+/CaMKⅡ信號(hào)傳導(dǎo)通路可被代償性激活,而脾虛大鼠胰腺細(xì)胞由于能量代謝低下,導(dǎo)致其分泌功能出現(xiàn)障礙,抑制了大鼠胰腺細(xì)胞CaMKⅡ的表達(dá)[9]。而生品和麩炒蒼術(shù)可降低結(jié)腸組織p-CaMKⅡ蛋白和基因表達(dá),表明蒼術(shù)可通過(guò)下調(diào)p-CaMKⅡ表達(dá),抑制腸道平滑肌細(xì)胞的收縮和痙攣,調(diào)節(jié)正常的胃腸激素分泌,促進(jìn)胃腸平滑肌正常蠕動(dòng),并調(diào)控相關(guān)胃腸激素及抑炎或促炎因子正常分泌。同時(shí)上調(diào)胰腺p-CaMKⅡ的表達(dá),表明蒼術(shù)可使胰腺組織中Ca2+/CaMKⅡ信號(hào)通路中的p-CaMKⅡ等關(guān)鍵信號(hào)分子被激活,促使胰腺功能恢復(fù)正常,且不同劑量麩炒蒼術(shù)療效均優(yōu)于同劑量的生蒼術(shù),其中尤以麩炒蒼術(shù)高劑量組療效最為明顯,與生蒼術(shù)高劑量組比較具有顯著性差異。提示麩炒蒼術(shù)可更好的通過(guò)Ca2+/p-CaMKⅡ信號(hào)通路調(diào)節(jié)脾虛大鼠結(jié)腸和胰腺功能,促進(jìn)臨床療效。