高靜云,段麗穎,趙勝男,杜義龍,潘海峰

承德醫(yī)學(xué)院河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(河北 承德 067000)

山楂葉為薔薇科山楂屬植物山里紅CrataeguspinnatifidaBge.Var.majorN.E.Br．或山楂CrataeguspinnatifidaBge．的干燥葉,具有理氣通脈,活血化瘀,化濁降脂的功效[1-2]。其中黃酮類成分為主要活性成分[3-7]。此外,以山楂葉提取物為原料的益心酮膠囊、心安膠囊等制劑在臨床上應(yīng)用較廣[8],可發(fā)揮降血脂、降血壓、降糖,抗血栓、心肌缺血、心律不齊,以及抗炎等療效[9-10]?，F(xiàn)如今山楂葉在我國遼寧、山西、河北、山東等多地被種植,由于其嫁接技術(shù)不同、品種多樣、氣候不一,使得不同產(chǎn)區(qū)、不同品種的山楂葉質(zhì)量參差不齊。2020年版《中國藥典》一部中僅以山楂葉單一成分(金絲桃苷)和總黃酮含量為含量測定標(biāo)準(zhǔn),以蘆丁、金絲桃苷為鑒別標(biāo)準(zhǔn),測定指標(biāo)單一,無法控制山楂葉整體質(zhì)量[1],不能滿足對不同產(chǎn)地山楂葉質(zhì)量進(jìn)行客觀評價(jià)的要求。近年來,指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別的分析方法,從定性與定量方面在中藥鑒別和質(zhì)量控制方面得到廣泛應(yīng)用[11-16]。本文對4個(gè)不同產(chǎn)地的山楂葉進(jìn)行指紋圖譜研究以及多組分含量測定,并運(yùn)用主成分分析、聚類分析等方法,對不同產(chǎn)地的山楂葉質(zhì)量進(jìn)行客觀的評價(jià),為其更好的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1200高效液相色譜儀,美國安捷倫公司;JA5003上皿天平(千分之一),天津天馬衡基儀器有限公司;AG225電子分析天平,瑞士梅特勒-托利多公司;KQ-700超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;HC-2062高速離心機(jī),科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;FW100高速萬能粉碎機(jī),天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2試藥對照品綠原酸(批號18071907)、牡荊素葡萄糖苷(批號20042305)、牡荊素鼠李糖苷(批號20042304)、牡荊素(批號18052906)、蘆丁(批號181227)、金絲桃苷(批號19103001)、異槲皮素(批號18062702)均購自成都普菲得生物技術(shù)有限公司。乙腈、四氫呋喃均為色譜純,購自美國Fisher Scientific公司,甲醇、甲酸為分析純,純凈水(批號GB19298,廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

2021年10、11月收集的22批山楂葉樣品經(jīng)全國老中醫(yī)藥專家(傳統(tǒng)鑒定)學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承人孫寶惠主任藥師鑒定為山里紅CrataeguspinnatifidaBge.var.MajorN.E.Br.的干燥葉。經(jīng)檢測22批山楂葉均符合2020年版《中國藥典》一部山楂葉質(zhì)量控制各項(xiàng)下要求,見表1。

表1 22批山楂葉樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1溶液制備

2.1.1 混合對照品溶液 分別精密稱取對照品綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、金絲桃苷、異槲皮素、牡荊素鼠李糖苷適量,置于容量瓶中,配制為母液。精密吸取適量上述對照品母液,置于容量瓶中,配制質(zhì)量濃度分別為61.98、131.82、204.00、300.00、192.00μg/mL的混合對照品溶液,搖勻,備用。

2.1.2 供試品溶液 22批不同產(chǎn)地山楂葉經(jīng)粉碎后過80目篩。精密稱取1.0g,置于具塞三角瓶中,加60%甲醇溶液50mL,稱重,密封超聲30min,靜置,待其恢復(fù)室溫重新稱定并補(bǔ)足失重。12000r/min,10min,離心,取上層清液,0.45μm微孔濾膜濾過,得續(xù)濾液即為供試品溶液。

2.2指紋圖譜及含量測定色譜條件安捷倫ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);流動(dòng)相0.3%甲酸水(A)-乙腈:四氫呋喃(B,12∶1),梯度洗脫(0～15min,8%～12%B;15～25min,12%～16%B;25～38min,16%～15%B;38～45min,15%～20%B;45～50min,20%～34%B;50～55min,34%～100%B)。1mL/min的流速及30℃的柱溫;進(jìn)樣體積10μL;檢測波長363nm。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系及定量限、檢測限 精密吸取5mL“2.1.1”項(xiàng)下的混合對照品溶液,置10mL的容量瓶中,加60%甲醇搖勻,定容。倍比稀釋依次加60%甲醇制成系列濃度溶液,獲得7個(gè)水平的混合對照品溶液,通過“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸分析,得回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量,倍比稀釋,通過“2.2”項(xiàng)下的色譜條件測定,以S/N=10作為定量限(LOQ),信噪比(S/N)=3作為檢測限(LOD),見表2。

表2 5種指標(biāo)成分的回歸方程,相關(guān)系數(shù),線性范圍及定量限,檢測限

2.3.2 專屬性考察 取適量“2.1”項(xiàng)下的混合對照品溶液和供試品溶液,依照“2.2”的色譜條件,進(jìn)樣分析,記錄色譜圖(圖1)。結(jié)果表明,供試品溶液中綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、金絲桃苷、牡荊素鼠李糖苷和異槲皮素的色譜峰保留時(shí)間與混合對照品溶液一致,且均與相鄰色譜峰的分離度良好?？瞻兹芤簩y定無干擾。

A:混合對照品溶液;B:供試品溶液;C:空白溶液;1.綠原酸;3.牡荊素葡萄糖苷;4.牡荊素鼠李糖苷;8.金絲桃苷;9.異槲皮素。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下山楂葉供試品溶液(S9,連續(xù)進(jìn)樣6次,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測,記錄指紋圖譜。以牡荊素鼠李糖苷為參比峰,計(jì)算各共有峰的相對峰面積0.1%～2.05%,相對保留時(shí)間RSD均<0.5%(n=6)。綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、異槲皮素峰面積的RSD分別為0.29%、0.21%、0.33%、0.82%、0.25%。表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下山楂葉藥材(S9),按“2.1.1”項(xiàng)下制備方法,平行制備6份,并按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測,以牡荊素鼠李糖苷為參比峰,計(jì)算各共有峰的相對峰面積為0.23%～2.91%,相對保留時(shí)間RSD均<0.18%(n=6)。計(jì)算綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、異槲皮素峰面積的RSD分別為0.91%、0.93%、0.90%、1.18%、1.01%,證明了該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下山楂葉供試品溶液(S9)分別于室溫下放置0、2、4、8、12、22h進(jìn)樣,按“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行檢測,以牡荊素鼠李糖苷為參比峰,計(jì)算各共有峰的相對峰面積為0.11%～2.66%(n=6)、相對保留時(shí)間RSD<0.22%(n=6)。計(jì)算綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、異槲皮素峰面積的RSD分別為0.61%、0.44%、0.82%、0.73%、0.89%,說明了供試品溶液置于室溫22h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率 精密稱取6份S9樣品,每份0.50g,分別按已知指標(biāo)成分含量的100%加入綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、異槲皮素對照品溶液。按“2.1.2”及“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測定,記錄峰面積,計(jì)算加樣回收率。結(jié)果如表3顯示,各成分的平均加樣回收率92.92%～107.19%,RSD為0.30%～2.78%,表明方法準(zhǔn)確度良好。

表3 綠原酸等5個(gè)成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4HPLC指紋圖譜的建立與共有峰指認(rèn)

2.4.1 建立山楂葉指紋圖譜以及指認(rèn)共有峰 分別稱取22批山楂葉藥材粉末1.0g,依照“2.1.2”與“2.2”項(xiàng)下方法與條件制備供試品溶液并測定記錄色譜圖。將山楂葉的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012年版)》中進(jìn)行分析,參照S9樣品色譜圖,經(jīng)中位系數(shù)法對各色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配并生成對照圖譜(R)以及22批山楂葉樣本的疊加色譜圖。結(jié)果顯示(圖2、3)22批山楂葉樣品的指紋圖譜中標(biāo)定了10個(gè)共有峰。結(jié)合混合對照品色譜圖1(A)可見,指認(rèn)峰1為綠原酸、峰3為牡荊素葡萄糖苷、峰4為牡荊素鼠李糖苷、峰8為金絲桃苷、峰9為異槲皮素。

圖2 22批山楂葉的疊加色譜圖

圖3 山楂葉的對照指紋圖譜

2.4.2 相似度評價(jià) 通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012年版)》軟件,對22批山楂葉樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度進(jìn)行分析。由表4所示,發(fā)現(xiàn)22批山楂葉指紋圖譜與對照圖譜相似,S1～S22相似度均高于0.900。這表明不同產(chǎn)地山楂葉的色譜特征相似,化學(xué)成分大體相同。

2.5化學(xué)模式識別分析

2.5.1 系統(tǒng)聚類分析 采用SPSS 21.0軟件,使用Ward法,以平方歐氏距離為測度,以22批山楂葉指紋圖譜的10個(gè)共有峰峰面積為變量,進(jìn)行聚類分析[17]。22批山楂葉的聚類分析樹狀圖(圖4),結(jié)果顯示,當(dāng)平方歐氏距離為10時(shí),22批樣品可聚為兩類,S1～S15遼寧、河北產(chǎn)地藥材聚為一類,S16～S22山西、山東產(chǎn)地藥材聚為一類。這可能與產(chǎn)地的溫度氣候、空氣土壤和地理位置等因素相關(guān)。

2.5.2 峰面積的主成分分析 采用SPSS 21.0對22批山楂葉樣品進(jìn)行主成分分析。由表5所示,前3個(gè)因子的特征值>1,對總方差的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到80.825%,提示這3個(gè)主成分涵蓋了山楂葉樣品指紋圖譜中10個(gè)分析變量的大部分信息。由表5、表6看出,主成分1的信息量最大,方差貢獻(xiàn)率為44.059%。峰1、3、5、6、7在第1主成分上有較高載荷,說明單主成分1就反映了這5個(gè)成分的信息;第2主成分方差貢獻(xiàn)率為23.795%,主要反映了峰2、8、9、10的指標(biāo)信息;主成分3的方差貢獻(xiàn)率為12.971%,主要反映了峰4的指標(biāo)信息。由此因子荷載矩陣表推測,影響山楂葉質(zhì)量差異的并不是單一成分,而是多成分的協(xié)同作用的結(jié)果。同時(shí)以此三類主成分構(gòu)建22批山楂葉三維(3D)圖,結(jié)果見圖5,其分類結(jié)果與“2.5.1”項(xiàng)下聚類分析結(jié)果一致,即S1～S15河北、遼寧產(chǎn)地聚為一類,S16～S22山東、山西產(chǎn)地為一類。

表5 山楂葉主成分分析的特征值與累計(jì)方差貢獻(xiàn)率

表6 山楂葉主成分分析的初始因子載荷矩陣

2.6主要成分含量測定

2.6.1 溶液的制備 混合對照品溶液和供試品溶液的制備分別同“2.1.1,2.1.2”項(xiàng)?？瞻兹芤簽?0%甲醇。

2.6.2 色譜條件 同“2.2”項(xiàng)。

2.6.3 樣品含量測定 精密稱取22批山楂葉樣品粉末各1.0g,按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積,按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。各樣品平行測定3次,見表7。

表7 22批山楂葉藥材的含量測定結(jié)果(n=3,mg/g)

3 討論

本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中以色譜峰的分離度、峰形、峰面積等為指標(biāo)考察了不同流動(dòng)相系統(tǒng)、不同柱溫(20、25、30℃)、檢測波長(363、350、340、320、296nm)以及流速(1.0、1.2、0.8mL/min)等,結(jié)果顯示,以0.3%甲酸水(A)-乙腈:四氫呋喃(B,12∶1)為流動(dòng)相,柱溫為30℃,波長為363nm,流速為1mL/min時(shí),色譜圖中基線相對平穩(wěn),色譜峰峰形較好,分離度較高。

本研究建立了山楂葉的HPLC指紋圖譜及5個(gè)成分的含量測定方法。并對22批山楂葉樣本進(jìn)行了主成分分析和聚類分析,兩種分析結(jié)果完全一致,顯示可聚為兩類,河北與遼寧產(chǎn)地的藥材S1～S15聚為一類,因其峰1(綠原酸)、峰3(牡荊素葡萄糖苷)、峰4(牡荊素鼠李糖苷)均較高,這與河北、遼寧同緯度,地處亞歐大陸東岸,同屬大陸性季風(fēng)氣候相關(guān)。山西與山東產(chǎn)地的藥材S16～S22聚為一類,5種成分含量均差別不大,這與山東、山西地處同緯度,地理?xiàng)l件相似有關(guān)。對5種成分含量進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),河北、遼寧產(chǎn)地的綠原酸、牡荊素葡萄糖苷含量均高于山東、山西,牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷含量四地差別不大,這也是河北、遼寧產(chǎn)地藥材聚為一類,山東、山西產(chǎn)地藥材聚為一類的原因。由4個(gè)產(chǎn)地的牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷含量相似可以看出,《中國藥典》將這兩種成分作為山楂葉藥材與山楂葉提取物主要含量測定指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)控是經(jīng)過多方考量的。

綜上,本研究所建立的HPLC指紋圖譜和含量測定方法分離度高、平穩(wěn)、簡單、準(zhǔn)確。指紋圖譜結(jié)合多組分含量測定、主成分分析以及聚類分析,相對于單一成分的測定方法可從整體上體現(xiàn)山楂葉質(zhì)量。不同的環(huán)境氣候、空氣土壤使得藥材質(zhì)量參差不齊,藥材質(zhì)量不同對臨床療效也是不盡相同的,中藥化學(xué)成分復(fù)雜,不同藥材的內(nèi)在質(zhì)量必然影響療效。因此本研究建立的方法能夠?qū)Σ煌a(chǎn)地山楂葉藥材的質(zhì)量進(jìn)行客觀地評價(jià),為其在臨床上更好的應(yīng)用提供更加客觀的理論基礎(chǔ)。同時(shí)為更準(zhǔn)確評價(jià)山楂葉質(zhì)量,還需開展更多藥效與藥材內(nèi)在質(zhì)量聯(lián)系研究,以完善山楂葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。