張 華,鄭 露,2,劉 歡,周奕敏,涂 星*

1.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部(湖北 恩施 445000) 2.武漢鋼鐵(集團(tuán))公司第二職工醫(yī)院康復(fù)科(湖北 武漢 430085)

銀屑病(psoriasis,PS)是一種病程較長(zhǎng),易反復(fù)發(fā)作,以紅斑、鱗屑等為主要臨床表現(xiàn)的慢性免疫介導(dǎo)型皮膚病,其主要癥狀為瘙癢和疼痛,常夜間加重,嚴(yán)重影響患者的睡眠質(zhì)量,從而給患者的身心健康和日常生活帶來(lái)極大影響[1-3]。促炎性細(xì)胞因子是血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放的可以激活炎癥反應(yīng)的因子,如干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-23(IL-23)、白介素-17(IL-17)等,它們?cè)诩?xì)胞毒和局部炎癥相關(guān)免疫應(yīng)答過(guò)程中起主要介導(dǎo)參與作用,能引起細(xì)胞免疫和遲發(fā)型超敏性炎癥,是PS發(fā)生的重要因素[4]。

古代醫(yī)家早期針對(duì)PS的致病因素和發(fā)病機(jī)制多從“外感風(fēng)寒濕熱等邪氣所致”來(lái)認(rèn)識(shí),進(jìn)一步發(fā)展成“臟腑病變、氣血失調(diào)等內(nèi)在病理機(jī)制與外感諸邪氣合而致病”,整體上緊密圍繞“血”與“風(fēng)”兩大特點(diǎn),如《醫(yī)宗金鑒》有云:“固有風(fēng)邪客肌膚,亦有血燥難榮外”。近現(xiàn)代醫(yī)家根據(jù)長(zhǎng)期科學(xué)研究以及豐富的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),對(duì)PS病因病機(jī)有了進(jìn)一步的深化拓展,其中“血分論治”P(pán)S最為常見(jiàn),然而PS作為一個(gè)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的頑固性皮膚病,其中醫(yī)的辨證論治并非一成不變,需要結(jié)合患者具體病情辨證施治。針對(duì)部分患者由于體質(zhì)差異、病情階段、藥食影響等因素從血分論治效果不佳的情況,部分醫(yī)家提出以臟腑辨證為核心。如艾儒棣教授從脾胃論治,認(rèn)為其病機(jī)是脾虛為本,濕毒為標(biāo)[5]。在古今醫(yī)家理論研究基礎(chǔ)上,結(jié)合當(dāng)今社會(huì)生活節(jié)奏的加快、現(xiàn)代人飲食結(jié)構(gòu)改變以及心理壓力等不良情緒增加等因素,本研究提出“肝郁脾虛”所引起的腸燥、腸虛、濕熱蘊(yùn)藏等可能是PS發(fā)生的主要病機(jī)之一,而對(duì)于其治療,可相應(yīng)采取疏肝健脾法以治其本,潤(rùn)腸通便、補(bǔ)虛潤(rùn)腸、清熱解毒等以治其標(biāo);通過(guò)探究疏肝健脾益腸方對(duì)調(diào)節(jié)肝郁脾虛型PS小鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-23和IL-17水平變化,研究疏肝健脾益腸方對(duì)PS小鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40只雄性無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)昆明小鼠(kunming mice,KM小鼠),5～7周齡,體質(zhì)量18～22g,購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(遼)2020-0001,質(zhì)量合格證編號(hào):NO.210726210101125034。湖北民族大學(xué)武陵山中藥材檢驗(yàn)檢測(cè)中心,實(shí)驗(yàn)室提供清潔級(jí)動(dòng)物房,溫度20±2℃,相對(duì)濕度50%～70%。

1.2動(dòng)物分組將KM小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后稱重,采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只小鼠分為正常組、模型組、疏肝健脾益腸方高、中、低劑量組5組,每組8只。

1.3實(shí)驗(yàn)藥品與試劑凡士林軟膏(南昌白云藥業(yè)有限公司,贛食藥準(zhǔn)字F20050006);咪喹莫特乳膏(四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20030129);脫毛膏[利潔時(shí)家化(中國(guó))有限公司,國(guó)妝特字G20161330];冰醋酸(分析純,天津市福晨化學(xué)試劑廠,批號(hào)20160220);4%多聚甲醛(Biosharp Life sciences,批號(hào)1807231);二甲苯(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20180607);石蠟(Leica Biosystems,批號(hào)1805139);蘇木素-伊紅(蘇州澤科生物技術(shù)有限公司,批號(hào)ZKP-E15006-1);ELISA試劑盒(武漢博士德有限公司);PBS(北京普利萊基因技術(shù)有限公司);其他試劑均為分析純。

疏肝健脾益腸方煎液:由柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)(麩炒)、茯苓、防風(fēng)、砂仁、木香、甘草(蜜炙)、黨參、黃芪、生地黃、蟬蛻、地膚子組成,均購(gòu)于湖北強(qiáng)康中藥飲片有限公司,生藥140g。首次煎熬1.5h,加1100mL水,第二次煎熬0.5h加420mL,將兩次煎液混合,濾過(guò)后,經(jīng)減壓濃縮,最終濃縮至含有生藥2.8g/mL的藥液。

1.4主要實(shí)驗(yàn)儀器XSR105/AC電子分析天平(梅特勒公司),Mili-Q Direct-Q5UV超純水機(jī)(美國(guó)密理博公司),KQ500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);S1200 Smartpipette型全自動(dòng)移液器(量程50～1200μL,Ronlabs公司),制冰機(jī)(上?；蕛x器有限公司);TC-120型智能程控生物組織自動(dòng)脫水機(jī)(泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司);TB-718E型生物組織自動(dòng)包埋機(jī)(泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司);R139型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司);TK-218Ⅱ型攤片機(jī)(泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司);BX53型偏光顯微鏡(奧林巴斯);5810R高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司);酶標(biāo)定量測(cè)定儀(Thermo Scientific公司);海爾立式超低溫冰箱等。

1.5肝郁脾虛型PS小鼠模型的建立與評(píng)價(jià)根據(jù)文獻(xiàn)[6]采用5%咪喹莫特乳膏涂抹誘導(dǎo)PS。正常組小鼠每日口服蒸餾水,模型組及疏肝健脾益腸方組小鼠每日口服醋酸(0.03mol/L冰醋酸),同時(shí)使用膠帶進(jìn)行束縛應(yīng)激操作;7d后,用脫毛膏在各組小鼠背部脫毛,暴露2cm×2cm的無(wú)毛區(qū),脫毛后正常組小鼠每日繼續(xù)口服蒸餾水,并配合背部無(wú)毛區(qū)均勻涂抹凡士林軟膏62.5mg,1次/d,模型組及疏肝健脾益腸方組小鼠每日繼續(xù)醋酸口服刺激(0.03mol/L冰醋酸)及膠帶束縛應(yīng)激,同時(shí)背部涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5mg,1次/d,連續(xù)14d,共21d,進(jìn)行束縛應(yīng)激和口服醋酸刺激操作開(kāi)始,進(jìn)行小鼠中醫(yī)證候特征評(píng)價(jià),分值越低表明肝郁脾虛證候特征越明顯(表1)。自抹藥開(kāi)始,采用PASI評(píng)分[7]進(jìn)行評(píng)估,以小鼠背部皮膚出現(xiàn)紅斑、鱗屑、浸潤(rùn)改變表明PS造模成功。觀察指標(biāo)及評(píng)分細(xì)則見(jiàn)表2。

表1 小鼠的行為觀察指標(biāo)

表2 PASI評(píng)分

1.6實(shí)驗(yàn)動(dòng)物治療造模結(jié)束后,正常組、模型組各自用蒸餾水0.1mL/10g灌胃,疏肝健脾益腸方高、中、低劑量組則依次按照17.6、8.8、4.4mL/kg的劑量給予疏肝健脾益腸方煎液灌胃,1次/d,連用21d,小鼠給藥劑量根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》[8]中人與小鼠體表面積比例進(jìn)行換算。

1.7各組小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-23、IL-17含量末次給藥24h后,對(duì)各組小鼠進(jìn)行眼球取血,將血液放入抗凝管中,經(jīng)離心分離后,將上清液裝入-80℃冰箱中備用,采用ELISA法檢測(cè)IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-23、IL-17在血清中的含量,詳細(xì)操作參考ELISA試劑盒。

1.8皮膚組織病理切片觀察末次給藥24h后,采取頸椎脫臼法處死小鼠后取小鼠無(wú)毛區(qū)皮膚組織浸泡于4%多聚甲醛固定,脫水,用石蠟加以包埋,切片,使用常規(guī)HE染色,最后在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠皮膚組織的病理學(xué)特征。

2 結(jié)果

2.1肝郁脾虛型PS小鼠皮損的形態(tài)學(xué)變化造模前,觀察各組小鼠的皮膚損傷情況,其PASI評(píng)分都為0。由表3可知,除了正常組之外,使用5%咪喹莫特涂抹小鼠背部表皮后,會(huì)導(dǎo)致不同程度的紅斑、鱗屑和浸潤(rùn)等現(xiàn)象,小鼠PASI評(píng)分提高(P<0.05);疏肝健脾益腸組給藥后小鼠背部的紅斑、鱗屑、浸潤(rùn)等皮損情況好轉(zhuǎn),PASI評(píng)分下降,但同時(shí)模型組的小鼠皮損情況好轉(zhuǎn),考慮為小鼠的自愈性所致;小鼠PASI評(píng)分情況來(lái)看,無(wú)法判斷疏肝健脾益腸方的劑量是否與PS的治療有劑量依賴,見(jiàn)表3。

表3 疏肝健脾益腸方對(duì)各組小鼠皮膚PASI評(píng)分的影響分)

2.2皮損組織病理變化正常組小鼠皮膚結(jié)構(gòu)完好,表皮和真皮分界清晰,角質(zhì)層較薄,顆粒層清晰;模型組小鼠表皮顯著增厚,可見(jiàn)不同程度的角質(zhì)層增生伴有角化不完全,表皮突起明顯下延,棘層增厚,顆粒層變薄;高、中、低劑量組小鼠皮膚病理變化和模型組類似,但是表皮增厚、角化不全、棘層增厚、顆粒層變薄等都比模型組要輕,特別是高劑量組的皮膚病理改善最為顯著,見(jiàn)圖1。

A:正常組;B:模型組;C:高劑量組;D:中劑量組;E:低劑量組。圖1 小鼠皮膚組織病理切片圖(HE,×200)

2.3血清中IFN-γ、TNF-α、IL-23、IL-17含量的變化與正常組比較,PS模型小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-23及IL-17的含量均顯著上升(P<0.05);與模型組相比,疏肝健脾益腸方高、中、低劑量組小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-23及IL-17含量均顯著下降(P<0.05);與疏肝健脾益腸方高劑量組相比,中、低劑量組IFN-γ的含量明顯升高,且中劑量組降低IFN-γ的含量較低劑量組更為顯著(P<0.05);與疏肝健脾益腸方低劑量組相比,高、中劑量組的IL-23及IL-17含量下降效果優(yōu)于低劑量組(P<0.05),見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-23、IL-17檢測(cè)結(jié)果的影響

3 討論

PS是一種典型的皮膚病癥,其特點(diǎn)是過(guò)度增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞,這些細(xì)胞是在表皮占比最多的細(xì)胞類型,可以感知病原體并介導(dǎo)免疫反應(yīng),在皮膚暴露于抗原后,角質(zhì)形成細(xì)胞中炎癥小體復(fù)合物中所含的細(xì)胞內(nèi)傳感器被激活,促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生,進(jìn)而活化免疫細(xì)胞,從而誘導(dǎo)和維持炎癥反應(yīng)[9]。目前已知,TNF-α、IFN-γ和IL-23/Th17細(xì)胞等相關(guān)的細(xì)胞因子和通路在PS發(fā)病機(jī)制中扮演著至關(guān)重要的角色[10]。TNF-α是一種擁有廣泛生物活性的細(xì)胞因子,它參與了人體的免疫反應(yīng),并能加速PS的炎癥反應(yīng)以及表皮細(xì)胞的增殖[11]。IFN-γ主要來(lái)源于T細(xì)胞和NK細(xì)胞,它參與并維持PS的炎性浸潤(rùn),是引起角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖的主要因素,并參與了T細(xì)胞向表皮的增殖[12]。Th17及與之有關(guān)的細(xì)胞因子在PS的發(fā)病中起著重要作用,在PS患者的血液中,Th17及它的下游效應(yīng)因子IL-17A、IL-17F和TNF-α等均有明顯升高[13]。IL-23能促進(jìn)Th17細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎性因子IL-17,IL-17能誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子(IL-6、TNF-α等)以及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá),導(dǎo)致炎性細(xì)胞的浸潤(rùn),促進(jìn)皮損的形成和發(fā)展,從而導(dǎo)致PS[14]。

在記載了中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的相關(guān)古代典籍中,關(guān)于PS病名,目前尚沒(méi)有具體的描述,因其“膚如疹疥,色白而癢,搔起白皮”,多稱其為“白疕”。而關(guān)于PS的病因病機(jī),部分醫(yī)家認(rèn)為“肝郁脾虛”是PS的主要病機(jī)之一,其發(fā)生可能與腸燥、腸虛、腸道濕熱等有關(guān)。肝和脾在生理上相互為用,在病理上相互影響。肝主藏血,其藏血功能失常可能導(dǎo)致氣血失和,肌膚失養(yǎng);肝主疏泄,情志所傷導(dǎo)致肝氣郁結(jié),日久肝郁化火橫逆犯胃,陰津受損,易致腸道干燥,故PS皮膚多干燥、瘙癢。脾為后天之本、氣血生化之源,脾主升清,盛津液,行水濕。肝氣郁結(jié)易致脾虛,脾虛易致小腸受盛化物能力下降,導(dǎo)致腸道虛弱,脾虛生痰,故臨床上患者皮損多見(jiàn)白色鱗屑肥厚等痰濕之象;痰濕郁久化熱,易致大腸濕熱,濕熱蘊(yùn)阻肌膚,郁滯氣血,故PS多表現(xiàn)紅斑癥狀。疏肝健脾益腸方對(duì)于PS,尤其是肝郁脾虛腸燥型有良好的療效,可緩解瘙癢、減輕患者的皮膚損傷程度,對(duì)于脾虛、腸燥、便秘等臨床癥狀有一定的改善作用。因此,采用疏肝健脾益腸方對(duì)PS加以治療,其療效是肯定的。

在本研究中,肝郁脾虛型PS模型小鼠血清中促炎性細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-23、IL-17的含量顯著增加(P<0.05),給予疏肝健脾益腸方后,血清中IFN-γ、TNF-α、IL-23及IL-17含量均顯著下降(P<0.05),表明疏肝健脾益腸方可以抑制血清中IFN-γ、TNF-α、IL-23及IL-17的表達(dá),并且可能與疏肝健脾益腸方的給藥濃度有關(guān)。病理結(jié)果顯示相同結(jié)果,表明疏肝健脾益腸方能夠有效地抑制PS角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度的增殖、分化及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),從而減輕皮膚的炎癥反應(yīng),進(jìn)而達(dá)到治療PS的目的。在未來(lái)的臨床研究中,將會(huì)不斷地探索疏肝健脾益腸方治療肝郁脾虛型PS的作用機(jī)制,以期為臨床提供安全、可靠、療效確切、經(jīng)濟(jì)的治療PS的藥物。