周亞妮,趙雪麗,趙永麗

(1.商洛學院健康管理學院,陜西 商洛 726000;2.商洛市康養(yǎng)產(chǎn)業(yè)工程技術研究中心,陜西 商洛 726000;3.商洛市中心醫(yī)院,陜西 商洛 726000)

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量降低、骨組織微結(jié)構(gòu)損壞為特征的臨床常見骨骼疾病。隨著人口老齡化日趨嚴重,骨質(zhì)疏松癥已成為我國面臨的重要公共健康問題。骨質(zhì)疏松癥分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類,原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥包括絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老年骨質(zhì)疏松癥和特發(fā)性骨質(zhì)疏松癥,其中絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率高達50%,可見絕經(jīng)后婦女是骨質(zhì)疏松癥的高風險人群[1]。淫羊藿屬于小檗科草本植物,是常用的治療骨質(zhì)疏松癥的中藥,淫羊藿苷是淫羊藿提取物的主要活性成分和指標性成分[2]。相關研究表明,淫羊藿苷既能抑制骨吸收,提升骨密度,又沒有雌激素的潛在不良反應[3-6],故被稱之為“植物雌激素”。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨髓來源的干細胞,具有分化為成骨細胞、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、成肌細胞等多種細胞的潛能,其中BMSCs成骨分化和成脂分化動態(tài)平衡是維持骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)、決定骨組織結(jié)構(gòu)的關鍵[7]。女性絕經(jīng)后雌激素水平降低,機體內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂,會加速BMSCs自噬、衰老,影響B(tài)MSCs成骨分化,并導致骨形成減少,引起骨質(zhì)疏松[8]。本研究通過探討淫羊藿苷誘導BMSCs向成骨細胞分化的機制,旨在為淫羊藿苷應用于女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的臨床治療提供動物實驗依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 8周齡SPF級健康雌性大鼠70只,體重180～220 g,購于西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心,動物許可證編號:SCXK(陜)2018-001。于商洛學院SPF級動物實驗室適應性喂養(yǎng)1周(溫度20～23 ℃,濕度50%～65%),自由飲水,自然光線晝夜交替。本實驗獲商洛學院實驗動物倫理委員會認證批準(商研論審函[2022]13號)。

1.2藥物、儀器與試劑 淫羊藿苷,成都新成醫(yī)藥科技有限公司,批號:110737-200715,純度>98%;青霉素,西安利君制藥有限責任公司,批號:B20190814,規(guī)格:80萬IU;17β-雌二醇,上海麥克林科技有限公司,批號:J20200316。倒置顯微鏡(Leica,美國);二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Thermo,美國),流式細胞儀(BD,美國);全自動酶標儀(南京普朗醫(yī)療設備有限公司);紫外可見分光光度計(西安光華玻璃儀器廠);TD-25 電子分析天平(天津志誠儀器有限公司);微量移液器(上海求精玻璃儀器廠);DMEM培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司);堿性磷酸酶(ALP)活性檢測試劑盒(批號:BC2162);大鼠骨鈣素(OCN)檢測試劑盒(批號:E30602)。其余儀器、試劑、分析純均由商洛學院醫(yī)學實驗中心提供。

1.3分組、造模及干預 適應性喂養(yǎng)7 d后,將70只大鼠隨機分為正常組、假手術組、骨質(zhì)疏松組、淫羊藿苷低濃度組、淫羊藿苷中濃度組、淫羊藿苷高濃度組、雌二醇組,每組10只。正常組不做任何造模實驗。其余組大鼠實驗前禁食過夜,參考文獻[9-10]相關造模方法,肌肉注射氯胺酮0.1 mL/100 g(藥物含量為100 g/2 mL)麻醉大鼠后,將大鼠俯臥位固定在自制的固定板上,局部備皮,碘伏消毒,從腹背部肋緣下1 cm與脊柱外側(cè)各2.0 cm交界處切開皮膚進入腹腔,游離脂肪層,用絲線結(jié)扎雙側(cè)卵巢根部下的輸卵管并摘除卵巢(假手術組只行切口切開,不摘除卵巢組織),逐層縫合關閉創(chuàng)口,碘伏消毒。術后肌肉注射80萬IU青霉素,劑量為0.1 mL/(只·d),連續(xù)6 d,每天定期碘伏消毒雙側(cè)切口,逐層縫合組織。術后經(jīng)陰道上皮角化細胞瑞氏染色法比較確定建模成功后,假手術組和骨質(zhì)疏松組給予10 mL/kg生理鹽水灌胃,淫羊藿苷低、中、高濃度組分別給予含淫羊藿苷0.4 g/100 mL、0.8 g/100 mL、1.2 g/100 mL的生理鹽水混懸液灌胃,雌二醇組給予含17β-雌二醇0.8 g/mL的生理鹽水混懸液灌胃,均1次/d,每天固定9:00—11:00灌胃,連續(xù)灌胃12周。

1.4BMSCs的培養(yǎng)及純化 采用頸椎脫臼法處死SD大鼠,置于75%乙醇中消毒10 min,無菌條件下取股骨、脛骨及肱骨,切除兩端干骺端,PBS清洗3次,暴露出骨髓腔,直至骨髓被全部沖出,用含雙抗的DMEM培養(yǎng)基反復吹打,制成單細胞懸液,1 000 r/min離心5 min,棄上清,重懸后接種于培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。首次24 h后更換培養(yǎng)基,隔天觀察細胞狀態(tài),以后每48 h更換培養(yǎng)基1次。采用全骨髓貼壁法[11-12]分離培養(yǎng)BMSCs,待原代細胞貼壁生長鋪滿瓶底,生長密度達90%左右時,觀察取狀態(tài)良好的細胞,按1∶2比例進行首次傳代培養(yǎng)進行純化,獲得第1代骨BMSCs,同樣方法獲得第2代、第3代BMSCs。

1.5BMSCs成骨誘導的細胞形態(tài)觀察及表面標志物鑒定 用倒置顯微鏡觀察第1代、第2代、第3代細胞的形態(tài)。選定第3代細胞,將細胞濃度調(diào)整為1×106/mL,分別加入anti-rat CD29、anti-rat CD11、anti-rat CD44、anti-rat CD45、anti-rat CD90以及anti-rat CD34,送商洛市國際醫(yī)學中心,流式細胞術檢測細胞表面抗原,每份樣本分析1×104個細胞,用軟件Flow Jo Ver.10計算陽性細胞百分比。鑒定后,留用第3代細胞,加入成骨分化誘導液(DMEM高糖培養(yǎng)基),每3 d更換1次誘導液,連續(xù)培養(yǎng)7 d后進行后續(xù)相關實驗。

1.6BMSCs生長曲線繪制 取生長良好的第3代細胞,用胰蛋白酶消化細胞后重懸于α-MEM培養(yǎng)液中制成細胞懸液,吹打均勻后進行計數(shù)。根據(jù)細胞計數(shù)的結(jié)果,取7個6孔板,每組細胞3個復孔,每孔細胞以3×104/mL的密度接種,加2 mL培養(yǎng)液。于1～7 d固定時間點取3孔,用2.5 g/L胰蛋白酶消化,終止消化后,1 000 r/min離心5 min,并重懸于培養(yǎng)液中,每孔分別計數(shù),取平均值。根據(jù)細胞計數(shù)的結(jié)果,以時間為橫軸、以細胞數(shù)為縱軸繪制生長曲線。

1.7BMSCs相關成骨標志物檢測 取培養(yǎng)7 d后的第3代細胞,用含2%牛血清白蛋白的PBS于4 ℃封閉30 min,將細胞濃度調(diào)整為 1×106/mL(100 μL細胞懸液),4 ℃、2 000 r/min離心20 min,參照相關試劑盒說明書,用比色法在波長540 nm檢測堿性磷酸酶 (ALP)活性和骨鈣素(OCN)水平。

1.8BMSCs中Runx-2蛋白表達量測定 采用Western blot法檢測:取培養(yǎng)7 d后的第3代細胞,提取各組細胞總蛋白,進行定量分析。經(jīng)電泳分離,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉室溫孵育2 h后,加入一抗工作液,置4 ℃過夜;TBS-T緩沖液洗膜5次,每次10 min,加入二抗工作液室溫孵育1 h,TBS-T洗膜5次,每次10 min,采用ECL法顯色。利用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析。

1.9BMSCs成骨誘導后礦化鈣結(jié)節(jié)形成情況 取培養(yǎng)7 d后的第3代細胞,棄去DMEM培養(yǎng)基,用PBS清洗3次,以40 g/L甲醛固定10 min,加0.1%茜素紅染液,37 ℃孵育1 h,常溫避光染色30 min,吸除染料,PBS再次沖洗3次,自來水沖洗并常溫干燥后,于顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)的形成情況。加入10%氯化十六烷基吡啶洗脫結(jié)合到鈣結(jié)節(jié)上的染料,使用酶標儀在波長540 nm處測定吸光度值。

1.10統(tǒng)計學方法 應用SPSS 18.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,計量資料呈正態(tài)分布,組間差異比較采用單因素方差分析法(One Way ANOVA),兩兩比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1BMSCs形態(tài) 倒置顯微鏡下觀察,培養(yǎng)2 d(第1代)可見少量透亮的多形性細胞,細胞核成長橢圓形,貼壁較少,凌亂生長;培養(yǎng)4 d(第2代)可見細胞拉長,梭形細胞增多,也可見不規(guī)則形細胞,貼壁生長較前明顯,細胞核變成卵圓形,聚集呈放射狀排列;培養(yǎng)7 d(第3代)可見大量長梭形細胞,少部分三角形或不規(guī)則形細胞緊密排列,細胞核為規(guī)則卵圓形,呈瀑布狀或者漩渦狀生長,可見細胞結(jié)節(jié)。見圖1。

圖1 第1代、第2代、第3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)(×100)

2.2BMSCs培養(yǎng)及抗體分子鑒定 流式細胞儀檢測第3代BMSCs細胞表面抗原,其中CD90陽性率為98.2%,CD44陽性率為93.3%,CD29陽性率為99.5%,CD34陽性率為2.6%,CD45 陽性率為1.7%,CD11陽性率為4.4%,前3個指標為陽性,后3個指標為陰性,可與造血干細胞相鑒別。見圖2。

圖2 培養(yǎng)第3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞鑒定結(jié)果

2.3各組大鼠BMSCs生長曲線 各組大鼠BMSCs在增長期都呈S形生長,1～3 d處于潛伏期,3～7 d為快速生長期,第6天到達最高峰;隨后逐漸進入平臺期。見圖3。

圖3 正常組、假手術組和骨質(zhì)疏松各組大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞生長曲線

2.4各組大鼠BMSCs成骨誘導后ALP活性和OCN水平比較 正常組與假手術組ALP活性和OCN水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05);骨質(zhì)疏松組ALP活性和OCN水平均明顯低于假手術組(P均<0.05);淫羊藿苷中、高濃度組和雌二醇組ALP活性和OCN水平均明顯高于骨質(zhì)疏松組(P均<0.05);淫羊藿苷中濃度組ALP活性和淫羊藿苷高濃度組OCN水平與雌二醇組最為接近,差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖4。

圖4 正常組、假手術組和骨質(zhì)疏松各組大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨誘導后ALP活性和OCN水平

2.5各組大鼠BMSCs成骨誘導后Runx-2蛋白表達情況比較 正常組與假手術組Runx-2蛋白相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05);骨質(zhì)疏松組Runx-2蛋白相對表達量明顯低于假手術組(P<0.05);淫羊藿苷中、高濃度組和雌二醇組Runx-2蛋白相對表達量均明顯高于骨質(zhì)疏松組(P均<0.05);淫羊藿苷中、高濃度組Runx-2蛋白相對表達量和雌二醇組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05),淫羊藿苷中濃度組與雌二醇組最為接近。見圖5。

圖5 正常組、假手術組和骨質(zhì)疏松各組大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨誘導后Runx-2蛋白表達情況

2.6各組大鼠BMSCs成骨誘導后礦化鈣結(jié)節(jié)形成情況及吸光度值比較 正常組和假手術組有鈣化結(jié)節(jié),較為均勻;骨質(zhì)疏松組沒有明顯的鈣化結(jié)節(jié),吸光度值明顯低于正常組和假手術組(P均<0.05);淫羊藿苷各濃度組與雌二醇組出現(xiàn)明顯的鈣化結(jié)節(jié)染色,吸光度值均明顯高于骨質(zhì)疏松組(P均<0.05),其中淫羊藿苷中濃度組鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量最多,但各藥物組間吸光度值比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖6和圖7。

圖6 正常組、假手術組和骨質(zhì)疏松各組大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨誘導后鈣結(jié)節(jié)形成情況(茜素紅染色,標尺為20 μm)

圖7 正常組、假手術組和骨質(zhì)疏松各組大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨誘導后鈣結(jié)節(jié)形成吸光度值(540 nm)

3 討 論

骨質(zhì)疏松癥是中老年人最常見的骨代謝性疾病,近年來其發(fā)病率呈逐年上升趨勢?，F(xiàn)代醫(yī)學認為,骨組織處于骨形成和骨吸收的動態(tài)平衡之中,而絕經(jīng)后婦女由于雌激素水平的驟然下降,導致該平衡不能維持是引起絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的主要原因[13]。大量臨床研究顯示,外源性雌激素能通過多途徑促進骨形成,可明顯減輕婦女絕經(jīng)期的癥狀和預防骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生,但同時也指出雌激素的使用會增加子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、高血凝狀態(tài)以及靜脈血栓栓塞等發(fā)病風險[14-15]。近年來,隨著中藥藥理學研究的深入和提取分離技術的進步,醫(yī)學界尋找雌激素天然替代物治療骨質(zhì)疏松癥成為了一種熱點。淫羊藿提取物淫羊藿苷具有良好的植物雌激素樣作用,實驗證實其可促進BMSCs的成骨性分化和抑制破骨細胞的骨吸收活性[16-17]。

BMSCs是來源于中胚層,具有多向分化潛能的干細胞,合適的條件下可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等,其是雌激素缺乏性骨質(zhì)疏松骨修復的主要來源[18]。本研究采用經(jīng)典去卵巢法建立大鼠骨質(zhì)疏松模型模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥,取BMSCs體外培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的BMSCs生長緩慢;淫羊藿苷不同濃度組中,中濃度淫羊藿苷促BMSCs增殖作用最強。

細胞ALP的活性和礦化結(jié)節(jié)形成是成骨細胞早期和中期成骨細胞分化的標志,也是BMSCs成骨分化的重要指征[19]。OCN由成骨細胞和軟骨細胞合成,控制著軟骨礦化的速度,在一定程度上可反映骨轉(zhuǎn)化和礦化結(jié)節(jié)的形成[19]。Runx-2蛋白表達是成骨細胞分化過程中起決定作用的轉(zhuǎn)錄因子,影響著間充質(zhì)干細胞等干細胞的成骨向分化[20]。本實驗結(jié)果顯示,去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠BMSCs細胞的ALP活性、OCN水平、Runx-2蛋白相對表達量均明顯降低,礦化結(jié)節(jié)形成較少;淫羊藿苷中、高濃度組ALP活性、OCN水平、Runx-2蛋白相對表達量均明顯高于骨質(zhì)疏松組,且出現(xiàn)明顯的鈣化結(jié)節(jié);其中淫羊藿苷中濃度組ALP活性、Runx-2蛋白相對表達量和淫羊藿苷高濃度組OCN水平更高,淫羊藿苷中濃度組鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量更多。說明中、高濃度的淫羊藿苷均可以通過調(diào)控Runx-2蛋白表達,促進BMSCs的成骨分化,促進骨生長,而且中濃度淫羊藿苷誘導 BMSCs成骨和上調(diào)Runx-2蛋白表達能力最強。本實驗中ALP活性、OCN水平、Runx-2蛋白表達情況與文獻[21-23]研究結(jié)果一致。

綜上所述,淫羊藿苷可通過上調(diào)ALP活性、OCN水平及Runx-2蛋白表達,促進骨礦化鈣化結(jié)節(jié)的生成,其中0.8 g/100 mL淫羊藿苷上調(diào)ALP活性以及Runx-2蛋白表達作用最明顯,而調(diào)節(jié)OCN水平和鈣化結(jié)節(jié)生成的作用與淫羊藿苷的濃度有依賴性關系,濃度越高作用越好。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。