莊麗華,柯 暉,陳 濤,張彥紅,徐 俊,韓永明

(湖北中醫(yī)藥大學(xué),湖北 武漢 430065)

缺血性腦卒中是指各種原因所致的腦部血液循環(huán)障礙導(dǎo)致的腦組織缺血、缺氧性壞死,進(jìn)而出現(xiàn)相應(yīng)神經(jīng)功能受損的疾病。腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞大量活化,介導(dǎo)炎性反應(yīng),從而引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致卒中后二次損傷,目前研究認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的炎性反應(yīng)是影響腦卒中進(jìn)展及預(yù)后的主要因素之一[1-3]。電針是起源于中國(guó)古代的一種治療方法,可用于包括腦卒中等疾患在內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療[4-6],可通過(guò)多種機(jī)制改善腦缺血損傷及其炎性反應(yīng)[7-10]。百會(huì)穴、太陽(yáng)穴是臨床治療缺血性腦卒中的重要頭部穴位,足三里穴、曲池穴是治療缺血性腦卒中的重要體部穴位。課題組前期實(shí)驗(yàn)研究表明,聯(lián)合電針上述穴位能抑制小鼠腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,降低血清炎性因子水平[11]。本實(shí)驗(yàn)觀察比較了電針不同穴位對(duì)小鼠腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎性因子的影響,旨在為電針選穴治療缺血性腦卒中提供更多依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)野生型健康成年雄性C57BL/6小鼠50只,體重20～25 g,購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室,飼養(yǎng)室溫度保持20～26 ℃,相對(duì)濕度40%～70%。所有實(shí)驗(yàn)和程序均提前申請(qǐng)通過(guò)湖北中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要儀器及試劑 小鼠MCAO線栓(1620-20-A4),北京西濃科技有限公司(beijing cinontech co.ltd);G6805-2型低頻電子脈沖治療儀,上海醫(yī)用電子儀器廠;規(guī)格為0.25 mm×25 mm的華佗牌針灸針,中國(guó)蘇州醫(yī)療用品廠有限公司;Magnetom skyra3.0T磁共振儀,德國(guó)西門子公司;3.0T8通道橫向放置老鼠線圈,上海辰光醫(yī)療科技股份有限公司;小鼠C反應(yīng)蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒,賽默飛世爾科技公司;伊紅和蘇木素,美國(guó)Sigma公司;抗IBA1抗體,美國(guó)abcam公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將小鼠按照體重分層隨機(jī)法分為假手術(shù)組、模型組、頭電針組、體電針組、頭體電針組,每組10只。術(shù)前所有小鼠嚴(yán)格禁食12 h,自由飲水,采用1%戊巴比妥鈉35～40 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠,仰臥位固定,采用眼科剪剪開頸部正中皮膚1.0～1.5 cm,用眼科鑷頓性分離皮下組織及腺體,暴露頸動(dòng)脈鞘,假手術(shù)組分離出頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈,不插線栓。模型組和各電針組小鼠采用改良的Longa線栓法[12]建立右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型:分離右側(cè)頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈,結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端及頸外動(dòng)脈;將直徑(0.14±0.02)mm線栓放入27G注射器針頭(外徑0.4 mm、針長(zhǎng)13 mm),將針頭從頸總動(dòng)脈插入,從針頭尾部推入線栓,鑷子夾住頸總動(dòng)脈及其內(nèi)線栓,退出針頭后繼續(xù)將線栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈,遇到阻力時(shí)停止,這時(shí)線栓頭端距離頸總動(dòng)脈分叉約1 cm,大腦中動(dòng)脈起始處剛好被堵住。減掉線栓多余部分并進(jìn)行固定,消毒切口并縫合。術(shù)后單籠飼養(yǎng),維持小鼠直腸溫度在(37.0±0.5)℃,記錄每只小鼠神經(jīng)功能得分(Longa’s 5分法,0分:無(wú)明顯神經(jīng)功能缺損癥狀;1分:垂直提尾時(shí)不能伸展對(duì)側(cè)前爪;2分:行走時(shí)向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:行走時(shí)身體向偏癱側(cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走,意識(shí)喪失;5分:死亡)。實(shí)驗(yàn)納入評(píng)分為1～3分小鼠,剔除0分、4分、5分小鼠。若有小鼠在觀察時(shí)間點(diǎn)前死亡或樣本(血清)未取出,則隨機(jī)補(bǔ)充同廠家相似體重的小鼠,以保證各組動(dòng)物的樣本數(shù)量。小鼠完全蘇醒生命體征平穩(wěn)后開始按組別行電針治療,參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用穴位名稱與定位第3部分:小鼠》[13],頭電針組取百會(huì)穴(小鼠頭頂右側(cè)兩耳根連線與前后中線交點(diǎn)處)+患側(cè)太陽(yáng)穴(小鼠外眼角與耳之間的凹陷即顳窩中),體電針組取患側(cè)足三里穴(后三里穴,小鼠膝關(guān)節(jié)外側(cè)腓骨小頭下3 mm處)+患側(cè)曲池穴(小鼠橈骨近端肘關(guān)節(jié)外側(cè)前方的凹陷處),頭體電針組取百會(huì)穴+患側(cè)太陽(yáng)穴+患側(cè)曲池穴+患側(cè)足三里穴。操作方法:將小鼠俯臥位固定于特制固定器上,常規(guī)消毒,以毫針直刺各穴位,下針深度約3 mm,進(jìn)針后連接低頻脈沖治療儀,選擇低頻疏密波,電針治療頻率為2/20 Hz,每3 s交替1次,每次刺激30 min,每12 h針刺1次,至造模后72 h,針刺強(qiáng)度以小鼠耳郭或針柄輕微顫動(dòng)為度。模型組和假手術(shù)組每日在各電針組干預(yù)的同時(shí)行抓取刺激。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1神經(jīng)功能評(píng)分 記錄各組小鼠完全蘇醒后及術(shù)后72 h的Longa’s 5分法神經(jīng)功能評(píng)分。

1.4.2腦水腫總體積百分比 采用1%戊巴比妥鈉(35～40 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠后,俯臥位行磁共振掃描,在T2WI每個(gè)層面圖像上畫出高信號(hào)區(qū)域及整個(gè)層面的范圍,讀出水腫區(qū)域像素點(diǎn)數(shù)(S1-Sn)以及每個(gè)層面總像素點(diǎn)(S1總-Sn總),小鼠腦水腫總體積百分比=水腫體積/總體積=(S1+S2…+Sn)×T/[(S1總+S2總…+Sn總)×T],T為層厚(1 mm)。

1.4.3血清CRP、TNF-α及IL-1β水平 各組小鼠在術(shù)后72 h即刻摘眼球取血,靜置30 min后,以3 000 r/min(離心半徑10 cm)離心15～20 min,取上層血清,采用ELISA法測(cè)定血清CRP、IL-1β及TNF-α水平。

1.4.4腦組織病理形態(tài) 取血后立刻脫頸處死小鼠,取出完整腦組織,采用4%多聚甲醛固定24 h后進(jìn)行HE染色和IBA1免疫組化染色。掃描全部玻片信息,在HE染色圖片上觀察神經(jīng)元壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況;在免疫組化染色圖上觀察小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況,并計(jì)算活化小膠質(zhì)細(xì)胞百分比,計(jì)算方法:在病變側(cè)梗死中心取4個(gè)不重復(fù)的視野(400倍),統(tǒng)計(jì)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目和總小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目,將兩者比值作為該圖活化小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目百分比,每只小鼠4個(gè)視野百分比均值為該小鼠活化小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目百分比。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。神經(jīng)功能評(píng)分采用眾數(shù)進(jìn)行描述,組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis 檢驗(yàn))。水腫總體積百分比、活化小膠質(zhì)細(xì)胞百分比、血清炎性因子水平數(shù)據(jù)若不符合正態(tài)分布,則采用非參數(shù)檢驗(yàn);若符合正態(tài)分布、方差齊性,則采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法);若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布、方差不齊,則采用Dunnett’sT2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較 假手術(shù)組小鼠均無(wú)明顯神經(jīng)功能缺損癥狀,評(píng)分均為0分;各造模組小鼠在造模后和術(shù)后72 h均有不同程度的神經(jīng)功能缺損,模型組、頭電針組、體電針組、頭體電針組小鼠術(shù)后神經(jīng)功能評(píng)分眾數(shù)分別為3,3,3,2分,術(shù)后72 h神經(jīng)功能評(píng)分分別為3,2,3,2分。

2.2各組小鼠腦水腫總體積百分比比較 假手術(shù)組小鼠T2WI圖像無(wú)明顯水腫信號(hào)改變,腦水腫總體積百分比為0;各造模組小鼠T2WI圖像右側(cè)腦組織出現(xiàn)不同范圍高信號(hào)區(qū)域,模型組、頭電針組、體電針組、頭體電針組的腦水腫總體積百分比分別為(29.441±3.907)%、(28.025±3.006)%、(29.149±3.228)%、(26.624±2.918)%。頭電針組、體電針組、頭體電針組腦水腫總體積百分比較模型組略降低,但各組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖1。

圖1 假手術(shù)組和腦缺血各組小鼠右側(cè)腦組織T2WI圖像

2.3各組小鼠血清hs-CRP、TNF-α和IL-1β水平比較 模型組血清hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05);頭體電針組血清hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平均明顯低于模型組(P<0.05),且頭體電針組血清TNF-α水平均明顯低于頭電針組和體電針組(P均<0.05)。見表1。

表1 假手術(shù)組和腦缺血各組小鼠血清hs-CRP、TNF-α和IL-1β水平比較

2.4各組小鼠腦組織HE染色形態(tài) 假手術(shù)組小鼠兩側(cè)腦組織結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞排列整齊,細(xì)胞間隙致密,未見明顯壞死,僅見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組小鼠右側(cè)腦組織可見片狀細(xì)胞壞死,細(xì)胞排列紊亂,皮質(zhì)及海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目減少,細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯,可見較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn),部分小鼠左側(cè)腦組織可見輕度水腫。與模型組相比,頭電針組及體電針組神經(jīng)元細(xì)胞壞死及間質(zhì)水腫程度略有減輕,仍存在較大面積細(xì)胞排列紊亂及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域;頭體電針組小鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞壞死程度及間質(zhì)水腫程度明顯減輕,少數(shù)區(qū)域可見細(xì)胞排列紊亂,呈局灶性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖2。

圖2 假手術(shù)組和腦缺血各組小鼠腦組織HE染色表現(xiàn)

2.5各組小鼠腦組織 IBA1免疫組化染色表現(xiàn)假手術(shù)組可見極少量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和大量未活化的呈分支狀的小膠質(zhì)細(xì)胞;模型組和各電針組可見大量活化的阿米巴樣且形態(tài)不一的小膠質(zhì)細(xì)胞。假手術(shù)組、模型組、頭電針組、體電針組、頭體電針組小鼠活化小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目百分比分別為(13.05±3.94)%,(50.90±5.43)%,(46.35±6.57)%,(46.85±6.17)%,(43.60±3.98)%。頭體電針組活化小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目百分比明顯少于模型組(P<0.05),頭電針組和體電針組活化小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目百分比與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖3。

圖3 假手術(shù)組和腦缺血各組小鼠腦組織 IBA1免疫組化染色小膠質(zhì)細(xì)胞分布情況

3 討 論

缺血性腦卒中是有許多因素共同參與的極為復(fù)雜的病理過(guò)程。在缺血性腦卒中患者神經(jīng)損害過(guò)程中,缺血后炎性反應(yīng)起著關(guān)鍵作用,其中腦組織缺血后的炎性反應(yīng)是由級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的氧自由基和其他介質(zhì)所致的致炎物質(zhì)產(chǎn)生的結(jié)果,CRP、TNF-α、IL-1β等炎性因子大量釋放,參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)[14]。腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞及血液來(lái)源的單核巨噬細(xì)胞在卒中后炎性反應(yīng)中扮演著重要角色[15]。卒中發(fā)生后,腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞迅速大量活化,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞通常被作為神經(jīng)炎癥的標(biāo)志[16]。

電針是治療腦卒中的常用方法,治療選穴中百會(huì)穴、太陽(yáng)穴、足三里、曲池穴應(yīng)用頻率較高。百會(huì)穴屬督脈,是陽(yáng)氣匯集之所,可提神醒腦、回陽(yáng)固脫、平肝熄風(fēng)、凝神安心、調(diào)理中氣等,太陽(yáng)穴可止痛醒腦、振奮精神、解除疲勞、明目;足三里是足陽(yáng)明胃經(jīng)的主要穴位之一,具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、調(diào)理脾胃、補(bǔ)中益氣、通經(jīng)活絡(luò)、疏風(fēng)化濕、扶正祛邪的作用;曲池穴屬于手陽(yáng)明大腸經(jīng)之合穴,有清熱解表、疏經(jīng)通絡(luò)的作用。刺激以上穴位能達(dá)到止痛、提神醒腦、通經(jīng)活絡(luò)的目的。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,頭電針組、體電針組、頭體電針組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦水腫總體積百分比與模型組比較均無(wú)明顯差異,分析與本實(shí)驗(yàn)中小鼠造模后腦梗死面積均較大、電針刺激觀察時(shí)間較短(本實(shí)驗(yàn)僅做了術(shù)后72 h各指標(biāo)檢測(cè))、樣本量有限有關(guān)。病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),頭電針組及頭體電針組神經(jīng)元細(xì)胞壞死、間質(zhì)水腫、細(xì)胞排列紊亂、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病變程度較體電針組輕,且頭體電針組梗死周圍活化小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目百分比較模型組少,提示頭體電針能通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活化,從而減輕腦缺血后腦組織水腫。頭體電針組血清hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平均明顯低于模型組,且血清TNF-α水平明顯低于頭電針組和體電針組,說(shuō)明頭體電針能明顯降低腦缺血后血清hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平,尤其是降低TNF-α作用更明顯。

綜上所述,頭部與體部電針結(jié)合能通過(guò)抑制缺血性腦損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,減少血清炎性因子CRP、TNF-α、IL-1β的釋放,尤其是TNF-α的釋放,從而減輕炎癥反應(yīng)損傷,保護(hù)腦組織及神經(jīng)元,為臨床聯(lián)合應(yīng)用頭體電針治療腦卒中及其并發(fā)癥提供了一定的理論依據(jù)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。