高 沖， 周 全， 楊 帆， 任瑞鵬， 呂永康

（太原理工大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院, 省部共建煤基能源清潔高效利用國家重點實驗室, 太原 030024）

靜電紡絲技術(shù)能夠在靜電場作用下將高分子溶液拉絲制成納米纖維膜［1］， 因其可以環(huán)保、 高效、安全地制備納米材料而備受關(guān)注［2，3］. 靜電紡絲納米纖維由于具有大的比表面積和可調(diào)節(jié)的纖維直徑及孔隙率等特性［4，5］而被廣泛研究并應(yīng)用于藥物輸送［6］、 組織工程［7］、 生物敷料［8］、 固定化酶［9］、 生物傳感器［10］和固態(tài)電解質(zhì)［11］等領(lǐng)域.

電紡納米纖維是封裝蛋白質(zhì)和酶等生物活性分子的絕佳載體， 由于可選擇生物相容性高分子和紡絲成膜后方便分離回收的優(yōu)點， 在固定化酶領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景［12，13］. 目前的研究一般是在納米纖維外表面固定一層生物活性分子， 制備成核殼結(jié)構(gòu)的固定化載體［14～17］， 而較少將其固定于納米纖維內(nèi)部的微納結(jié)構(gòu)中［18］. 區(qū)室化和微囊泡是在活細胞中發(fā)現(xiàn)的細胞器的基本特征， 如線粒體、 葉綠體和高爾基體等， 作為參與級聯(lián)生化反應(yīng)的多酶載體， 其確保了生理活動不受外部不良環(huán)境的影響［19］. 多年來， 研究者一直致力于用人工合成的類似物來模擬細胞中細胞器的區(qū)室化和微囊泡結(jié)構(gòu)［20～23］. 通過脂質(zhì)體、 水凝膠/納米纖維包埋或高分子微膠囊來封裝生物酶［24～26］， 模擬細胞器的微環(huán)境， 從而提高酶促反應(yīng)的效率和選擇性［27～29］.

通過乳液進行靜電紡絲能夠?qū)⒂H水性生物活性分子封裝在高分子納米纖維內(nèi)部， 并保持這些分子的結(jié)構(gòu)性能和生物活性［3，30，31］. 乳液的制備方法對于材料中形成微囊泡結(jié)構(gòu)至關(guān)重要. 乳液由兩個或多個不相溶的溶液相組成， 分為連續(xù)相和分散相［32］. 根據(jù)定義， 油溶性疏水相通常被描述為油相， 另一相為水相； 如果水相分別為連續(xù)相或分散相， 則被描述為水包油（O/W）或油包水（W/O）乳液. 為了防止O/W 或W/O 乳液中發(fā)生相分離， 一般需要使用乳化劑， 通常有表面活性劑［如十二烷基硫酸鈉（SDS）、 聚山梨酯（Tween）和脂肪酸山梨坦（Span）］、 無機納米顆粒（如碳酸鈣、 二氧化硅）和生物大分子（如多糖類的明膠、 海藻酸， 蛋白質(zhì)類的大豆蛋白、 乳清蛋白）等［33］. 添加適當(dāng)且足量的乳化劑能夠有效穩(wěn)定乳液， 使兩相混合形成有利于納米纖維包封的微納結(jié)構(gòu)［34］. 此外， 隨著可再生新材料的開發(fā)，生物相容性高分子聚合物［如聚乙烯醇（PVA）、 聚環(huán)氧乙烷（PEO）和聚己內(nèi)酯（PCL）等］也被用于進行乳液靜電紡絲［35］. 但通過乳液形成的微囊泡結(jié)構(gòu)在靜電紡絲過程中受電場力的作用會發(fā)生破乳現(xiàn)象，囊泡之間相互融合并沿纖維軸向拉伸， 最終形成中空/核殼結(jié)構(gòu)的納米纖維， 達不到模擬細胞器微納結(jié)構(gòu)的效果.

本文選擇在PCL 溶液中添加兩親性三嵌段共聚物泊洛沙姆Pluronic?F108（PEO-PPO-PEO）作為乳化劑， 探索了通過超聲和水相添加劑等方法形成長時間穩(wěn)定的載酶W/O乳液的條件， 同時通過控制紡絲條件， 解決了常規(guī)乳液紡絲過程中產(chǎn)生的破乳問題， 最終制備出微囊型PCL納米纖維膜作為固定化酶的載體（Scheme 1）， 通過熒光標(biāo)記的牛血清白蛋白（BSA）驗證了蛋白被有效封裝在納米纖維內(nèi)部的微囊泡結(jié)構(gòu)中， 并研究了其在緩沖液中的釋放行為， 為構(gòu)建高效仿生的載酶納米材料提供了思路.

Scheme 1 Microcapsular structure of nanofibers for protein encapsulation by emulsion electrospinning

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

聚己內(nèi)酯（PCL，Mw=100000）， 廣東華創(chuàng)塑化有限公司； 泊洛沙姆Pluronic?F108（Mn=14600）和二甲基亞砜（DMSO， 分析純）， 上海阿拉丁生化技術(shù)有限公司； 二氯甲烷（DCM， 分析純）、 多巴胺鹽酸鹽（DA）、 甘油（Gly， 純度≥99%）、 牛血清蛋白（BSA）、 Bradford 試劑盒和異硫氰酸羅丹明B 熒光素（RBITC）， 上海麥克林生化科技有限公司.

JY92-IIN 型超聲波細胞破碎儀， 寧波新芝生物科技股份有限公司， 設(shè)備最大功率為650 W； MX-S型臺式混勻儀， 北京大龍興創(chuàng)實驗儀器股份公司； 752型紫外-可見分光光度計（UV-Vis）， 上海頻譜儀器有限公司； JY-82型接觸角測量儀， 承德鼎盛試驗機檢測設(shè)備有限公司； AutoPoreV 9620型高性能全自動壓汞儀， 美國Micromeritics 公司； TCS SP8 型激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）， 德國Leica 公司；Gemini 300型掃描電子顯微鏡（SEM）， 德國Zeiss公司； Nova 4000e型全自動比表面積及孔隙度分析儀，美國Quantachrome公司； 5944型電子萬能材料試驗機， 美國Instron公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 穩(wěn)定W/O 乳液的制備 將一定量PCL 溶于二氯甲烷中并攪拌4 h， 配制成10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的紡絲液， 分別加入10%， 20%和30%（相對于聚合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的F108， 待其溶解后再分別加入10%，20%和30%（相對于二氯甲烷的體積分?jǐn)?shù)）的水， 在冰浴中進行超聲處理， 設(shè)置超聲波細胞破碎機功率分別為260， 325， 390， 455 W， 每超聲5 s 后， 空5 s（占空比1∶1）， 超聲總時間分別為30， 60， 90 和120 s， 形成穩(wěn)定的W/O乳液并靜置觀察. 另外在水相中添加20%（體積分?jǐn)?shù)）甘油（Gly）、 2 mg/mL多巴胺鹽酸鹽（DA）和20%（體積分?jǐn)?shù)）Gly+2 mg/mL DA分別測試乳液的穩(wěn)定性.

1.2.2 靜電紡絲液的配制和納米纖維膜的制備 靜電紡絲液為10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）PCL中添加30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的F108和10%（體積分?jǐn)?shù)）的水相， 在超聲功率為390 W時超聲90 s形成的乳液. 水相分別為添加與未添加20%（體積分?jǐn)?shù)）Gly+2 mg/mL DA的高純水. 分別將紡絲液裝入20 mL注射器中， 針頭內(nèi)徑為0.51 mm， 輥軸接收器與針頭距離為15 cm， 轉(zhuǎn)速為100～500 r/min， 設(shè)置流速為0.8～1.5 mL/h， 調(diào)節(jié)電壓至 10～15 kV， 在室溫（30 ℃）， 濕度40%環(huán)境下紡絲5 h后， 收集納米纖維膜. 另外， 在相同實驗條件下用平板接收器收集纖維膜.

1.2.3 BSA 的熒光標(biāo)記和蛋白的定位分布 將50 mg BSA 溶于10 mL 0.1 mol/L pH=7.4 的磷酸鹽緩沖液中. 將10 mg異硫氰酸羅丹明B溶于1 mL DMSO中， 取400 μL該溶液用0.5 mol/L pH=9的碳酸鹽緩沖溶液稀釋至1 mL， 然后逐滴滴加到BSA溶液中， 冰浴條件下攪拌4 h. 反應(yīng)完成后， 以4000 r/min的速度離心10 min， 用PD-10/G-25柱子脫鹽， 于4 ℃保存. 將熒光標(biāo)記和未標(biāo)記的BSA 進行聚丙酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）， 然后在紫外燈下照射觀察BSA的熒光標(biāo)記情況.

將乳液中的BSA用相同數(shù)量的熒光標(biāo)記的BSA代替， 即在水相中添加熒光標(biāo)記的20 mg/mL BSA+20%（體積分?jǐn)?shù)）Gly+2 mg/mL DA 作為紡絲液， 在1.2.2節(jié)中的靜電紡絲條件下進行紡絲， 收集的膜用CLSM觀察熒光分布.

1.2.4 載BSA 納米纖維中蛋白的釋放實驗 水相為添加與未添加20%（體積分?jǐn)?shù)）Gly+2 mg/mL DA 的含有20 mg/mL BSA的溶液， 按照1.2.2節(jié)中的紡絲條件制備納米纖維膜. 將載BSA的納米纖維膜浸泡在pH=7.4 的Tris-HCl 緩沖液中， 放置在30 ℃、 轉(zhuǎn)速100 r/min 的搖床內(nèi). 分別在0， 10， 20， 30 min 和1， 2， 4 h各取3 mL蛋白釋放液， 采用考馬斯亮藍法測蛋白濃度， 通過紫外-可見分光光度計在595 nm波長處測定溶液的吸光度（A595）， 根據(jù)BSA蛋白標(biāo)線（圖S1， 見本文支持信息）計算溶液中蛋白濃度， 繪制出蛋白釋放曲線.

溶液中BSA蛋白濃度（c， μg/mL）按BSA標(biāo)線進行計算：

式中：C（μg/mL）為緩沖液中蛋白濃度； 相關(guān)系數(shù)R2=0.998.

蛋白釋放率（Release rate， %）按下式計算：

式中：V（mL）為緩沖液體積；m（μg）為樣品膜中理論蛋白質(zhì)量（膜中理論蛋白質(zhì)量=紡絲液中添加的蛋白總質(zhì)量/紡絲后膜的總質(zhì)量×樣品膜的質(zhì)量）.

1.3 測試與表征

1.3.1 乳液的形貌結(jié)構(gòu)表征 將乳液在液氮中冷凍5～10 min， 然后冷凍干燥4 h， 形成固體. 將該固體剪碎， 用導(dǎo)電膠將碎末粘貼在樣品臺上， 待纖維膜表面噴金處理后， 利用掃描電子顯微鏡觀察其形貌. 利用ImageJ軟件測量獲得孔徑分布圖. 為了進一步驗證乳液囊泡直徑大小， 將處理后的乳液進行氮氣吸附-脫附實驗， 采用BET法和壓汞法獲得冷凍干燥后乳液的孔體積和孔徑數(shù)據(jù).

1.3.2 納米纖維的形貌結(jié)構(gòu)表征 用導(dǎo)電膠將納米纖維膜裁剪成小塊的待測樣品， 粘貼在樣品臺上，待纖維膜表面噴金處理后， 利用掃描電子顯微鏡觀察其形貌. 利用ImageJ軟件測量獲得纖維的平均直徑和直徑分布圖. 將納米纖維膜剪碎， 真空干燥24 h， 使用BET 法和壓汞法獲得比表面積、 孔體積和孔徑等數(shù)據(jù).

1.3.3 納米纖維膜的親水性測試 將纖維膜剪成2 cm×2 cm大小， 采用接觸角測量儀拍攝記錄水滴與纖維膜的接觸角.

1.3.4 納米纖維膜的力學(xué)性能測試 將纖維膜裁剪成80 mm×20 mm 的樣條， 在纖維膜上隨意取3 個點， 用厚度儀測定其厚度， 取平均值， 即為纖維膜厚度. 將納米纖維膜置于抗拉強度測量儀上， 在室溫下進行拉伸實驗.

2 結(jié)果與討論

2.1 穩(wěn)定W/O乳液的形成條件

2.1.1 乳化設(shè)備選擇 不同的乳化設(shè)備由于作用方式和設(shè)備功率的影響， 對乳液中的液滴大小分布和乳液的穩(wěn)定性都會有明顯的影響. 實驗中對比了臺式混勻儀和超聲波細胞破碎儀對乳液形成的影響.混勻儀采用被動傳遞振動的方式進行乳化， 需要用手將裝有乳液的試管緊緊壓在震動盤上， 設(shè)備輸出功率為10 W， 以3000 r/min的頻率做圓周振蕩， 混勻5 min后取一部分乳液快速冷凍干燥后觀察形貌.由圖1（A）可見， 混勻儀形成的囊泡較稀疏且分布不勻， 統(tǒng)計分析囊泡的平均直徑為（7.557±2.176） μm［圖1（C）］， 并且形成的乳液靜置30 min后出現(xiàn)明顯的分層現(xiàn)象［圖S2（A）和（B）， 見本文支持信息］.

Fig.1 SEM images of emulsion after lyophilization(A, B) and statistical distribution of microcapsule diameter(C, D)

采用超聲波細胞破碎儀進行乳化， 將超聲探頭直接伸入乳液中進行超聲振蕩， 基于超聲波在液體中的空化效應(yīng)形成的高頻交變水壓強和剪切力達到乳化的效果. 設(shè)備總功率650 W， 以5 s為周期、 占空比1∶1進行間歇工作， 由于換能器直接傳遞能量效率高， 必須在冰水浴中進行超聲處理以保證乳液不會劇烈升溫. 超聲后形成的W/O乳液在靜置24 h后未觀察到分層現(xiàn)象［圖S2（C）～（D）， 見本文支持信息］. 將其冷凍干燥后進行SEM觀察， 發(fā)現(xiàn)形成了大量均勻分布的囊泡， 區(qū)室化結(jié)構(gòu)顯著［圖1（B）］，統(tǒng)計分析表明囊泡的平均直徑為（7.025±2.347） μm［圖1（D）］. 綜合來看， 采用超聲方式形成的乳液均質(zhì)化程度更高， 形成的囊泡分布更均勻， 穩(wěn)定時間更長.

2.1.2 超聲參數(shù) 通過調(diào)整超聲細胞破碎儀的功率和超聲時間， 探究其對乳液形貌和結(jié)構(gòu)的影響. 改變超聲功率比分別為260～455 W， 觀察不同超聲功率下乳液冷凍干燥后的形貌（圖S3， 見本文支持信息）. 結(jié)果表明， 隨著超聲功率增大， 乳液中囊泡的直徑逐漸變大， 由顆粒狀、 粘連少孔狀逐漸形成區(qū)室化多孔狀態(tài). 當(dāng)超聲功率達到390 W時， 乳液中囊泡密集且分布均勻， 呈現(xiàn)明顯的區(qū)室化和多孔結(jié)構(gòu)； 而當(dāng)超聲功率超過390 W后， 乳液中囊泡的直徑明顯變大， 形態(tài)由偏圓形被拉長形成貫通孔狀， 說明超聲功率過大時， 乳液被打破、 囊泡之間發(fā)生了融合.

控制超聲總時間分別為30～120 s， 超聲5 s后間隔5 s， 觀察不同超聲時間下乳液的形貌（圖S4， 見本文支持信息）. 發(fā)現(xiàn)隨著超聲時間的增加， 乳液中顆粒形態(tài)減少， 囊泡分布均勻， 與前面調(diào)整超聲功率由260 W增大到455 W導(dǎo)致的乳液形貌變化現(xiàn)象一致. 當(dāng)超聲時間超過120 s后， 乳液中的囊泡壁上出現(xiàn)了很多小孔， 說明超聲時間過長， 出現(xiàn)了雙乳液現(xiàn)象， 最終形成了小孔和大孔交錯分布的形貌， 造成紡絲過程中纖維強度不高， 容易斷裂. 上述結(jié)果表明， 在390 W超聲功率下超聲90 s能夠形成穩(wěn)定的區(qū)室化和多孔結(jié)構(gòu)的乳液.

2.1.3 水添加量 水的添加量會直接影響乳液中可溶解生物活性分子的量， 因此應(yīng)提高乳液中水的占比； 但水含量過高時很難進行乳液靜電紡絲， 這是由于乳液中溶解高分子的油相和溶解蛋白/酶分子的水相之間的黏度差別過大時會在紡絲過程中發(fā)生相分離， 導(dǎo)致破乳， 無法形成連續(xù)的納米纖維. 逐步提高乳液中水的添加量［分別從5%， 8%， 10%， 20%提高到30%（體積分?jǐn)?shù)）］， 采用SEM觀察乳液冷凍干燥后的形貌（圖2）. 當(dāng)水添加量達到10%時， 可以看到乳液內(nèi)部有許多囊泡， 且孔徑分布一致； 當(dāng)水添加量為20%時， 乳液內(nèi)部不僅形成囊泡， 在囊泡周圍還存在許多不同大小的球形顆粒； 當(dāng)水添加量為30%時， 乳液內(nèi)部觀察不到明顯的囊泡結(jié)構(gòu)， 在貫通的孔周圍附著了大量的球形顆粒. 表明當(dāng)紡絲液和水相體積比超過9∶1后， 在超聲過程中乳液的均質(zhì)化程度大大降低， 發(fā)生破乳并進一步導(dǎo)致在水相中形成了油相囊泡的雙乳液現(xiàn)象， 從而在乳液冷凍干燥后觀察到球狀的高分子顆粒. 故水添加量為10%（體積分?jǐn)?shù)）時為最佳， 可較好地滿足乳液紡絲的要求.

Fig.2 SEM images of the emulsions prepared with different addition amounts of water

2.1.4 乳化劑添加量 乳化劑的選擇和添加量對乳液的形成和穩(wěn)定性起重要作用. 實驗選用兩親性非離子表面活性劑Pluronic?F108作為乳化劑， Pluronic?F108是由PEO和PPO組成的ABA型三嵌段共聚物， 平均分子量Mn=14600， 其中親水段PEO占總分子量的82.5%， 具有較大的親水親油平衡值（HLB＞24）， 對蛋白類生物分子有較好的相容性， 可以有效降低混合體系的界面張力， 有利于形成穩(wěn)定的乳液. 逐步提高Pluronic?F108的添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）， 考察其對乳液形貌和穩(wěn)定性的影響. 從圖3可以看出， 當(dāng)乳化劑添加量為10%時， 乳液內(nèi)部呈粘連狀， 孔分布不均勻； 當(dāng)乳化劑添加量為20%時， 粘連態(tài)減少， 變成明顯的球狀顆粒相互連接， 表明此時乳化劑添加量較少， 不足以使乳液穩(wěn)定； 當(dāng)乳化劑添加量為30%時， 可以看到緊密相連的囊泡， 形成區(qū)室狀多孔結(jié)構(gòu)， 孔分布均勻， 孔徑一致性高； 而當(dāng)乳化劑添加量超過30%時， 乳液更容易產(chǎn)生泡沫， 不利于紡絲. 提高乳化劑比例， 油相中可以形成致密的聚合物網(wǎng)絡(luò)， 抑制了內(nèi)水相之間的聚集和內(nèi)水相向外水相的擴散， 乳液的穩(wěn)定性顯著提高［36］， 當(dāng)乳化劑濃度為30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時， 可以形成長時間穩(wěn)定的乳液.

Fig.3 SEM images of the emulsions prepared with different addition amounts of Pluronic? F108 emulsifier

2.1.5 水相中添加劑對乳液和紡絲的影響 通常制備乳液時， 在水相中不需要額外的添加劑； 但為了減少乳液在紡絲過程中因兩相黏度差異導(dǎo)致的相分離問題， 需要選擇適當(dāng)?shù)乃嗵砑觿?增加乳液的黏度， 從而在微囊泡中原位固定化蛋白類生物分子且具有一定的保護作用. 多巴胺（DA）可以自發(fā)地氧化聚合， 形成具有粘附性的聚多巴胺涂層， 能夠牢固地附著在幾乎所有類型的材料表面上［37］. 在乳液的水相中添加多巴胺可以在囊泡內(nèi)原位聚合生成聚多巴胺層， 從而有助于蛋白的固定化. 而水相中添加甘油（Gly）可以對蛋白類生物分子起保護作用， 減少有機溶劑的變性作用， 同時增加乳液中水相的黏稠度， 有利于后續(xù)的紡絲過程. 在水相中分別添加20%（體積分?jǐn)?shù)）Gly、 2 mg/mL DA和同時添加Gly與DA（圖4）， 乳液中囊泡的形貌變化不大， 仍然呈區(qū)室狀多孔結(jié)構(gòu)， 但同時添加甘油和多巴胺的樣品微囊泡的大小分布更均勻， 孔邊緣更光滑清晰.

Fig.4 SEM images of the emulsions prepared with different water phase additives

2.2 微囊型納米纖維的形貌和結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 納米纖維的表面形貌 選擇具有生物相容性的高分子PCL作為乳液的油相， 對比了在水相中添加與不添加甘油和多巴胺的乳液得到的靜電紡絲納米纖維的形貌（圖5）. 由水相中未添加甘油和多巴胺制備的乳液紡絲的SEM照片［圖5（A）和（C）］可以看出， 纖維表面附著有一些不規(guī)整的小顆粒， 纖維之間明顯粘連， 這可能是因為電紡過程中存在一定程度的乳液相分離， 出現(xiàn)了一些聚合物膠束和囊泡融合現(xiàn)象； 同時纖維直徑差異較大， 說明存在不規(guī)則電紡射流. 統(tǒng)計分析圖［圖5（A）］中納米纖維的直徑分布［圖5（B）］可知， 纖維的平均直徑為（1.894±0.658） μm， 直徑最小為0.831 μm， 最大為4.43 μm. 而由水相中添加了甘油和多巴胺的乳液得到的納米纖維表面光滑平整且直徑分布比較均勻［圖5（D）］， 說明紡絲液黏度增大， 乳液射流在電場力的作用下被更充分地拉伸， 并且聚合物分子鏈沿射流軸的取向更加均勻［38］. 此外， 實驗中采用低轉(zhuǎn)速的輥軸接收器收集納米纖維， 因為過高的接收轉(zhuǎn)速會在電場力存在的情況下額外增加機械拉伸， 進一步加強納米纖維的軸向取向， 導(dǎo)致纖維內(nèi)部的微囊泡發(fā)生融合和破乳， 從而最終形成核殼型納米纖維. 因此， 為保持乳液中微囊泡的存在， 應(yīng)盡量控制較低的輥軸轉(zhuǎn)速（100～500 r/min）或者采用平板接收器.

Fig.5 SEM images(A, C, D) of nanofiber membranes prepared by emulsion electrospinning and statistical distribution of nanofiber diameter from (A)(B)

2.2.2 納米纖維膜的表面特性和力學(xué)性能 在紡絲乳液的水相中添加甘油和多巴胺會對納米纖維的表面特性和力學(xué)性能產(chǎn)生影響. 如圖S5（見本文支持信息）所示， 在水相中添加甘油和多巴胺后， 納米纖維膜的水接觸角從64.61°增加到110.53°， 表明水相添加劑改變了納米纖維膜的表面性質(zhì)， 其疏水性極大增加. 由于添加甘油和多巴胺后乳液更加穩(wěn)定， 在靜電紡絲過程中不會出現(xiàn)明顯的破乳現(xiàn)象， 因此納米纖維表面更多地呈現(xiàn)出高分子PCL 本身的疏水性； 而未加入水相添加劑的對照組顯現(xiàn)出親水性， 間接證明了其紡絲過程中可能存在相分離問題. 水相添加劑也會提高納米纖維膜的力學(xué)性能（圖S6， 見本文支持信息）， 使其抗拉強度從4.19 MPa提高到4.80 MPa， 拉伸形變率從48.68%提高到53.12%， 納米纖維膜具有了更好的韌性.

2.2.3 納米纖維膜的孔徑分布 為了證明乳液和納米纖維中存在微囊泡， 采用氮氣吸附-脫附實驗和壓汞法兩種方法測試材料內(nèi)部的孔隙. 由圖6可見， 乳液經(jīng)冷凍干燥后測試氮氣吸附得到的孔徑分布［圖6（A）］與納米纖維膜的孔徑分布基本一致［圖6（B）］， 集中在3.17 nm左右， 纖維膜還存在6.22 nm左右的微孔， 并且計算得出納米纖維膜的比表面積為31.784 m2/g（圖S7， 見本文支持信息）. 這些數(shù)據(jù)與通過SEM圖片直接測量的孔徑分布數(shù)值相比明顯偏小， 這是由于直接觀察法受視野限制只能反映極小范圍的樣品情況， 而間接測量法如氮氣吸附可以反映的樣品尺度大， 更代表整體情況； 但是采用BET法分析氮氣吸附-脫附實驗結(jié)果是依據(jù)氮氣的毛細管凝聚估算材料的孔徑分布， 會低估中孔和大孔的含量， 只能給出比較準(zhǔn)確的比表面積和微孔含量， 因此適合表征2～50 nm的孔徑. 考慮到乳液和納米纖維中的微囊泡尺寸較大且呈現(xiàn)閉孔狀態(tài)， 很可能會影響氮氣吸附的實驗結(jié)果， 因此采用壓汞法對樣品實施進一步測試. 壓汞法屬于侵入式間接測量法， 通過測量注汞/退汞的體積和壓力變化計算出孔徑， 適合表征＞50 nm的孔徑， 高壓下可以破壞侵入微囊泡內(nèi)部， 實驗結(jié)果相對更準(zhǔn)確. 結(jié)果表明， 乳液中微囊泡的孔徑主要分布在2.5 μm左右［圖6（C）］， 還有少量24.2 μm左右的孔， 與SEM觀察數(shù)據(jù)比較一致； 而納米纖維膜內(nèi)微囊泡的孔徑集中分布在1.06 μm左右［圖6（D）］. 此外， 通過壓汞法測試可以進一步計算得到納米纖維膜材料的孔隙率為68.37%.

2.3 載BSA納米纖維中蛋白的定位與釋放行為

2.3.1 熒光標(biāo)記BSA 在納米纖維中的分布特性 為了進一步驗證納米纖維中存在微囊泡并可以封裝蛋白質(zhì)/酶等生物活性分子， 在乳液制備時向水相中添加熒光分子標(biāo)記的牛血清白蛋白（BSA）作為模型蛋白， 通過CLSM觀察納米纖維內(nèi)部蛋白的定位和分布情況. 通過激光激發(fā)標(biāo)記熒光分子的BSA產(chǎn)生紅色熒光， 發(fā)現(xiàn)3組照片中明場下的纖維圖像和暗場下的點狀熒光圖像可以有效重合（圖7）， 直觀地表明納米纖維內(nèi)部存在點狀分布的BSA， 進一步證明了纖維內(nèi)部存在著封裝蛋白的微囊泡結(jié)構(gòu). 同時，由于靜電紡絲過程中的電場拉伸作用和溶劑蒸發(fā)導(dǎo)致納米纖維內(nèi)部的微囊泡沿纖維軸向取向， 不是呈完美的球形而是呈長棒狀［見圖7（B）， 7（E）和7（H）中白色箭頭所標(biāo)注的區(qū)域］. 統(tǒng)計分析表明， 纖維內(nèi)的微囊泡平均軸向長（1.005±0.399） μm， 徑向?qū)挘?.471±0.153） μm， 與2.2.3節(jié)中采用壓汞法測量納米纖維膜內(nèi)部孔徑得到的1.06 μm一致. 此外， 在圖7中也發(fā)現(xiàn)納米纖維內(nèi)部存在部分微囊泡破乳并相互融合形成核殼結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象［見圖7（E）和7（H）中白色圓圈所標(biāo)注的區(qū)域］， 這可以通過適當(dāng)降低紡絲電壓， 減少電場力拉伸作用和采用平板接收器消除機械應(yīng)力等方法得以改善.

Fig.7 CLSM images of nanofiber membrane of different sites with red fluorescent labeled BSA

2.3.2 載BSA 納米纖維的體外蛋白釋放行為 通過測試載BSA 納米纖維的體外蛋白釋放行為和蛋白負載量， 也可以間接證明蛋白被固定在納米纖維內(nèi)部的微囊泡中. 在水相中添加20 mg/mL 高濃度的BSA， 同時對比甘油和多巴胺兩種水相添加劑的固定化效果. 將制得的納米纖維在pH=7.4的Tris-HCl緩沖液中浸泡4 h， 通過考馬斯亮藍染色-紫外吸光法測試納米纖維內(nèi)部封裝蛋白的釋放行為. 由圖8可見， 水相中不含甘油和多巴胺添加劑的樣品， 在10 min 內(nèi)就快速達到最大釋放量， 蛋白釋放率為14.83%并且隨后一直保持穩(wěn)定， 說明纖維中存在較少量的微囊泡破乳現(xiàn)象， 導(dǎo)致流失的蛋白快速釋放出來， 剩余的85.17%的BSA被固定在納米纖維的微囊泡內(nèi). 水相中額外加入甘油和多巴胺的樣品蛋白釋放率在120 min 達到10.03%并保持穩(wěn)定， 表明89.97%的BSA被封裝在納米纖維內(nèi)部的微囊泡中，蛋白的固定化率進一步提高了4.8%， 通過計算得出納米纖維內(nèi)BSA 的負載量可達到12.89 mg/g. 由于水相中多巴胺的加入， 可以在微囊泡中原位聚合形成聚多巴胺層固定化蛋白， 最終減緩了蛋白釋放速率并明顯降低了BSA 的釋放量， 表明微囊型納米纖維可以有效固定化酶， 減少蛋白流失并提高蛋白的封裝率， 從而增加酶的重復(fù)使用性.

Fig.8 Protein release rate curves of nanofiber membrane

3 結(jié) 論

采用超聲乳化方法， 通過調(diào)節(jié)水添加量、 乳化劑添加量和水相添加劑等參數(shù)， 制備了長時間穩(wěn)定的W/O 乳液， 經(jīng)乳液靜電紡絲制備了封裝BSA 的微囊型PCL 納米纖維膜. 最佳的乳液配制條件為：10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）PCL紡絲液中添加30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）乳化劑Pluronic?F108， 水相中添加20%（體積分?jǐn)?shù)）甘油、 2 mg/mL多巴胺和20 mg/mL蛋白質(zhì)/酶， 控制紡絲液和水相體積比為9∶1， 超聲功率390 W， 5 s間歇超聲90 s（占空比1∶1）. 紡絲過程中采用較低電壓和平板接收器， 制備的納米纖維內(nèi)部呈現(xiàn)區(qū)室化微囊泡結(jié)構(gòu)， 比表面積為31.784 m2/g， 內(nèi)部微囊泡孔徑集中分布在1.06 μm， BSA 負載量可達12.89 mg/g， 4 h的蛋白釋放率僅為10.03%， 蛋白的固定化率高達89.97%， 可以有效在材料內(nèi)部微囊泡中封裝酶蛋白， 是一種不同于常規(guī)中空/核殼結(jié)構(gòu)的仿生功能化微囊型納米纖維材料， 有望在固定化酶和生物催化等領(lǐng)域發(fā)揮出巨大潛力.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/20230199.