楊曉利，蒲天珍，李永華，陳暢，張秀橋，龔玲（湖北中醫(yī)藥大學藥學院，湖北 武漢 430065）

霍山石斛DendrobiumhoushaneneseC.Z. Tang et S.J. Cheng是蘭科石斛屬多年生草本植物，為2020年版《中國藥典》石斛項下原植物之一，具有益胃生津，滋陰清熱等功效[1]。霍山石斛因其特殊而嚴苛的生長環(huán)境，加之過度采挖，導致其野生資源瀕臨滅絕?；羯绞鷤鹘y(tǒng)入藥部位為莖，在加工的過程中除去生物產(chǎn)量較大的葉、根等非藥用部位?；羯绞闹饕瘜W成分包括多糖、黃酮、生物堿、氨基酸及微量元素等[2]，其中多糖類和黃酮類成分是其含量最高的主要活性成分[3]。已有研究[4-9]表明，石斛屬植物中的黃酮及其糖苷類成分具有抗氧化、抗腫瘤、止血、免疫調(diào)節(jié)、抗阿爾茲海默癥等藥理作用，現(xiàn)已經(jīng)被認為是其主要的藥理活性物質(zhì)之一。因此，有必要對霍山石斛不同部位中黃酮類化合物進行全面的分析研究，為霍山石斛的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。超高效液相色譜-四級桿/飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)靈敏度高、分離能力強、分辨率高，能快速地進行結(jié)構(gòu)表征，有效提供化合物的結(jié)構(gòu)信息，是一種高效的分析檢測工具，目前已在天然藥物的成分分析與鑒定方面得到廣泛應(yīng)用[10]。本實驗測定了霍山石斛不同部位的總黃酮含量，并采用UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，分析比較霍山石斛不同部位的黃酮類成分，以期獲得霍山石斛不同部位的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)信息，為霍山石斛藥用資源的擴大與進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器AT-201型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；DHG-914385-Ⅲ型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；KX-350 型高速多功能粉碎機（浙江武義鼎藏日用金屬制品廠）；KQ3200B 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；UVmini-1240紫外可見分光光度計（日本島津公司）；高分辨飛行時間液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Waters公司）。

1.2 材料與試劑3 年生霍山石斛于2021 年9 月采自湖北省英山縣霍山石斛種植基地，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學藥學院張秀橋教授鑒定為霍山石斛Dendrobium huoshaneneseC. T. Tang et S. J. Cheng。芹菜素對照品，純度＞98%，上海胤珂生物科技有限公司，批號： 140312；甲醇為色譜純，美國Sigma-Alorch 公司，批號：WXBC2770V；石油醚（30 ～60 ℃）、氯化鋁、無水乙醇、甲酸，國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法

2.1 含量測定

2.1.1 供試品溶液的制備 霍山石斛樣品清洗干凈，將根、莖、葉分開，將莖剪成小段，將處理后的根、莖、葉于烘箱中60 ℃低溫烘干，粉碎機粉碎為粉末，過60 目篩，-20 ℃保存?zhèn)溆谩＞芊Q取霍山石斛根、莖、葉的粉末各0.5 g，加入15 mL 石油醚，室溫浸泡30 min，超聲（100 W、40 Hz）提取30 min，濾過后取濾渣。待石油醚揮盡后，再加入80%乙醇25 mL，室溫浸泡30 min，稱質(zhì)量，超聲（100 W、40 Hz）40 min，取出室溫放置冷卻。再稱質(zhì)量，用80%乙醇補足損失的質(zhì)量，搖勻。重復3次后過濾，取續(xù)濾液，即得根、莖、葉供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取芹菜素對照品4.78 mg，用80%乙醇溶解，并定容至50 mL，搖勻，即得濃度為0.095 6 mg·mL-1的芹菜素對照品溶液[11]。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密量取芹菜素對照品溶液0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4 mL 分別置于10 mL 容量瓶中，加入1% AlCl3溶液1 mL。再加入80%乙醇，定容，搖勻，室溫靜置15 min。以未加芹菜素對照品溶液為空白對照，紫外可見分光光度儀在波長415 nm處測定吸光度值[12-13]。以濃度（X，mg·mL-1）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程。

2.1.4 總黃酮含量測定 取3 批根、莖、葉粉末，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液。精密吸取1 mL分別置于10 mL容量瓶，按照“2.1.3”項下方法測定待測液中總黃酮含量。將吸光度代入標準曲線的回歸方程中，計算得出各部位總黃酮含量。

2.2 成分分析

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱定霍山石斛根、莖、葉粉末各1 g，置于錐形瓶中，加入80%甲醇30 mL，室溫浸泡30 min，稱質(zhì)量。超聲（100 W、40 Hz）40 min，室溫靜置冷卻。再稱質(zhì)量，用80%甲醇補足損失的質(zhì)量，搖勻。重復3次后過濾，濾液用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.2 色譜條件 液相條件：色譜柱為Altima UHPLC C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長：335 nm；柱溫：35 ℃；流速：0.9 mL·min-1；進樣量：2 μL；流動相：0.4%甲酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫：0～35 min，25%～45% B；35～50 min，45%～95% B；50～55 min，95%～95% B；55～56 min，95%～25% B；56～60 min，25%～25% B。

質(zhì)譜條件：掃描范圍（m/z）：100～1 200；采用加熱電噴霧離子化源（H-ESI），負離子模式下采集數(shù)據(jù)；毛細管電壓2.5 kV；樣品錐孔電壓30 V；脫溶劑氣溫度500 ℃；錐孔氣的流量50 L·h-1；脫溶劑氣流量500 L·h-1；離子源溫度100 ℃；碰撞能量6.0 eV；分析時間60 min。使用MassLynx V4.1 軟件處理數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果

3.1 線性關(guān)系考察按照“2.1.3”項下操作繪制芹菜素標準曲線，得到回歸方程Y=18.316X+0.001 5，r=0.999 9，結(jié)果顯示在0.009 6～0.038 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

3.2 方法學考察

3.2.1 穩(wěn)定性試驗 精密稱取霍山石斛葉粉末0.5 g，按“2.1.1”項方法下制備供試品溶液，分別在制備后間隔0、10、20、30、40、50、60、70 min 測定吸光度[14]。結(jié)果顯示吸光度的RSD 為1.91%（n=8），表明樣品在70 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.2.2 精密度試驗 精密吸取“2.1.1”項下霍山石斛葉供試品溶液，在波長415 nm 下連續(xù)進樣6 次，分別測定吸光度。結(jié)果吸光度的RSD 為0.192%（n=6），表明該方法的精密度良好。

3.2.3 重復性試驗 精密稱取霍山石斛葉粉末0.5 g各6份，按“2.1.1”項下方法分別制備供試品溶液。精密吸取1 mL，于415 nm下測定吸光度。結(jié)果吸光度的RSD為2.55%（n=6），表明該方法重復性良好。

3.2.4 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的霍山石斛葉粉末0.5 g 各6 份，分別加入一定體積的芹菜素對照品溶液，按“2.1.1”項下方法制備溶液。精密吸取1 mL，按“2.1.3”項下方法測定吸光度。結(jié)果見表1。平均回收率為98.54%，RSD為1.10%（n=6）。

表1 霍山石斛總黃酮加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Table 1 Results of recovery rate of total flavonoids in Dendrobium huoshanenese（n=6）

3.3 樣品含量測定見圖1?；羯绞?、莖、葉3個部分總黃酮含量分別為0.477、0.630、2.06 mg·g-1?？傸S酮在霍山石斛不同部位中的積累情況比較：葉＞莖＞根。其中，葉、莖部位總黃酮含量顯著高于根部（P＜0.05，P＜0.01），葉中總黃酮含量又顯著高于莖部（P＜0.01）。

圖1 霍山石斛根、莖、葉總黃酮含量比較（n=3）Figure 1 Comparison of total flavonoids contents in roots，stems and leaves of D. huoshanenese（n=3）

3.4 成分分析應(yīng)用UHPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)，使用負離子模式[15-16]進行掃描，根據(jù)保留時間、分子離子峰、主要碎片離子峰、裂解規(guī)律，并結(jié)合相關(guān)文獻結(jié)果[17]，最終在霍山石斛根、莖、葉中分別鑒定出53、61、68 種黃酮類化合物。霍山石斛根、莖、葉負離子模式下的總離子流圖見圖2。通過對霍山石斛的根、莖、葉中的黃酮類化合物進行鑒別，發(fā)現(xiàn)葉中的黃酮類化合物的數(shù)量是最多的。與葉相比，在根中未能鑒別出的化合物有15 種，分別是化合物34、53、56、37、65、67、68、57、62、63、64、66、40、49、60；在莖中未能鑒別出7種化合物，分別是化合物39、56、57、62、67、68、66。含量測定結(jié)果顯示葉中總黃酮含量最高。因此，本研究重點闡述霍山石斛葉中黃酮類化合物的定性鑒別結(jié)果。見表2。

圖2 霍山石斛根（A）、莖（B）、葉（C）負離子模式下總離子流圖Figure 2 Total ion currents of D. Huoshanenese under negative ion mode in roots（A），stems（B）and leaves（C）

表2 霍山石斛葉的黃酮類成分鑒定結(jié)果Table 2 The identification results of flavonoid constituents in D. Huoshanenese leaves

3.5 化合物鑒定結(jié)果

3.5.1 黃酮氧苷類 在葉中鑒定出4 種黃酮氧苷類化合物，包括已被報道的柚皮苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-蕓香糖苷，以及推導得出的新橙皮苷。以化合物45新橙皮苷為例進行分析，保留時間17.16 min，母離子為m/z623 [M-H]-，可知其相對分子質(zhì)量為624。推測其裂解途徑為母離子失去一分子C14H28O72生成m/z315，表明該化合物的結(jié)構(gòu)中有蕓香糖基取代，其裂解規(guī)律與化合物異鼠李素-3-O-β-D-蕓香糖苷相同。結(jié)合相關(guān)文獻報道[18]推斷，該化合物為異鼠李素-3-O-β-D-蕓香糖苷的同分異構(gòu)體新橙皮苷。其二級質(zhì)譜圖見圖3，其余黃酮氧苷類化合物信息見表2。

圖3 化合物45 的二級質(zhì)譜圖Figure 3 Secondary mass spectrum of compound 45

3.5.2 黃酮單糖碳苷 在葉中鑒定出7 種黃酮單糖碳苷類化合物。包括已經(jīng)被報道的牡荊素-2”-O-鼠李糖苷、異牡荊素-2”-O-鼠李糖苷、金圣草黃素6-C-鼠李糖-（1→2）-六碳糖苷、芹菜素-8-C-鼠李糖-（1→2）-阿拉伯糖苷、芹菜素-6-C-β-D-鼠李糖-（1→2）-阿拉伯糖苷，以及推導得出的金圣草黃素-6-C-鼠李糖-（1→2）-五碳糖苷。以化合物53金圣草黃素-6-C-鼠李糖-（1→2）-五碳糖苷為例進行分析?；衔?3 的保留時間20.72 min，母離子為m/z577[M-H]-，可知其相對分子質(zhì)量為578。推測其裂解途徑為母離子分別失去一分子C3H6O3、C6H12O5和C6H10O4，生成m/z487、m/z413 和m/z431，m/z431進一步失去一分子C3H6O3生成m/z341，脫去一分子C2H4O2和一分子H2O 生成m/z371 和m/z353。推斷化合物53 為金圣草黃素-6-C-鼠李糖-（1→2）-五碳糖苷。其二級質(zhì)譜圖及可能的裂解過程見圖4。其余未見報道的黃酮單糖碳苷化合物30、56信息見表2。

圖4 化合物53 的二級質(zhì)譜圖（A）及可能的裂解途徑（B）Figure 4 Secondary mass spectrum（A）and possible cleavage pathway（B）of compound 53

3.5.3 黃酮雙糖碳苷 在葉中鑒定出57種黃酮單糖碳苷類化合物，推導得出可能的化合物共25 種，包括芹菜素-6，8-二-C-六碳糖苷、芹菜素-6-C-六碳糖-8-C-五碳糖苷、芹菜素-6，8-二-C-五碳糖苷、金圣草黃素-6，8-二-五碳糖苷等。以化合物33 芹菜素-6-C-鼠李糖-（1→2）-五碳糖-8-C-五碳糖苷為例進行分析?；衔?3 的保留時間12.88 min，母離子為m/z679 [M-H]-，可知其相對分子質(zhì)量為680。裂解途徑為母離子分別失去一分子C3H6O3、C2H4O2和C6H12O5生成m/z619、m/z589和m/z515，m/z515 進一步失去一分子C3H6O3生成m/z425，m/z425 分別失去一分子C3H6O3和C2H4O2生成m/z335 和m/z365。推斷化合物33 可能為芹菜素-6-C-鼠李糖-（1→2）-五碳糖-8-C-五碳糖苷。其二級質(zhì)譜及可能的裂解途徑見圖5。其余未見報道的黃酮雙糖碳苷化合物2、4、5、29、33、34、35、36、37、40、41、49、52、54、55、57、58、62、63、64、65、66、67、68 信息見表2。

圖5 化合物33 的二級質(zhì)譜圖（A）及可能裂解途徑（B）Figure 5 Secondary mass spectrum（A）and possible cleavage pathway（B）of compound 33

4 討論

本研究采用AlCl3比色法測定霍山石斛根、莖、葉3個部位黃酮類化合物的積累情況，結(jié)果顯示不同部位中總黃酮的含量有顯著性差異，黃酮的積累情況比較：葉＞莖＞根，且葉中總黃酮顯著高于其他部位。通過UHPLC-Q-TOF-MS 對霍山石斛3 個部位黃酮類化合物進行定性鑒別分析，在負離子模式下葉中共鑒定出68 種黃酮類化合物、根53 種和莖61 種。在本研究中，從霍山石斛葉片中鑒定出68 種黃酮類化合物，其中64 種為黃酮碳苷，苷元主要有芹菜素、金圣草素及木犀草素。4種為黃酮氧苷，苷元為異鼠李素和柚皮素。連接糖基的類型有葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖等。在68 種黃酮類化合物中，已有23 種在霍山石斛中被發(fā)現(xiàn)，如新西蘭牡荊苷Ⅰ[19]、夏佛塔苷[20]、異夏佛塔苷等[21]。有16種在石斛的其他品種中已報道，但在霍山石斛中首次被發(fā)現(xiàn)，如新夏佛塔苷[22]、佛萊心苷[23]、異佛萊心苷[24]等。而根據(jù)裂解規(guī)律首次推導獲得的29 種黃酮類化合物，如新橙皮苷、木犀草素-6-C-六碳糖-8-C-五碳糖苷等在霍山石斛的成分研究中尚未見報道。而新橙皮苷具有抗炎活性[25]，木犀草素-6-C-六碳糖-8-C-五碳糖苷對腫瘤細胞具有抑制作用[26]。

本研究結(jié)果顯示，與霍山石斛傳統(tǒng)入藥部位莖部相比，葉中的黃酮含量更高且數(shù)量更多，既豐富了霍山石斛黃酮類化合物的信息，也為減少霍山石斛加工過程中產(chǎn)生的資源浪費，提高非藥用部位的利用，從而促進霍山石斛產(chǎn)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)。