石拴霞， 閻一鑫， 宋誠， 王紀(jì)田， 何毅剛， 王玲

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 甘肅 蘭州 730000； 2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心， 甘肅 蘭州 730050； 3.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院 甘肅省干細(xì)胞與基因藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 甘肅 蘭州 730050）

有研究表明，男性不育可能是未來亞健康的先兆[1]。精原細(xì)胞是精子的前體細(xì)胞，能自我增殖和分化，具有獨(dú)特的減數(shù)分裂能力，能將遺傳物質(zhì)減半，產(chǎn)生單形精子，將遺傳物質(zhì)傳遞給下一代[2]，在男性生育中發(fā)揮重要作用。氧化應(yīng)激（oxidative stress, OS）是過量活性氧（reactive oxygen species, ROS）堆積的結(jié)果，也是導(dǎo)致男性不育和生殖細(xì)胞損傷的主要病理機(jī)制[3]。線粒體作為精子活動力的主要能量產(chǎn)生者，易受到過量ROS 攻擊，造成細(xì)胞功能障礙及凋亡，影響精子活力，導(dǎo)致不育[4]。白藜蘆醇（Resveratrol, RES）是一種天然非黃酮類多酚化合物，廣泛分布于葡萄、花生、虎杖、桑葚等藥用植物中，具有抗凋亡、抗癌、抗炎、抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)血脂等作用[5]。目前，已有RES 用于多種抗氧化損傷的研究報(bào)道，但在男性生殖細(xì)胞中的研究較少。因此，本研究采用過氧化氫H2O2誘導(dǎo)的Gc-1 spg 細(xì)胞構(gòu)建氧化損傷模型，觀察RES 對Gc-1 spg 細(xì)胞OS 損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑

小鼠精原細(xì)胞Gc-1 spg 細(xì)胞株、DMEM 購自上海語純生物科技有限公司，0.25%胰酶、10%胎牛血清、1%青鏈霉素購自塞維爾生物科技公司，白藜蘆醇購自陜西嘉果肽生物工程有限公司，3%過氧化氫H2O2購自上海信裕生物科技有限公司，CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）、Hoechst 細(xì)胞核凋亡染色試劑盒、RIPA 裂解液購自碧云天生物技術(shù)有限公司，Mito Tracker?Green FM 線粒體綠色熒光探針試劑盒購自美國Cell Signaling Technology 公司，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司，兔抗Bcl-2、兔抗Bax、兔抗Caspase-3 多克隆抗體均購自博士德生物工程有限公司，β-tubulin購自武漢塞維爾生物有限公司。

1.2 方法

1.2.2 H2O2構(gòu)建Gc-1 spg細(xì)胞OS損傷模型 取對數(shù)生長期的Gc-1 spg 細(xì)胞，0.25%胰酶消化2 min，培養(yǎng)基終止消化后反復(fù)吹打，制成細(xì)胞懸液，使細(xì)胞數(shù)達(dá)5×103個(gè)/L，將細(xì)胞均勻接種于96 孔板，每孔100 μL，待細(xì)胞貼壁后加入含H2O2（0、50、100、200、400、600、800 和1 000 μmol/L）的新鮮培養(yǎng)基，每組5 個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃ 5%二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4、6、8 和10 h 后棄舊培養(yǎng)基，所有組均加入含10%CCK-8 的完全培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)孵育30～60 min，酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處細(xì)胞活力。細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組-空白組）/（對照組-空白組）×100%，空白組只加CCK-8 的完全培養(yǎng)基，0 μmol/L 為對照組，實(shí)驗(yàn)組為不同濃度的H2O2。

1.2.3 不同濃度RES 組Gc-1 spg 細(xì)胞活力檢測按1.2.2 中的方法接種細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后加入含RES（0、5、10、15、20 和30 μmol/L）的新鮮培養(yǎng)基，每組5 個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃ 5%二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后棄去舊培養(yǎng)基，各組均加入含有10%CCK-8 的完全培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)孵育30～60 min，酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處細(xì)胞活力。細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組-空白組）/（對照組-空白組）×100%，空白組只加CCK-8 的完全培養(yǎng)基，0 μmol/L 為對照組，實(shí)驗(yàn)組為不同濃度的RES。

1.2.4 H2O2+不同濃度RES組Gc-1 spg細(xì)胞活力檢測按1.2.2 中的方法接種細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后加入含RES（0、5、10 和15 μmol/L）的新鮮培養(yǎng)基預(yù)處理24 h，每組5 個(gè)復(fù)孔，24 h 后棄舊培養(yǎng)基，除空白組外其余各組均加入含800 μmol/L H2O2的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h，所有組均加入含有10% CCK-8 的完全培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)孵育30～60 min，酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處細(xì)胞活力。細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組-空白組）/（對照組-空白組）×100%，空白組只加CCK-8 的完全培養(yǎng)基，0 μmol/L 為對照組，實(shí)驗(yàn)組為H2O2+不同濃度的RES。

1.2.5 細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)測定 取對數(shù)生長期的Gc-1 spg 細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，使細(xì)胞數(shù)達(dá)2×105，將細(xì)胞均勻接種于6 孔板，每孔2 mL，待細(xì)胞貼壁后加入含RES（0、5、10 和15 μmol/L）的新鮮培養(yǎng)基預(yù)處理24 h 后棄去舊培養(yǎng)液，除空白組外其余各組均加入含800 μmol/L H2O2的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h后棄舊培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline, PBS）洗滌3 次，細(xì)胞刮收集細(xì)胞不少于106/mL，1 000 r/min 離心10 min，棄上清液，加入1 mL預(yù)冷的PBS 勻漿器勻漿，采用試劑盒測定SOD、MDA、LDH、GSH-Px 水平。

1.2.6 細(xì)胞線粒體膜電位測定 根據(jù)樣本按照J(rèn)C-1 試劑盒配制染色工作液和緩沖液，配好的緩沖液放于-20 ℃冰箱冷凍備用；前期實(shí)驗(yàn)處理同1.2.5，后棄舊培養(yǎng)基，PBS 洗滌3次，加入配好的JC-1 染色工作液和完全培養(yǎng)基各1 mL，充分混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30 min，結(jié)束后棄去培養(yǎng)液，JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌1 次，加入2 mL PBS，熒光顯微鏡下觀察并拍照。Image J 軟件進(jìn)行熒光定量并計(jì)算紅/綠熒光比值。

1.2.7 細(xì)胞線粒體測定 根據(jù)樣本按照Mito Tracker?Green FM 試劑盒配制染色工作液，配好后放入37 ℃溫箱預(yù)溫備用；前期實(shí)驗(yàn)處理同1.2.5，后棄舊培養(yǎng)基，PBS 洗滌3次，加入配好的Mito Tracker?Green FM 染色工作液1 mL，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30 min，結(jié)束后棄去工作液，加入預(yù)溫的完全培養(yǎng)基1 mL，熒光顯微鏡下觀察并拍照。Image J 軟件進(jìn)行熒光定量并分析。

1.2.8 細(xì)胞核凋亡率檢測 前期實(shí)驗(yàn)處理同1.2.5，后棄舊培養(yǎng)基，PBS 洗滌3次，加入Hoechst 33342染色液1 mL，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30 min，結(jié)束后棄去染色液，PBS 洗滌2 次，熒光顯微鏡下觀察并拍照，手動計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞核凋亡率。凋亡率=（凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.2.9 Western blotting 檢測凋亡蛋白表達(dá) 前期實(shí)驗(yàn)處理同1.2.5，后棄舊培養(yǎng)基，冰冷PBS 洗2 次，吸水紙吸干殘余PBS，加入配好的蛋白裂解液冰上裂解40 min，4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min，提取上清液，按照BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，計(jì)算上樣量，按照樣本總體積加4 × 蛋白上樣緩沖液（樣本總體積/4），100 ℃沸水煮樣15 min，-80 ℃冰箱備用。按照目標(biāo)蛋白分子量制膠，加樣（按之前算好的上樣量），經(jīng)過SDS-PAGE 電泳，免疫印跡轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉、洗膜、一抗孵育，洗膜、二抗孵育，洗膜、化學(xué)發(fā)光成像。Image J 軟件分析凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Bcl-2 條帶灰度值計(jì)算蛋白相對表達(dá)量，β-tubulin 為內(nèi)參蛋白。

螺紋緊固件是將汽車的部件連接起來的裝置，是汽車維修技術(shù)人員接觸最多的零件，現(xiàn)代汽車中使用了數(shù)百種緊固件。常見的緊固件如圖1所示，擰緊螺栓時(shí)在螺栓上引起的力如圖2所示，作用在被緊固件上的力為夾緊力。常用螺紋標(biāo)準(zhǔn)是米(公)制螺紋，少部分從美國、英國來的進(jìn)口車可能用寸制螺紋(UNC，UNF)，此外車上部分傳感器和螺塞還使用圓柱管螺紋和圓錐管螺紋。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21 和GraphPad Prism 8 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2對Gc-1 spg細(xì)胞活力的影響

0、50、100 、200、400、600、800 和1 000 μmol/L H2O2處理Gc-1 spg 細(xì)胞4、6、8 和10 h 后的細(xì)胞活力比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力有差異（F=100.066，P=0.000）；②不同濃度H2O2組的細(xì)胞活力有差異（F=539.136，P=0.000）；③不同時(shí)間點(diǎn)不同濃度H2O2組細(xì)胞活力的變化趨勢有差異（F=8.853，P=0.000）。與0 μmol/L H2O2組比較，4、6、8 和10 h 時(shí)，100、200、400、600、800 和1 000 μmol/L H2O2組細(xì)胞活力降低（P＜0.05）；8 和10 h 時(shí)，800 和1 000 μmol/L H2O2組細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞損傷較重（P＜0.05）；6 h 時(shí)，800 μmol/L H2O2組細(xì)胞活力為（51.51±5.46）%，細(xì)胞活力明顯下降，既達(dá)到了損傷狀態(tài)，又存在一定細(xì)胞活力，符合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究條件（見圖1 和表1）。因此，本研究采用800 μmol/L H2O2處理Gc-1 spg 細(xì)胞6 h 構(gòu)建Gc-1 spg 細(xì)胞OS 損傷模型，設(shè)為H2O2組。

表1 不同濃度H2O2組細(xì)胞活力的比較 （%， ±s）

表1 不同濃度H2O2組細(xì)胞活力的比較 （%， ±s）

注 ： ?與0 μmol/L H2O2組比較，P ＜0.05。

組別0 μmol/L H2O2組50 μmol/L H2O2組100 μmol/L H2O2組200 μmol/L H2O2組400 μmol/L H2O2組600 μmol/L H2O2組800 μmol/L H2O2組1 000 μmol/L H2O2組4 h 101.14±1.06 100.41±1.25 96.12±1.04?94.89±0.43?86.98±2.34?74.46±3.98?72.31±2.74?62.66±2.29?6 h 100.49±1.88 99.54±1.69 95.94±1.91?88.99±4.80?84.91±3.15?71.83±3.24?51.51±5.46?47.54±4.77?8 h 99.82±3.02 98.49±3.26 93.11±4.90?87.59±2.77?75.69±2.90?66.81±1.10?43.26±7.81?35.04±1.63?10 h 95.59±3.60 91.39±2.55 88.97±0.92?86.19±1.87?73.91±3.46?62.04±3.47?33.56±3.80?32.75±2.85?

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)不同濃度H2O2對Gc-1 spg細(xì)胞活力的影響 （±s）

2.2 RES對Gc-1 spg細(xì)胞活力的影響

0、5、10 、15、20、30 μmol/L RES 處理Gc-1 spg 細(xì)胞24 h 后的細(xì)胞活力比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與0 μmol/L RES 組比較，20、30 μmol/L RES 對Gc-1 spg 細(xì)胞活力影響較大（見圖2 和表2）。因此，本研究采用低于20 μmol/L的RES進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 不同濃度RES組細(xì)胞活力的比較 （%，±s）

表2 不同濃度RES組細(xì)胞活力的比較 （%，±s）

組別0 μmol/L RES組5 μmol/L RES組10 μmol/L RES組15 μmol/L RES組20 μmol/L RES組30 μmol/L RES組F 值P 值細(xì)胞活力98.07±1.27 97.74±2.70 96.97±12.05 96.33±8.99 90.63±0.92 90.91±13.98 0.811 0.553

圖2 不同濃度RES對Gc-1 spg細(xì)胞活力的影響 （±s）

2.3 RES對H2O2處理的Gc-1 spg細(xì)胞的保護(hù)作用

空白組、H2O2組、H2O2+不同濃度RES 組的細(xì)胞活力比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，與空白組比較，各H2O2組細(xì)胞活力降低（P＜0.05），H2O2處理Gc-1 spg 細(xì)胞6 h后細(xì)胞活力顯著下降；與H2O2組比較，H2O2+5 μmol/L RES 組、H2O2+10 μmol/L RES 組、H2O2+15 μmol/L RES 組細(xì)胞活力升高（P＜0.05），RES 預(yù)處理24 h 后能逆轉(zhuǎn)H2O2引起的細(xì)胞活力下降，且與RES 濃度有關(guān)。見圖3 和表3。

表3 各組細(xì)胞活力比較 （%， ±s）

表3 各組細(xì)胞活力比較 （%， ±s）

注 ： ①與空白組比較，P＜0.05； ②與H2O2組比較，P＜0.05。

組別空白組H2O2組H2O2+5 μmol/L RES組H2O2+10 μmol/L RES組H2O2+15 μmol/L RES組F 值P 值細(xì)胞活力96.71±3.90 56.93±2.40①77.62±4.06②81.90±5.56②84.03±8.98②28.004 0.000

圖3 RES對H2O2處理的Gc-1 spg細(xì)胞活力的影響（±s）

2.4 RES 對H2O2處理的Gc-1 spg 細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

空白組、H2O2組、H2O2+不同濃度RES 組的SOD、MDA、GSH-Px、LDH 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，與空白組比較，各H2O2組的GSH-Px 和SOD 水平降低（P＜0.05），LDH 和MDA 水平升高（P＜0.05），H2O2處理Gc-1 spg 細(xì)胞6 h 后能明顯降低細(xì)胞的GSH-Px 和SOD 水平，并增加細(xì)胞的LDH 和MDA 水平，說明OS損傷模型復(fù)制成功；與H2O2組比較，H2O2+5 μmol/L RES 組、H2O2+10 μmol/L RES 組、H2O2+15 μmol/L RES組GSH-Px 和SOD 水平降低（P＜0.05），LDH 和MDA水平升高（P＜0.05），RES 預(yù)處理能明顯逆轉(zhuǎn)H2O2引起的Gc-1 spg 細(xì)胞GSH-Px 和SOD 下降和LDH 和MDA 升高，呈濃度依賴性。見圖4 和表4。

表4 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 （±s）

表4 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 （±s）

注 ： ①與空白組比較，P ＜0.05； ②與H2O2組比較，P ＜0.05。

?

圖4 RES對H2O2處理的Gc-1 spg細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 （±s）

2.5 RES 對H2O2處理的Gc-1 spg 細(xì)胞線粒體膜電位的影響

空白組、H2O2組、H2O2+不同濃度RES 組的JC-1紅/綠熒光比值比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，與空白組比較，H2O2組細(xì)胞的JC-1 不能聚集在線粒體基質(zhì)中，表現(xiàn)為JC-1 單體（綠色熒光）、紅/綠熒光比值降低，提示線粒體膜電位明顯降低（P＜0.05），標(biāo)志著Gc-1 spg 細(xì)胞發(fā)生早期凋亡；與H2O2組比較，H2O2+5 μmol/L RES 組、H2O2+10 μmol/L RES 組、H2O2+15 μmol/L RES組JC-1 紅/綠熒光比值升高（P＜0.05），RES 預(yù)處理后能夠顯著提高細(xì)胞線粒體膜電位，說明RES 對OS損傷導(dǎo)致的Gc-1 spg 細(xì)胞線粒體膜電位具有明顯保護(hù)作用，呈濃度依賴性。見圖5 和表5。

表5 各組JC-1紅/綠熒光比值比較 （±s）

表5 各組JC-1紅/綠熒光比值比較 （±s）

注 ： ①與空白組比較，P ＜0.05； ②與H2O2組比較，P ＜0.05。

組別空白組H2O2組H2O2 + 5 μmol/L RES組H2O2 +10 μmol/L RES組H2O2 +15 μmol/L RES組F 值P 值紅/綠熒光比值2.48±0.22 0.85±0.05①1.15±0.06②1.64±0.20②1.88±0.10②54.550 0.000

圖5 RES對H2O2處理的Gc-1 spg細(xì)胞線粒體膜電位的影響 （線粒體膜電位JC-1 染色×10）

2.6 RES 對H2O2處理的Gc-1 spg 細(xì)胞線粒體的影響

空白組、H2O2組、H2O2+不同濃度RES 組的線粒體熒光強(qiáng)度比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與空白組比較，H2O2組細(xì)胞線粒體數(shù)明顯減少（P＜0.05），這表明細(xì)胞內(nèi)線粒體產(chǎn)生的ATP可能減少；與H2O2組比較，H2O2+ 5 μmol/L RES 組、H2O2+10 μmol/L RES 組、H2O2+15 μmol/L RES 組細(xì)胞熒光強(qiáng)度升高（P＜0.05），RES 預(yù)處理顯著增加了細(xì)胞線粒體數(shù)，說明RES 能夠降低OS 損傷導(dǎo)致的Gc-1 spg 細(xì)胞線粒體損傷程度，呈濃度依賴性。見圖6 和表6。

表6 各組線粒體熒光強(qiáng)度的比較 （±s）

表6 各組線粒體熒光強(qiáng)度的比較 （±s）

注 ： ①與Control組比較，P ＜0.05； ②與H2O2組比較，P ＜0.05。

組別空白組H2O2組H2O2 + 5 μmol/L RES組H2O2 + 10 μmol/L RES組H2O2 + 15 μmol/L RES組F 值P 值熒光強(qiáng)度103.95±1.53 84.64±2.96①105.90±1.34②124.70±3.69②145.82±3.40②211.077 0.000

圖6 RES對H2O2處理的Gc-1 spg細(xì)胞線粒體的影響 （Mito Tracker? Green FM 試劑盒配制染色×20）

2.7 RES對H2O2處理的Gc-1 spg細(xì)胞凋亡的影響

空白組、H2O2組、H2O2+不同濃度RES 組的細(xì)胞凋亡率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與空白組比較，H2O2組大量細(xì)胞核皺縮、碎裂，染色程度明顯增強(qiáng)（見圖7），表明細(xì)胞凋亡嚴(yán)重；與H2O2組比較，H2O2+ 5 μmol/L RES 組、H2O2+10 μmol/L RES 組、H2O2+15 μmol/L RES 組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），隨著RES 濃度增加，細(xì)胞凋亡率降低，說明RES 能夠降低OS 損傷導(dǎo)致的Gc-1 spg 細(xì)胞凋亡率。見表7。

表7 各組細(xì)胞凋亡率比較 （%，±s）

表7 各組細(xì)胞凋亡率比較 （%，±s）

注 ： ①與空白組比較，P ＜0.05； ②與H2O2組比較，P ＜0.05。

組別空白組H2O2組H2O2+ 5 μmol/L RES組H2O2+10 μmol/L RES組H2O2+15 μmol/L RES組F 值P 值細(xì)胞凋亡率5.21±0.63 36.94±0.37①26.05±0.26②23.61±0.83②21.12±0.59②1180.810 0.000

圖7 RES對H2O2處理的Gc-1 spg細(xì)胞凋亡的影響 （Hoechst 33342染色×10）

2.8 RES 對H2O2處理的Gc-1 spg 細(xì)胞凋亡蛋白的影響

空白組、H2O2組、H2O2+不同濃度RES 組的凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Bcl-2 相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與空白組比較，H2O2組凋亡蛋白Bax 和Caspase-3 相對表達(dá)量均增加（P＜0.05），Bcl-2 相對表達(dá)量減少（P＜0.05）；與H2O2組比較，H2O2+ 5 μmol/L RES 組、H2O2+10 μmol/L RES 組、H2O2+15 μmol/L RES 組Bax 和Caspase-3 相對表達(dá)量降低（P＜0.05），Bcl-2 相對表達(dá)量增加（P＜0.05），說明RES 在Gc-1 spg 細(xì)胞OS 損傷中有明顯的抗凋亡作用，且呈濃度依賴性。見圖8 和表8。

表8 各組凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Bcl-2相對表達(dá)量比較 （±s）

表8 各組凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Bcl-2相對表達(dá)量比較 （±s）

注 ： ①與空白組比較，P ＜0.05； ②與H2O2組比較，P ＜0.05。

組別空白組H2O2組H2O2+5 μmol/L RES組H2O2+10 μmol/L RES組H2O2+15 μmol/L RES組F值P值Bax 1.02±0.02 2.12±0.11①1.36±0.04②1.30±0.06②1.25±0.01②133.796 0.000 Caspase-3 1.01±0.01 2.57±0.03①2.14±0.02②1.90±0.01②1.70±0.00②5427.006 0.000 Bcl-2 1.10±0.00 0.25±0.02①0.30±0.03 0.81±0.08②1.34±0.01②372.422 0.000

圖8 RES對H2O2處理的Gc-1 spg細(xì)胞凋亡蛋白的影響

3 討論

精子發(fā)生過程需要一個(gè)相對穩(wěn)定的氧化環(huán)境來維持生殖細(xì)胞發(fā)育和分化，這是精子能夠正常受精的前提[6]。位于生精上皮基底層的精原細(xì)胞是精子的前體細(xì)胞，容易受到OS 損傷，過量ROS 及抗氧化防御水平降低會導(dǎo)致生殖細(xì)胞OS 損傷和凋亡[7]，進(jìn)而引發(fā)不育。H2O2可引起細(xì)胞OS 損傷的情況不同。董曉蕾等[8]用600 μmol/L H2O2處理Gc-1 spg 細(xì)胞24 h復(fù)制OS 損傷細(xì)胞模型，李美和等[9]用300 μmol/L H2O2處理人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞3 h 復(fù)制OS 損傷細(xì)胞模型。本研究用800 μmol/L H2O2處理Gc-1 spg 細(xì)胞6 h復(fù)制細(xì)胞OS 模型，能較好地體現(xiàn)RES 的保護(hù)作用，這與既往研究存在差異，可能和作用時(shí)間不同有關(guān)。SOD 和GSH-Px 是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶，能夠反映機(jī)體氧化還原平衡狀態(tài)。LDH 是一種糖酵解酶，當(dāng)細(xì)胞膜發(fā)生損傷時(shí)，LDH 從細(xì)胞內(nèi)漏出；MDA 是細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，可加重細(xì)胞膜損傷，兩者均反應(yīng)細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷程度。精子在附睪成熟過程中，暴露于大量氧化應(yīng)激源，這些氧化應(yīng)激源被附睪上皮積極分泌的一系列附睪抗氧化分子抵消，包括過氧化物酶、GSH-Px 和硫氧還蛋白，以及精子膜上特別是頂體、頂體后區(qū)域和鞭毛上的SOD 等，其共同促進(jìn)ROS 產(chǎn)生和減少或清除之間的平衡，以允許正常受精[10]。因此，在精子發(fā)生過程中，維持抗氧化酶活性在男性正常受精和妊娠中至關(guān)重要。

降低生殖細(xì)胞OS 反應(yīng)可有效增強(qiáng)生殖細(xì)胞活力。RES 是植物多酚類化合物中抗氧化能力最強(qiáng)的物質(zhì)之一，具有清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、調(diào)節(jié)相關(guān)酶活性及基因表達(dá)等作用[11]，但不同細(xì)胞對其的耐受存在差異。有研究表明，10 μmol/L 以上濃度RES 會對人永生化表皮細(xì)胞活性產(chǎn)生影響[12]，50 μmol/L 濃度RES 對H2O2導(dǎo)致的精子細(xì)胞OS 損傷保護(hù)作用最佳[13]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)RES 濃度大于20 μmol/L 時(shí)對Gc-1 spg 細(xì)胞活力產(chǎn)生影響，故本研究采用低于20 μmol/L 以下濃度作為保護(hù)濃度。Gc-1 spg 細(xì)胞經(jīng)不同濃度H2O2處理4、6、8、10 h 后均能不同程度地降低細(xì)胞活力，而5、10、15 μmol/L 濃度RES 預(yù)處理24 h 均能夠抵抗H2O2導(dǎo)致的Gc-1 spg細(xì)胞OS 損傷，且呈濃度依賴性，這和既往研究結(jié)果一致[12]。此外，H2O2處理能夠顯著降低Gc-1 spg 細(xì)胞內(nèi)SOD 和GSH-Px 活性并增加MDA 和LDH 水平，而RES 預(yù)處理能夠不同程度地逆轉(zhuǎn)上述反應(yīng)，并呈濃度依賴性，表明RES 具有抗Gc-1 spg 細(xì)胞OS 損傷的能力，提示RES 可能在精子形成的任何一個(gè)過程中提高細(xì)胞抗氧化酶活性并發(fā)揮抗氧化作用，從而預(yù)防和治療男性不育。

線粒體是精子細(xì)胞內(nèi)重要的供能細(xì)胞器，通過氧化磷酸化產(chǎn)生超過90%的能量，在維持細(xì)胞正常的生理活動中起重要作用。OS 會損傷線粒體導(dǎo)致線粒體功能異常進(jìn)而影響精子細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能[14]，導(dǎo)致男性不育，但精子也需要線粒體產(chǎn)生足夠量的ROS 進(jìn)行獲能，并在精子發(fā)生和附睪成熟期間對精子染色質(zhì)和鞭毛蛋白進(jìn)行修飾[15]。因此，防止精子細(xì)胞線粒體損傷和恢復(fù)受損線粒體是治療男性不育的關(guān)鍵。線粒體膜電位能較好地反映線粒體功能，其下降是精子細(xì)胞凋亡的早期信號。研究表明，H2O2誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和TM3 睪丸間質(zhì)細(xì)胞OS 和線粒體損傷，而RES 具有顯著的保護(hù)作用[16-17]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，H2O2組Gc-1 spg 細(xì)胞線粒體膜電位顯著下降，紅/綠熒光比值顯著降低，提示H2O2誘導(dǎo)Gc-1 spg 細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，線粒體損傷嚴(yán)重，細(xì)胞能量水平顯著降低。RES 預(yù)處理能明顯提高Gc-1 spg 細(xì)胞線粒體膜電位，改善線粒體損傷并可能提高細(xì)胞內(nèi)能量水平，這種保護(hù)作用與RES 濃度有關(guān)。線粒體染色也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果，這更能說明RES 在H2O2誘導(dǎo)的Gc-1 spg 細(xì)胞線粒體損傷中的保護(hù)作用。

Hoechst 33342 是一種能穿透細(xì)胞膜的染料，能夠進(jìn)入細(xì)胞核DNA，正常情況下呈藍(lán)色，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，膜通透性增強(qiáng)，染色體DNA 發(fā)生改變，染料大量進(jìn)入，細(xì)胞核呈現(xiàn)亮藍(lán)色。本研究結(jié)果顯示，H2O2處理的Gc-1 spg 細(xì)胞出現(xiàn)大量的細(xì)胞核凋亡，而RES 低、中、高濃度組中細(xì)胞核凋亡率隨藥物濃度的增大逐漸減小，表明RES 能夠改善H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞核凋亡。Bax 和Bcl-2 是調(diào)節(jié)線粒體功能及線粒體膜對細(xì)胞色素C 通透性的重要分子，前者能夠形成同源二聚體并定位于線粒體膜，增加線粒體膜對細(xì)胞色素C 的通透性，進(jìn)入胞質(zhì)的細(xì)胞色素C 能夠激活Caspase-3 并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，后者能夠與Bax形成異源二聚體并抑制Bax 的促凋亡作用[18]。研究表明，50 μmol/L 濃度RES 可增強(qiáng)卵泡顆粒細(xì)胞的抗氧化及抗凋亡能力，改善卵泡顆粒細(xì)胞功能并提高妊娠率[19]。本研究表明，H2O2處理能顯著增加細(xì)胞Bax、Caspase-3 表達(dá)并抑制Bcl-2 表達(dá)水平，而RES預(yù)處理后細(xì)胞中Bcl-2 的表達(dá)顯著增高，Bax、Caspase-3 的表達(dá)顯著降低，且該效果與RES 濃度存在密切關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步表明RES 能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的Gc-1 spg 細(xì)胞凋亡。

綜上所述，H2O2處理能降低Gc-1 spg 細(xì)胞活力，并誘導(dǎo)細(xì)胞OS 損傷及凋亡，降低細(xì)胞的抗氧化能力和線粒體膜電位，損傷線粒體增加細(xì)胞凋亡率，這將會影響精子發(fā)生過程，損傷精子細(xì)胞并降低精子活力，進(jìn)而導(dǎo)致男性不育。一定濃度的RES 能夠保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的Gc-1 spg 細(xì)胞OS 損傷，提高生殖細(xì)胞活力，有望成為抗生殖損傷新藥。后續(xù)將進(jìn)一步研究RES 在H2O2誘導(dǎo)的Gc-1 spg 細(xì)胞OS 損傷保護(hù)作用中的分子機(jī)制，為臨床治療生殖細(xì)胞OS 及線粒體損傷相關(guān)疾病提供理論依據(jù)。