鐘妮爾,楊 光,安慧仙

(1陜西省人民醫(yī)院心血管內(nèi)二科,西安 710068;2西安國際醫(yī)學中心醫(yī)院心內(nèi)二科;*通訊作者,E-mail:anhuixian6789@163.com)

急性心肌梗死是一種常見的冠心病,具有非常高的致死和致殘率[1]。近年來,隨著生活水平的提高和老年人口的增加,急性心肌梗死的發(fā)病率普遍升高,給家庭和社會都帶來了沉重的負擔[2]。冠狀動脈急性或慢性狹窄或堵塞,可導致供血區(qū)的心肌細胞缺血缺氧,進而發(fā)生細胞壞死,引起心臟功能異常[3]。采用再灌注手段立即恢復心肌供血,是治療心肌梗死的主要方法。但是,缺血心肌恢復血液灌注后,會產(chǎn)生第二次損傷,臨床上稱之為心肌缺血再灌注損傷[4]。心肌缺血再灌注損傷是一個復雜的病理變化過程,涉及心肌細胞凋亡和氧化應激等不良細胞過程[5]。心肌缺血再灌注會導致多個基因異常表達,從而影響心肌細胞凋亡和氧化應激等過程[6]。因此,探尋對心肌缺血再灌注損傷具有調(diào)控作用的新基因,對開發(fā)有效的臨床治療方法可提供重要的理論基礎和靶標分子。

PI3K/Akt信號通路是目前研究比較廣泛的一個信號通路,可參與調(diào)控多種細胞過程,其異常調(diào)控與多種疾病的發(fā)生密切相關[7,8]。PI3K具有磷脂酰肌醇激酶的活性,可將二磷酸磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)化為三磷酸磷脂酰肌醇。三磷酸磷脂酰肌醇作為第二信使,可招募Akt至細胞膜內(nèi)側(cè),使其磷酸化,從而激活Akt下游通路[9]。越來越多的研究表明,PI3K/Akt信號通路在心肌缺血再灌注損傷中具有重要的調(diào)控作用[10]。在缺血再灌注損傷的心肌組織中,PI3K/Akt信號通路活性下調(diào);而上調(diào)PI3K/Akt信號通路活性可以抑制心肌細胞凋亡,緩解氧化應激反應,對心肌缺血再灌注損傷具有良好的保護效應[11]。因此,深入探討PI3K/Akt信號通路的調(diào)控機制,鑒定可調(diào)控PI3K/Akt信號通路的新分子,對于心肌缺血再灌注損傷具有非常重要的意義。

序列相似性家族3A蛋白(family with sequence similarity 3 member A, FAM3A)是FAM家族的一員,具有廣泛的組織細胞表達模式,與胚胎發(fā)育密切相關[12]。FAM3A是一種線粒體蛋白,可以增加ATP的產(chǎn)生和分泌[13]。FAM3A可以維護正常的線粒體跨膜電位,減少線粒體活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生,抑制線粒體的腫脹,在維持線粒體的正常功能中發(fā)揮重要作用[14]。FAM3A可調(diào)控糖原和脂肪的生成,在代謝異常相關的疾病中發(fā)揮重要作用[13,15,16]。另外,FAM3A具有細胞保護作用,可減輕細胞受到的高糖損傷、炎癥損傷以及谷氨酸毒性損傷[17-19]。值得注意的是,FAM3A對大腦和肝臟器官的缺血再灌注損傷,具有良好的保護作用[20,21]。關于FAM3A在心肌缺血再灌注損傷中作用,目前研究甚少。本項目通過心肌細胞的低氧/復氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型來模擬體內(nèi)心肌缺血再灌注損傷,研究FAM3A過表達對H/R誘導的心肌細胞損傷的調(diào)控作用,并闡明可能的分子作用機制,對FAM3A在心肌缺血再灌注損傷的作用進行初步探討。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

小鼠HL-1心肌細胞購自北京BeNa Culture Collection公司;DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自武漢Procell生命科技有限公司;CCK-8試劑盒、LDH試劑盒、TUNEL試劑盒和和SOD試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司;ROS試劑盒和MDA試劑盒購自沈陽萬類生物科技有限公司;TransIntro EL轉(zhuǎn)染試劑、RNA提取試劑TransZol、First-Strand cDNA合成試劑盒、Green qPCR SuperMix、蛋白提取試劑盒和蛋白濃度測定試劑盒購自北京全式金生物科技有限公司;兔抗鼠FAM3A、Bcl-2、Bax、α-actin抗體和HRP標記的山羊抗兔二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司;兔抗鼠cleaved Caspase-3抗體購自北京博奧森科技有限公司;兔抗鼠Akt和p-Akt抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;兔抗鼠p-PI3K和PI3K抗體購自江蘇親科生物研究中心有限公司;PI3K抑制劑LY294002購自上海Selleck公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 心肌細胞H/R模型建立 小鼠HL-1心肌細胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中,并添加10%的胎牛血清,置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將心肌細胞置于含1% O2、5% CO2和94% N2的厭氧培養(yǎng)箱中,37 ℃孵育6 h。然后,將心肌細胞轉(zhuǎn)移至含5% CO2和95%空氣的常氧培養(yǎng)箱中,37 ℃孵育12 h。常氧對照組細胞置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染和分組 構(gòu)建表達小鼠FAM3A基因的重組載體pcDNA3.1-FAM3A。將HL-1心肌細胞接種于24孔板,置于常氧培養(yǎng)箱中孵育。待細胞融合度達到80%左右,采用TransIntro EL轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至心肌細胞。將轉(zhuǎn)染細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h,進行后續(xù)實驗。

分組一:為了研究FAM3A對H/R損傷的調(diào)控作用,將細胞分為常氧組、H/R組、H/R+空載體組和H/R+FAM3A載體組。常氧組心肌細胞在常氧條件下培養(yǎng);H/R組心肌細胞低氧培養(yǎng)6 h,然后常氧培養(yǎng)12 h;H/R+空載體組心肌細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體,然后進行H/R處理;H/R+FAM3A載體組心肌細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-FAM3A,然后進行H/R處理。

分組二:為了驗證FAM3A通過PI3K/Akt信號通路減輕H/R損傷,將細胞分為常氧組、H/R+空載體組、H/R+FAM3A載體組和H/R+FAM3A載體+LY294002(PI3K/Akt抑制劑)組,LY294002的處理濃度為20 μmol/L。

1.2.3 RT-qPCR檢測FAM3A的mRNA表達 按1.2.2分組一處理心肌細胞,采用TransZol試劑盒抽提細胞總RNA,采用First-Strand cDNA合成試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板,加入Green qPCR SuperMix和正反向引物,加去離子水補至20 μl反應體系。采用PCR反應條件:94 ℃,30 s;然后94 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。以α-actin為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt公式計算靶基因的相對表達水平。FAM3A正向引物序列為5′-GGCCCTAATCATCATTATGGGTC-3′,反向引物序列為5′-TGCAGTCACTGAGTTCTCTGG-3′。α-actin正向引物序列為5′-CCCAAAGCTAACCGGGAGAAG-3′,反向引物序列為5′-CCAGAATCCAACACGATGCC-3′。

1.2.4 Western blotting檢測FAM3A、Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、PI3K和Akt的蛋白表達 按1.2.2分組一處理心肌細胞,提取細胞蛋白,測定蛋白濃度,采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠中分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將膜浸入5%脫脂奶粉中,室溫封閉1 h。加入一抗稀釋液(FAM3A抗體稀釋度為1∶500,Bax抗體稀釋度為1∶2 000,Bcl-2抗體稀釋度為1∶2 000,p-Akt抗體稀釋度為1∶2 000,Akt抗體稀釋度為1∶1 000,p-PI3K抗體稀釋度為1∶1 000,PI3K抗體稀釋度為1∶1 000),4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜,加入二抗稀釋液(稀釋度為1∶5 000),室溫孵育1 h。采用ECL試劑進行顯色,將膜放入凝膠成像儀,采集圖像。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞生存率 將心肌細胞接種到96孔板,按1.2.2分組一處理。待處理完成,每孔中加入10 μl CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2 h,采用酶標儀測定細胞溶液在450 nm波長處的吸光度。

1.2.6 LDH法檢測細胞損傷 將心肌細胞接種到24孔板,按1.2.2分組一處理。待處理完成,吸取細胞上清液,轉(zhuǎn)移到96孔培養(yǎng)板。每孔中加入60 μl LDH檢測工作液,混勻、室溫避光孵育30 min。采用酶標儀測定溶液在490 nm處測定吸光度。

1.2.7 TUNEL法檢測細胞凋亡 將心肌細胞接種到蓋玻片上,按1.2.2分組處理。待處理完成,采用4%多聚甲醛固定細胞。PBS洗滌細胞,加入含0.3% Triton X-100的PBS,進行透化處理。PBS洗滌細胞,每孔加入50 μl TUNEL檢測液,于37 ℃避光孵育60 min。PBS洗滌細胞,加入DAPI溶液復染細胞核,室溫避光孵育10 min。采用抗熒光淬滅封片液封片,在熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.2.8 DCFH-DA探針檢測ROS水平 將心肌細胞接種到24孔板,按1.2.2分組處理。待處理完成,吸棄培養(yǎng)液,加入含有DCFH-DA探針的無血清培養(yǎng)基,置于細胞培養(yǎng)箱中孵育30 min。采用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞,然后采用熒光酶標儀檢測熒光強度。

1.2.9 MDA試劑盒檢測MDA含量 將心肌細胞接種到24孔板,按1.2.2分組一處理。待處理完成,吸棄培養(yǎng)液,加入PBS作為勻漿介質(zhì)破碎細胞。離心取上清,加入MDA檢測試劑,漩渦混勻,95 ℃沸水浴40 min。取出后流水冷卻,離心取上清,采用酶標儀測定溶液在532 nm處的吸光度。

1.2.10 SOD試劑盒檢測SOD活性 將心肌細胞接種到24孔板,按1.2.2分組一處理。待處理完成,吸棄培養(yǎng)液,加入SOD制備液,裂解細胞。吸取上清液,轉(zhuǎn)移到96孔培養(yǎng)板,加入酶工作液和反應啟動液混勻,置于37 ℃孵育30 min,采用酶標儀測定溶液在450 nm處的吸光度。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 H/R處理降低FAM3A在心肌細胞中的表達

RT-qPCR結(jié)果顯示,與常氧組相比,H/R組FAM3A的mRNA表達水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,見圖1A)。Western blotting結(jié)果顯示,與常氧組比較,H/R組FAM3A蛋白表達量減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,見圖1B)。

與常氧組比較,**P<0.01

A.RT-qPCR檢測FAM3A的mRNA表達水平B.Western blotting檢測FAM3A的蛋白表達水平

2.2 過表達FAM3A可提高H/R處理的心肌細胞的存活率

與H/R+空載組比較,H/R+FAM3A載體組FAM3A的mRNA和蛋白表達水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,見圖2)。CCK-8實驗結(jié)果顯示,與常氧組比較,H/R組心肌細胞的存活率顯著降低;與H/R組和H/R+空載組比較,H/R+FAM3A載體組心肌細胞存活率顯著提高(P<0.01,見圖3A)。LDH細胞毒性實驗結(jié)果顯示,與常氧組比較,H/R組LDH活性顯著升高;與H/R組和H/R+空載組比較,H/R+FAM3A載體組LDH活性顯著降低(P<0.01,見圖3B)。

2.3 過表達FAM3A減輕H/R誘導的心肌細胞凋亡

TUNEL實驗結(jié)果顯示,與常氧組比較,H/R組心肌細胞凋亡率顯著增加;與H/R組和H/R+空載組比較,H/R+FAM3A載體組心肌細胞凋亡凋亡率顯著下降(P<0.01,見圖4A)。Western blotting實驗結(jié)果顯示,與常氧組比較,H/R組cleaved Caspase-3和Bax蛋白表達水平顯著升高,而Bcl-2蛋白表表達水平顯著降低;與H/R組和H/R+空載組比較,H/R+FAM3A載體組cleaved Caspase-3和Bax蛋白水平顯著減少,而Bcl2蛋白表表達水平顯著顯著增加(P<0.01,見圖4B)。

B.Western blotting檢測cleaved Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白水平

2.4 過表達FAM3A減輕H/R誘導的心肌細胞的氧化應激

與常氧組比較,H/R組ROS水平顯著升高,MDA含量顯著增加,SOD活性顯著降低;與H/R組和H/R+空載組比較,H/R+FAM3A載體組ROS水平顯著降低,MDA含量顯著減少,SOD活性顯著升高(均P<0.01,見圖5)。

2.5 過表達FAM3A激活PI3K/Akt信號通路

Western blotting實驗結(jié)果顯示,與常氧組比較,H/R組PI3K和Akt的磷酸化水平顯著降低;與H/R組和H/R+空載組比較,H/R+FAM3A載體組PI3K和Akt的磷酸化水平顯著升高(均P<0.01,見圖6)。

與常氧組比較,**P<0.01;與H/R組和H/R+空載體組比較,&&P<0.01

2.6 抑制PI3K/Akt信號通路逆轉(zhuǎn)FAM3A介導的心肌細胞保護作用

與常氧組比較,H/R+空載組心肌細胞凋亡率顯著增加,ROS水平顯著升高(均P<0.01,見圖7)。與H/R+空載組比較,H/R+FAM3A載體組心肌細胞凋亡率顯著降低,ROS水平顯著下降(均P<0.01,見圖7)。與H/R+FAM3A載體組比較,H/R+FAM3A+LY294002組心肌細胞凋亡率顯著增加,ROS水平顯著升高(P<0.01,見圖7)。

與常氧組比較,**P<0.01;與H/R+空載體組比較,&&P<0.01;與H/R+FAM3A載體組比較,@@P<0.01

3 討論

缺血再灌注會導致心肌組織中大量基因異常表達,引起多種信號通路的異常調(diào)控,促進心肌損傷病理的進展過程。鑒定心肌缺血再灌注損傷中異常表達的新基因,研究其對心肌損傷的調(diào)控作用,是目前研究的熱點方向。這些研究可為研發(fā)心肌缺血再灌注損傷的新型治療方法提供重要的理論基礎和靶標分子。本項目通過心肌缺血再灌注損傷的體外模型,即H/R心肌細胞損傷模型,發(fā)現(xiàn)FAM3A在H/R處理的心肌細胞中表達下調(diào)。進一步的細胞功能學實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達FAM3A通過激活PI3K/Akt信號通路減輕H/R誘導的心肌細胞損傷,表明FAM3A可能是心肌缺血再灌注損傷的一個重要調(diào)控分子。

既往研究發(fā)現(xiàn),FAM3A參與調(diào)控一些器官的缺血再灌注損傷。在小鼠中敲除FAM3A可加劇缺血再灌注誘導的肝損傷[20]。在小鼠后肢缺血模型中,過表達FAM3A可促進內(nèi)皮血管的新生,減輕缺血損傷[22]。另外,過表達FAM3A還可以減輕缺血再灌注對腦組織損傷,顯著改善神經(jīng)認知功能[23]。本項目通過心肌細胞H/R模型,探討了FAM3A對心肌缺血再灌注損傷可能的調(diào)控作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達FAM3A可有效抑制H/R誘導的心肌細胞損傷,表明FAM3A極可能參與調(diào)控心肌缺血再灌注損傷過程。值得注意的是,最新發(fā)表的文獻表明FAM3A直接參與心肌缺血再灌注損傷[24]。該文獻中報道,與野生型小鼠比較,FAM3A敲除的小鼠在受到心肌缺血再灌注損傷時,其死亡率增加,心肌梗死面積更大,心臟收縮功能下降更為明顯[24]。因此,結(jié)合本研究實驗結(jié)果可以更明確地證明FAM3A參與調(diào)控心肌缺血再灌注損傷。

FAM3A具有抗凋亡和抗氧化作用,可減輕細胞受到的有害損傷。在HT22神經(jīng)元細胞中,過表達FAM3A可減輕過氧化氫誘導的細胞損傷、凋亡和ROS產(chǎn)生[25]。過表達FAM3A還可減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的神經(jīng)元細胞凋亡[14]。在PC-12神經(jīng)元細胞中,過表達FAM3A可減輕谷氨酸誘導的細胞凋亡和氧化應激[19]。敲除血管內(nèi)皮細胞中FAM3A可加劇高糖誘導的細胞凋亡和氧化應激[17]。另外,過表達FAM3A可減少H/R誘導的肝細胞凋亡[20]。本項目通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術來實現(xiàn)FAM3A在心肌細胞中過表達,以此來研究FAM3A對H/R誘導的心肌損傷的調(diào)控作用。與以往的研究報道一致,本研究表明FAM3A過表達可減輕H/R誘導的心肌細胞凋亡和氧化應激,進一步證實FAM3A是一個具有細胞保護作用的基因。因此,本研究證實FAM3A在H/R損傷的心肌細胞中發(fā)揮保護作用。

FAM3A是PI3K/Akt信號通路的重要調(diào)控分子。據(jù)報道,FAM3A可提高PI3K的催化活性,從而促進Akt的激活[13]。FAM3A通過激活Akt促進脂肪細胞中的脂肪合成[16]。過表達FAM3A可通過激活PI3K/Akt信號通路,提高細胞在不利環(huán)境下的存活率[18,20]?？紤]到PI3K/Akt信號通路在H/R誘導的心肌細胞損傷中也發(fā)揮關鍵作用[26],本項目進一步研究了FAM3A是否調(diào)控H/R處理的心肌細胞中的PI3K/Akt信號通路。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),FAM3A過表達可顯著上調(diào)PI3K和Akt的蛋白磷酸化水平,說明FAM3A可促進PI3K/Akt信號通路的激活。進一步研究發(fā)現(xiàn),抑制PI3K/Akt信號通路則顯著逆轉(zhuǎn)FAM3A過表達對H/R心肌細胞的保護作用。因此,本項目證實了FAM3A通過激活PI3K/Akt信號通路來減輕H/R誘導的心肌細胞損傷。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)FAM3A參與調(diào)控H/R誘導的心肌細損傷,其作用機制主要通過激活PI3K/Akt信號通路來發(fā)揮抗凋亡和抗氧化應激作用。通過靶向FAM3A抑制心肌細胞損傷,可作為心肌缺血再灌注損傷的一個潛在治療策略。但是,本研究關于FAM3A的作用是通過體外H/R細胞模式得到的,存在一定的局限性。因此,關于FAM3A在心肌缺血再灌注損傷的明確作用和機制,需要通過動物模型的體內(nèi)實驗進一步地研究和驗證。