王 穩(wěn) 馬軍霞 崔秀娟 田翔宇

（1.滕州市中心人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 棗莊，277599；2.滕州市中心人民醫(yī)院計(jì)生辦，山東 棗莊，277599；3.滕州市中心人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像中心，山東 棗莊，277599）

由于缺乏有效的早期篩查手段，上皮性卵巢癌（Epithelial Ovarian Cancer，EOC）大多在處于廣泛盆腹腔轉(zhuǎn)移的晚期被發(fā)現(xiàn)，因早期無特異性臨床表現(xiàn)，病死率在所有女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中位居第一。越來越多的研究表明，在EOC的發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過程中，血管生成發(fā)揮著極其重要的作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（ Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）是由單一基因編碼的同源二聚體糖蛋白，具有促進(jìn)血管通透性增加等作用，是目前發(fā)現(xiàn)促血管生成作用最強(qiáng)的血管生成因子[1]。

腫瘤血管生成涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial cell，EC）、細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）以及腫瘤細(xì)胞等之間的相互作用，過程尤為復(fù)雜，其中調(diào)節(jié)VEGF的重要因素包括：缺氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia inducing factor 1，2，HIF-1，HIF-2）、環(huán)氧化酶（Cyclo-oxygenase，COX）以及促性腺激素等[2-5]。最新的分子生物學(xué)研究表明，在腫瘤免疫逃逸過程中，VEGF和HIF-1/2等血管生成相關(guān)因子發(fā)揮了決定性作用[6]。EOC惡性程度高，早期難以發(fā)現(xiàn)，本文研究者進(jìn)行該試驗(yàn)，擬分析VEGF、HIF-1α以及MVD在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，評(píng)估相關(guān)指標(biāo)在血管形成中發(fā)揮的作用，分析其與上皮性卵巢癌臨床指標(biāo)間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究材料

收集2012年1月—2017年12月滕州市中心人民醫(yī)院收治的46例EOC患者的臨床資料，以及同期因子宮肌瘤等良性疾病切除卵巢的39例患者的正常卵巢組織。所有EOC標(biāo)本均經(jīng)滕州市中心人民醫(yī)院經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)專家進(jìn)行病理分析證實(shí)，并根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）對(duì)組織學(xué)類型和分級(jí)進(jìn)行評(píng)估[7]。本研究已被滕州市中心人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①EOC組織學(xué)亞型為漿液性、粘液性、透明細(xì)胞癌和子宮內(nèi)膜樣癌；②所有EOC患者在初次手術(shù)前均未進(jìn)行新輔助化療或放療；③滕州市中心人民醫(yī)院規(guī)范治療，病理科保存石蠟標(biāo)本；④隨訪5年以上。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①轉(zhuǎn)移性卵巢腫瘤；②外院手術(shù)治療；③術(shù)前接受放化療。臨床病理特征包括年齡、分期、組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

1.3 研究方法

按照說明書提供的方案進(jìn)行免疫組化染色，先經(jīng)室溫脫蠟、水化處理，再用Tris-EDTA緩沖液（pH=9.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，封閉采用含5%山羊血清TBS，室溫孵育1.5 h，經(jīng)二抗孵育、顯色、復(fù)染、脫水、封片，最后進(jìn)行圖像采集。測(cè)定 VEGF和HIF-1α在EOC和正常卵巢組織中的表達(dá)情況，利用CD34對(duì)新生血管的微血管密度（MVD）進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估相關(guān)指標(biāo)在血管形成中發(fā)揮的作用，分析其與EOC臨床指標(biāo)間的關(guān)系。VEGF抗體（VEGFA Polyclonal antibody，生產(chǎn)企業(yè)：武漢Proteintech生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：19003-1-AP）、HIF-1α抗體（HIF-1 alpha Polyclonal antibody，生產(chǎn)企業(yè)：武漢Proteintech生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：20960-1-AP）和CD34抗體（CD34 Polyclonal antibody，生產(chǎn)企業(yè)：武漢Proteintech生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：14486-1-AP）。臨床預(yù)后的測(cè)量指標(biāo)為中生存期（Overall Survival，OS），指術(shù)后第1天至死亡的時(shí)間，未出現(xiàn)事件的為截尾數(shù)據(jù)。

1.4 結(jié)果判定

（1）組織化學(xué)評(píng)分（Histochemistry Score，H-Score）：H-Score是一種半定量處理免疫組織化學(xué)結(jié)果的方法，同時(shí)考慮特異性染色的分布和強(qiáng)度。目視染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，按0（無染色）、1（弱染色）、2（中度染色）、3（強(qiáng)染色）分層，以陽性腫瘤細(xì)胞占百分比的比例評(píng)分，將百分比和強(qiáng)度評(píng)分相乘，得到每個(gè)病例的最終組織化學(xué)評(píng)分。H-Score的公式為：H-Score=∑（pi×i），其中i=染色強(qiáng)度，pi=染色腫瘤細(xì)胞的百分比，最終得分范圍為0～300。高分值組的VEGF和HIF-1α表達(dá)水平等于或超過中位數(shù)，低分值組的VEGF和HIF-1α表達(dá)水平低于中位數(shù)。染色切片由兩名觀察員在光學(xué)顯微鏡下盲法檢查和評(píng)分，所有切片均由兩名觀察員和一名病理學(xué)專家獨(dú)立評(píng)分，對(duì)病理和臨床特征不知情。

（2）CD34與MVD的測(cè)定：參照微血管計(jì)數(shù)方法，新生血管定義為與鄰近的微血管及腫瘤組織有明確的邊界，染色呈棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)不相連可能來源于一個(gè)新生血管時(shí)，也作為一血管計(jì)數(shù)。管腔結(jié)構(gòu)不作為判定的必要條件，管腔較大且有較厚肌層的成熟血管結(jié)構(gòu)需排除在外。在低倍鏡視野中，選取3個(gè)微血管密集度區(qū)為血管熱點(diǎn)，然后在高倍鏡視野下計(jì)數(shù)所有的微血管，將3個(gè)數(shù)值的平均數(shù)作為MVD。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Fisher精確試驗(yàn)評(píng)價(jià)VEGF、HIF-1α、MVD表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系；log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析；Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)行預(yù)后分析；所有結(jié)果均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。

2 結(jié)果

2.1 EOC患者臨床資料

VEGF、HIF-1α及MVD與EOC患者臨床病理特征的相關(guān)性，見表1。研究結(jié)果表明，EOC患者腫瘤組織中VEGF、HIF-1α和MVD的表達(dá)與FIGO分期、病理學(xué)分級(jí)和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與年齡、組織學(xué)

表1 EOC患者臨床病理特征與VEGF、HIF-1α和MVD表達(dá)的關(guān)系

2.2 EOC以及正常卵巢組織中VEGF、HIF-1α、MVD的表達(dá)

VEGF著色于細(xì)胞漿，HIF-1α在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中同時(shí)出現(xiàn)，研究顯示，細(xì)胞核內(nèi)的HIF-1α具有轉(zhuǎn)錄活性，以棕黃色染色出現(xiàn)在細(xì)胞核為陽性。研究結(jié)果顯示，VEGF和HIF-1α在EOC組織中的免疫組化染色強(qiáng)度和百分比明顯高于正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。通過免疫組化分析CD34的表達(dá)，根據(jù)Weidner法評(píng)估MVD，結(jié)果顯示，與正常卵巢組織相比，EOC組織中MVD的平均值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2及圖1。

圖1 EOC及正常卵巢組中VEGF、HIF-1α、MVD的表達(dá)

圖2 VEGF、HIF-1α、MVD的表達(dá)與OS的關(guān)系

表2 EOC及正常卵巢組織中VEGF、HIF-1α、MVD的表達(dá)

VEGF、HIF-1α和CD34在正常卵巢組織和EOC腫瘤組織中的免疫組化染色結(jié)果（放大倍數(shù)：400X），a、b：VEGF和HIF-1α在EOC組織中的免疫組化染色度和百分比明顯高于正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；c：與正常卵巢組織相比，EOC組織中MVD的平均值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 VEGF、HIF-1α、MVD的表達(dá)與OS的關(guān)系

根據(jù)VEGF和HIF-1α表達(dá)的免疫組化評(píng)分，將46例EOC患者分為高分組和低分組進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析。結(jié)果顯示，VEGF、HIF-1α、MVD高分組患者的總體生存概率明顯低于低分組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨訪結(jié)束時(shí)，VEGF低表達(dá)組有超過半數(shù)的患者仍然存活，因此不計(jì)算中位生存時(shí)間，而VEGF高表達(dá)組患者中位生存時(shí)間為28個(gè)月（HR=0.081，95%CI：0.035～0.186，P＜0.001）。HIF-1α高表達(dá)組和低表達(dá)組中位生存時(shí)間分別為28個(gè)月和48個(gè)月（HR=0.259，95%CI：0.123～0.547，P＜0.001）。MVD高表達(dá)組和低表達(dá)組中位生存時(shí)間分別為28.5個(gè)月和41個(gè)月（HR=0.347，95%CI：0.162～0.742，P=0.006）。

生存分析研究結(jié)果顯示，VEGF、HIF-1α、MVD的表達(dá)與EOC患者的預(yù)后明顯相關(guān)，高表達(dá)組預(yù)后更差。

3 討論

血管生成與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系，顯著影響患者的預(yù)后，因此，在腫瘤治療的領(lǐng)域里，抗血管生成已成為不可或缺的手段之一。細(xì)胞黏附因子（Cell Adhesion Molecule，CAM）可以降低自然殺傷（Natural Killer cell，NK）細(xì)胞的毒性，有助于異位組織逃避機(jī)體的免疫攻擊，從而促進(jìn)血管生成。血管內(nèi)皮細(xì)胞參與機(jī)體的免疫活動(dòng)，血管生成因子可以通過提高內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖能力促進(jìn)血管生成，抑制該過程可以使腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯降低。

VEGF主要集中在腫瘤血管周圍分泌，反應(yīng)較正常血管更高，表明VEGF在腫瘤血管的生成過程中發(fā)揮著重要作用。多數(shù)腫瘤細(xì)胞VEGF均高水平表達(dá)，且與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。人黑色素瘤細(xì)胞經(jīng)VEGF基因轉(zhuǎn)染后，可分泌大量的VEGF，腫瘤血管生成的數(shù)目和結(jié)構(gòu)均隨之發(fā)生了正性變化[8]。另有研究顯示，血管生成能力隨著上皮性卵巢惡性程度的進(jìn)展而逐漸增強(qiáng)[9]。缺氧可以明顯調(diào)控VEGF的生成，直徑大于2 mm的實(shí)體腫瘤會(huì)因缺氧導(dǎo)致壞死，因此，為獲取血液供應(yīng)需要誘導(dǎo)新的血管生成[2-5]。Peer等[10]進(jìn)行的細(xì)胞試驗(yàn)表明，VEGF的表達(dá)水平在缺氧條件下異常升高。另有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)域存在HIF-1結(jié)合位點(diǎn)[11]。此外，VEGF還受如白細(xì)胞介素-8（IL-8）、表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal Growth Factor，EGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（Transforming Growth Factor，TGF）、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GMCSF）等非血管特異性生長(zhǎng)因子的調(diào)控。有研究表明，在缺氧發(fā)生時(shí)，HIF-1可結(jié)合VEGF轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上的缺氧增強(qiáng)子序列，從而啟動(dòng)或增強(qiáng)該基因的轉(zhuǎn)錄[12]。

血管生成擬態(tài)（Vasculogenic Mimicry，VM）是一種全新的腫瘤微循環(huán)模式，該血管生成模式不依賴機(jī)體細(xì)胞，是經(jīng)典血管生成理論的重要補(bǔ)充[13]。缺氧環(huán)境下VEGF環(huán)境濃度升高，誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的能力提高，從而加速了卵巢癌的惡性進(jìn)程。化療耐藥的原因之一在于腫瘤細(xì)胞在缺氧環(huán)境下，為適應(yīng)微環(huán)境的改變, HIF表達(dá)水平升高，從而激活腫瘤細(xì)胞，使之繼續(xù)增殖，細(xì)胞凋亡水平下降，從而促進(jìn)血管新生[14-17]。當(dāng)前的研究熱點(diǎn)是檢測(cè)腫瘤組織中VEGF和HIF-1α的表達(dá)率，以幫助早期診斷卵巢癌并且預(yù)測(cè)其侵襲性[3]。

本研究結(jié)果證實(shí)，EOC組織中VEGF和HIF-1α的免疫組化染色強(qiáng)度和百分比明顯高于正常卵巢組織，且EOC組織中MVD的平均值顯著升高，而VEGF、HIF-1α、MVD高表達(dá)組的EOC患者預(yù)后明顯更差，表明缺氧微環(huán)境在腫瘤血管生成過程中扮演著重要角色。體內(nèi)外研究結(jié)果表明，缺氧是決定微環(huán)境組成的共同因素，可加快腫瘤進(jìn)展，低氧環(huán)境下細(xì)胞因子和細(xì)胞合作促進(jìn)癌癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，因此，減輕腫瘤微環(huán)境缺氧的新方法為卵巢癌免疫治療策略帶來了希望[3,18-19]。

基于缺氧微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，以及血管生成在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的重要地位，針對(duì)HIF-1α的靶向治療研究已成為目前的熱點(diǎn)問題，例如利用缺氧微環(huán)境研發(fā)抗腫瘤藥物等。隨著腫瘤分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，VEGF以及HIF-1α等腫瘤生長(zhǎng)依賴的因子成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，腫瘤晚期患者的預(yù)后有望通過分子免疫學(xué)治療得到改善。