高趙峰 郭偉 楊曉丹 劉梟榮 胡凌煜 王曉光

嘉興學(xué)院附屬第二醫(yī)院肝膽外科,嘉興 314000

胰腺癌是一種侵襲力極強(qiáng)、惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤,至2030年或成為第二大癌癥相關(guān)死亡的原因[1]。由于早期診斷率低、手術(shù)可切除率低,化療在胰腺癌患者的綜合治療中扮演著不可或缺的角色。在眾多胰腺癌化療方案中,吉西他濱一直是胰腺癌臨床化療的一線用藥,但由于固有耐藥和獲得性耐藥的存在,制約著吉西他濱的藥效發(fā)揮[2]。目前尚缺乏生物標(biāo)志物或其他無(wú)創(chuàng)性監(jiān)測(cè)手段來(lái)實(shí)現(xiàn)胰腺癌的精準(zhǔn)化療指導(dǎo)。ARK5(AMPK-related kinase5)是AMPK(AMP-activated protein kinase)的亞家族成員之一[3]。研究表明ARK5表達(dá)水平與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)[4-6]。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果[7]也證實(shí)胰腺癌組織ARK5呈高表達(dá),且其表達(dá)水平與腫瘤對(duì)吉西他濱敏感性呈負(fù)相關(guān),提示ARK5可能是胰腺癌化療耐藥的潛在預(yù)測(cè)指標(biāo)。本研究通過(guò)無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)胰腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)的ARK5的表達(dá),隨訪比較ARK5表達(dá)陽(yáng)性與陰性胰腺癌患者的吉西他濱化療療效及預(yù)后,探討檢測(cè)CTCs ARK5表達(dá)用于指導(dǎo)胰腺癌吉西他濱化療的臨床價(jià)值。

資料與方法

一、臨床資料

收集2016年1月至2021年6月間嘉興學(xué)院附屬第二醫(yī)院收治的175例胰腺癌患者外周血標(biāo)本,并運(yùn)用高效納米微流控芯片技術(shù)富集CTCs。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)所有患者均經(jīng)超聲內(nèi)鏡下細(xì)針穿刺取得活檢組織,并經(jīng)兩位高年資病理科醫(yī)師讀片確診胰腺癌;(2)均采用臨床一線化療方案(吉西他濱方案)治療,既往均未接受過(guò)手術(shù)、免疫治療、全身放化療或其他特殊治療方式;(3)均運(yùn)用免疫熒光法檢測(cè)CTCs ARK5的表達(dá);(4)患者血常規(guī)、肝腎功能、心肺功能基本正常,心理健康良好。記錄患者的年齡、性別、臨床癥狀、腫瘤大小、腫瘤部位、TNM分期、血CA19-9及CEA水平以及轉(zhuǎn)移灶情況等指標(biāo)。本研究通過(guò)嘉興市第二醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(jxey-20180012),所有患者或家屬均簽署知情同意書。

二、CTCs富集及其ARK5表達(dá)檢測(cè)

1．納米微流控芯片富集CTCs:采集患者4 ml新鮮外周血樣本,移至抗凝離心管內(nèi)。每支離心管加入紅細(xì)胞裂解液(不含固定劑)14 ml,輕搖離心管,使細(xì)胞沉淀混勻,置于4℃ 15 min,再以1 000 r/min離心5 min(離心半徑20 cm),棄上清。加入10 ml以PBS 500 ml+EDTA 0.375 g+BSA 2.5 g配置的緩沖液,懸勻沉淀的細(xì)胞,再加入5 μl能與CTCs結(jié)合的EpCAM抗體偶聯(lián)的納米捕獲磁珠(浙江華宇生物科技有限公司)混均,然后將樣本液緩慢移至納米微流控分離系統(tǒng)(無(wú)錫納奧生物醫(yī)藥有限公司),以2.0 ml/min的進(jìn)樣速度[8]通過(guò)Nextctc納米微流控芯片,棄去外管內(nèi)富集的白細(xì)胞,獲取并收集內(nèi)管和中管內(nèi)CTCs富集液。

2．CTCs表面標(biāo)志物DAPI、CK及ARK5表達(dá)檢測(cè):取每個(gè)樣本的富集液3～4 ml,以1 000 r/min離心5 min(離心半徑15 cm),制備CTCs載玻片。以新鮮配置的2%多聚甲醛固定10 min,再用2.5% Triton X-100的PBS透化處理細(xì)胞10 min,2% BSA封閉30 min。然后分別加熒光標(biāo)記的CK-FITC抗體,避光孵育30 min;加熒光標(biāo)記的DAPI抗體,避光孵育10 min;加熒光標(biāo)記的ARK5-Alexa Fluor647抗體,避光孵育20 min,最后用20 μl封片劑封片,以不加抗體的CTCs作為對(duì)照。載玻片干燥后置熒光顯微鏡下觀察。熒光標(biāo)記抗體均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。CTCs的熒光特征為:DAPI陽(yáng)性表達(dá)呈藍(lán)色熒光,CK陽(yáng)性表達(dá)呈綠色熒光,ARK5陽(yáng)性表達(dá)呈紅色熒光。依據(jù)ARK表達(dá)情況分為陽(yáng)性組和陰性組。

三、化療方案與臨床評(píng)價(jià)

吉西他濱化療方案4周為1個(gè)療程,每療程第1、8、15天靜脈滴注吉西他濱1 000 mg/m2,每4周重復(fù)[9]。治療持續(xù)至患者出現(xiàn)病情進(jìn)展或者出現(xiàn)不可耐受的不良反應(yīng)時(shí)終止。療效判斷依據(jù)為WHO實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[10],分為完全緩解(complete response,CR)、部分緩解(partial response, PR)、疾病穩(wěn)定(stable disease, SD)、疾病進(jìn)展(progressive disease, PD),其中有效患者數(shù)量為CR+PR+SD例數(shù),耐藥患者數(shù)量為PD例數(shù)。出院后通過(guò)門診或電話進(jìn)行隨訪,記錄患者的生存狀況和死亡時(shí)間?？偵嫫?overall survival,OS)是指疾病確診之日至末次隨訪或死亡日期,無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)指患者確診之日至第一次發(fā)生腫瘤進(jìn)展或死亡時(shí)間[11]。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、患者的臨床資料

175例胰腺癌血標(biāo)本運(yùn)用高效納米微流控芯片技術(shù)成功富集到CTCs標(biāo)本98例,富集成功率為55.6%。98例患者中男性57例,女性41例,年齡55～76歲,平均66歲;有臨床癥狀51例;腫瘤長(zhǎng)徑2～6 cm;腫瘤位于胰頭部73例,體尾部25例;TNM分期Ⅲ期43例,Ⅳ期55例;血清CA19-9水平7～2 366 U/L,CEA水平3～124 U/L;腫瘤有肝臟轉(zhuǎn)移53例。98例CTCs標(biāo)本經(jīng)免疫熒光檢測(cè)后,ARK5陽(yáng)性表達(dá)70例,ARK5陽(yáng)性表達(dá)率為71.4%,陰性表達(dá)28例(圖1)。ARK陽(yáng)性組和陰性組患者的臨床資料比較見(jiàn)表1,兩組的臨床基線差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,具有可比性。

圖1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞明視野(1A)及DAPI陽(yáng)性(1B)、CK陽(yáng)性(1C)、ARK5陽(yáng)性(1D)表達(dá)(免疫熒光法)

二、CTCs ARK5陽(yáng)性表達(dá)與吉西他濱化療療效的相關(guān)性

70例CTCs ARK5陽(yáng)性組患者中64例(91.4%)對(duì)吉西他濱化療產(chǎn)生了耐藥性,28例ARK5陰性組患者中12例(42.8%)對(duì)吉西他濱化療產(chǎn)生了耐藥性,ARK5陽(yáng)性組患者吉西他濱耐藥發(fā)生率顯著高于ARK5陰性組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=27.102,P<0.001),提示ARK5陽(yáng)性表達(dá)與胰腺癌吉西他濱化療療效呈負(fù)相關(guān)。

三、ARK5表達(dá)與患者平均生存期的關(guān)系

98例患者均接受吉西他濱2～12個(gè)療程化療,平均3.84個(gè)療程。化療后行2～20個(gè)月的跟蹤隨訪,平均隨訪時(shí)間為15個(gè)月,無(wú)失訪。隨訪結(jié)果顯示,ARK5陽(yáng)性組患者的中位生存期為11.5個(gè)月,ARK5陰性組為14個(gè)月(圖2A);ARK5陽(yáng)性組患者無(wú)進(jìn)展生存期為6個(gè)月,陰性組為8個(gè)月(圖2B),ARK5陽(yáng)性組患者中位生存期和無(wú)進(jìn)展生存期均顯著低于陰性組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.440、0.043)。

圖2 循環(huán)腫瘤細(xì)胞ARK陽(yáng)性和陰性胰腺癌患者的總生存期(2A)和無(wú)進(jìn)展生存期(2B)曲線

討 論

ARK5又稱為NUAK1,位于Akt下游,可由Akt進(jìn)行信號(hào)調(diào)控,在復(fù)雜的腫瘤網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用[11]。ARK5具有介導(dǎo)人類胰腺癌細(xì)胞遷移的能力,對(duì)胰腺癌的進(jìn)展具有顯著影響[12]。在本課題組前期研究中,發(fā)現(xiàn)下調(diào)ARK5可提高胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物吉西他濱的敏感性,同時(shí)通過(guò)調(diào)控EMT通路,抑制腫瘤進(jìn)展[7]。因此筆者推測(cè)ARK5有希望成為一種潛在的胰腺癌化療預(yù)后的精準(zhǔn)檢測(cè)手段,有助于指導(dǎo)臨床及時(shí)改進(jìn)方案及劑量,實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)化個(gè)性化治療。

既往的研究中,檢測(cè)ARK5通常需要獲取胰腺癌組織,但由于胰腺癌發(fā)病隱匿,確診時(shí)僅有10%～20%的患者有手術(shù)機(jī)會(huì)[13],因此通過(guò)在切除樣本組織中檢測(cè)ARK5的應(yīng)用范圍較為局限。CTCs是一種細(xì)胞成分,可以儲(chǔ)存在原發(fā)性、轉(zhuǎn)移性、甚至是播散性腫瘤中,脫落后通過(guò)血流擴(kuò)散,引起腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。近年研究顯示,外周血CTCs的遺傳學(xué)特征與原發(fā)灶的腫瘤細(xì)胞極為相似[14],這為筆者在開(kāi)發(fā)檢測(cè)CTCs ARK5表達(dá)新方法方面提供了新思路。本研究采用納米微流控芯片技術(shù)在175例中晚期胰腺癌患者檢測(cè)和富集到98例的CTCs,富集成功率高達(dá)55.6%,遠(yuǎn)高于目前常應(yīng)用的技術(shù)[15],為檢測(cè)CTCs ARK5表達(dá)打下基礎(chǔ)。研究結(jié)果顯示,胰腺癌CTCs ARK5表達(dá)陽(yáng)性患者的吉西他濱化療耐藥發(fā)生率明顯高于ARK5表達(dá)陰性患者,中位生存期和無(wú)進(jìn)展生存期均顯著低于ARK5陰性患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示對(duì)CTCs ARK5表達(dá)陽(yáng)性患者單獨(dú)應(yīng)用吉西他濱化療的療效有限,這一結(jié)果有助于指導(dǎo)臨床醫(yī)師對(duì)胰腺癌化療藥物的選擇及對(duì)中晚期胰腺癌患者的精準(zhǔn)治療。未來(lái)有待納入更多患者并通過(guò)多中心研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明高趙峰:研究操作、論文撰寫、數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;郭偉:研究操作、數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,論文修改;楊曉丹、劉梟榮:病例數(shù)據(jù)收集、臨床診療、工作支持;胡凌煜:研究操作、數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、論文修改;王曉光:研究設(shè)計(jì)、研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持