盧明智 劉芳 方旭 邊云 邵成偉 陸建平 李晶

1海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射治療科,上海 200433;2海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射診斷科,上海 200433

胰腺癌是一種對(duì)放化療敏感性差、手術(shù)切除率低的致死性惡性腫瘤[1-2],亟需新的系統(tǒng)治療手段出現(xiàn)。近年來(lái),以免疫檢查點(diǎn)抑制劑為代表的免疫治療雖然在實(shí)體腫瘤中取得一定的進(jìn)展[3-4],但在胰腺癌的應(yīng)用中卻令人失望[5-6],這可能與胰腺癌復(fù)雜的免疫抑制性微環(huán)境有關(guān)。腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)是存在于腫瘤實(shí)質(zhì)和間質(zhì)內(nèi)的異質(zhì)性淋巴細(xì)胞群體,其不僅是體內(nèi)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤局部免疫應(yīng)答的直接反應(yīng),也是腫瘤免疫微環(huán)境的主要組成部分[7]。其中CD8+T細(xì)胞的存在與對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑療法的強(qiáng)力應(yīng)答相關(guān)。此外,有研究表明富含CD8+T細(xì)胞的患者對(duì)放化療的應(yīng)答效果更好[8]。已有研究證實(shí)在多種實(shí)體瘤(包括胰腺癌)中CD8+T細(xì)胞是重要的預(yù)后因素[9]。因此CD8+T細(xì)胞數(shù)量對(duì)患者預(yù)后以及治療策略的制定均有一定的臨床價(jià)值。目前術(shù)前檢測(cè)CD8+T細(xì)胞數(shù)量的主要方法為采用穿刺活檢,其局限性是獲得的標(biāo)本量極少,不能反映腫瘤的整體情況。而影像組學(xué)可從醫(yī)學(xué)圖像中提取高通量特征并分析腫瘤信息,能夠?qū)Σ∽儓D像進(jìn)行全面精準(zhǔn)的評(píng)價(jià),而且具有無(wú)創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)和快捷等優(yōu)勢(shì)[10-13]。本研究旨在探討基于MRI圖像影像組學(xué)的機(jī)器學(xué)習(xí)模型評(píng)估胰腺癌CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)的可行性,期望有助于篩選可以從免疫治療中獲益的胰腺癌患者。

資料與方法

一、一般資料

回顧性收集2017年1月至2018年4月間海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院156例經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為胰腺癌患者的臨床、影像、病理及隨訪資料。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)患者接受手術(shù)切除,術(shù)后病理為胰腺導(dǎo)管腺癌;(2)術(shù)前7 d內(nèi)行標(biāo)準(zhǔn)MRI增強(qiáng)檢查。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)術(shù)前接受過(guò)放療、化療或放化療的患者;(2)術(shù)后病理未進(jìn)行免疫組織化學(xué)CD8染色;(3)存在MRI無(wú)法顯示的胰腺病變以及圖像質(zhì)量不滿足分析要求。依據(jù)國(guó)際預(yù)測(cè)模型建模共識(shí),按照時(shí)間順序?qū)?017年1月至12月共116例患者納入訓(xùn)練集,2018年1月至4月共40例納入驗(yàn)證集。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào):CHEC-Y2020-011)。

二、MRI掃描方法

患者于MRI檢查前6 h禁食禁水。MRI設(shè)備為美國(guó)GE公司Signa HDxt 3.0 T、美國(guó)GE公司Discovery 750 3.0 T掃描儀和8通道體部線圈。掃描序列:(1)橫斷面呼吸觸發(fā)脂肪抑制快速自旋回波T2WI序列。重復(fù)時(shí)間(time of repetition, TR)6 316 ms,回波時(shí)間(time of echo,TE)85 ms,層數(shù)20,層厚5 mm,層間距1 mm,視野440 mm×440 mm,矩陣224×320。(2)肝臟快速容積成像(liver acquisition with volume acceleration,LAVA)T1WI序列。TR 2.58 ms,TE 1.18 ms,層厚5 mm,無(wú)層間距,視野440 mm×440 mm,矩陣224×320。增強(qiáng)掃描采用高壓注射器以2.0 ml/s的流率經(jīng)前臂靜脈注入對(duì)比劑釓噴替酸葡甲胺(Gd-DTPA)0.2 ml/kg,注射結(jié)束后用20 ml生理鹽水以同樣流率沖洗。分別在注射對(duì)比劑后15、20、40 s行動(dòng)脈期、門靜脈期、延遲期掃描。

三、圖像分析

由2名具有10年以上腹部影像診斷經(jīng)驗(yàn)的放射科醫(yī)師在臨床和病理學(xué)診斷不知曉的情況下采用盲法閱片,意見(jiàn)不同時(shí),協(xié)商達(dá)成一致。觀察指標(biāo)包括:腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤T1W及T2W圖像的信號(hào)強(qiáng)度(與周圍胰腺組織相比)、腫瘤和血管的關(guān)系、胰腺是否有炎癥、是否伴有主胰管截?cái)嗪蛿U(kuò)張(直徑>3 mm)及膽管截?cái)嗪蛿U(kuò)張(直徑>10 mm)、胰腺實(shí)質(zhì)有無(wú)萎縮、胰腺輪廓有無(wú)異常、胰腺是否有囊腫等。

四、影像組學(xué)分析和預(yù)測(cè)模型構(gòu)建

影像組學(xué)分析的過(guò)程包括MRI圖像分割、組學(xué)特征提取、組學(xué)特征降維。選取T1W、T2W以及3期動(dòng)態(tài)增強(qiáng)原始橫斷面圖像進(jìn)行分析。

采用3D Slicer 4.8.1軟件對(duì)胰腺腫瘤進(jìn)行分割。為降低采集條件差異的影響,在提取特征前對(duì)圖像進(jìn)行歸一化處理。為評(píng)價(jià)特征的穩(wěn)定性,使用簡(jiǎn)單隨機(jī)化法抽取50例患者的圖像,由2名放射科醫(yī)師分別對(duì)感興趣區(qū)(region of interest,ROI)進(jìn)行勾畫、測(cè)量,計(jì)算觀察者間組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(intraclass correlation coefficient,ICC);由1名放射科醫(yī)師間隔1周再次勾畫腫瘤,計(jì)算觀察者內(nèi)ICC。當(dāng)觀察者間與觀察者內(nèi)ICC均>0.75,認(rèn)為一致性良好,所提取的影像組學(xué)特征可靠,數(shù)據(jù)可以用作后續(xù)分析。

組學(xué)特征提取采用Python 1.2.0軟件。提取的組學(xué)特征包括原始特征和濾波器特征,其中濾波器特征包括拉普拉斯高斯濾波、小波分析、平方值、平方根、對(duì)數(shù)和指數(shù)特征6類。每一類特征值所包括的具體特征有一階統(tǒng)計(jì)量、形狀特征、三類紋理特征,合計(jì)1 409個(gè)。先分別剔除組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和無(wú)顯著相關(guān)的組學(xué)特征,再通過(guò)最小絕對(duì)收縮和選擇算子(least absolute shrinkage and selection operator,Lasso)進(jìn)一步對(duì)高維的組學(xué)特征進(jìn)行降維和選擇,最后根據(jù)Lasso回歸方程公式計(jì)算每位患者的組學(xué)分值(radscore),建立極端梯度提升(eXtreme gradient boosting,XGBoost)預(yù)測(cè)模型,模型包含的變量為MRI特征和組學(xué)分值。

五、病理學(xué)圖像分析

使用免疫組織化學(xué)法評(píng)價(jià)腫瘤CD8+T細(xì)胞數(shù)量。將CD8染色切片通過(guò)掃描儀(NanoZoomer S60,Hamamatsu Healthcare,japan)轉(zhuǎn)換為數(shù)字病理圖像。由1名病理科醫(yī)師對(duì)切片內(nèi)的腫瘤區(qū)域進(jìn)行標(biāo)注,注意避開(kāi)正常胰腺、胰周脂肪及十二指腸,使用數(shù)字顯微鏡分析平臺(tái)(Visiopharm)對(duì)標(biāo)注區(qū)進(jìn)行細(xì)胞識(shí)別和計(jì)數(shù),自動(dòng)計(jì)算出CD8染色陽(yáng)性的細(xì)胞密度。

根據(jù)病理學(xué)診斷報(bào)告,記錄:(1)根據(jù)第8版美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)TNM分期手冊(cè)評(píng)估T和N分期;(2)分化程度;(3)十二指腸有無(wú)侵犯;(4)膽總管有無(wú)侵犯;(5)脈管內(nèi)癌栓浸潤(rùn);(6)胰周神經(jīng)侵犯。

六、隨訪

以手術(shù)當(dāng)天為隨訪開(kāi)始時(shí)間,截止時(shí)間為2020年8月1日。任何原因引起的死亡定義為事件發(fā)生,該時(shí)間段為總生存時(shí)間,隨訪過(guò)程中的失訪按截尾數(shù)據(jù)處理。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、CD8+T細(xì)胞高、低組的臨床、病理和影像學(xué)特征比較

根據(jù)X-Tile確定的CD8+T細(xì)胞水平截點(diǎn)值為19.09%(圖1A、1B),將83例CD8>19.09%者歸入高CD8+T細(xì)胞組,73例CD8≤19.09%者歸入低CD8+T細(xì)胞組(圖1C),兩組CD8表達(dá)水平分別為(28.06±8.72)%和(14.48±2.93)%。隨訪至2020年8月1日,高CD8+T細(xì)胞組死亡人數(shù)43例,低CD8+T細(xì)胞組死亡人數(shù)31例,兩組中位總生存時(shí)間分別為25.51和22.92個(gè)月,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007,圖1D)。訓(xùn)練集中T分期(P=0.027)和驗(yàn)證集中MRI圖像測(cè)量的腫瘤大小(P=0.041)與CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)程度有關(guān),其余臨床、病理、影像學(xué)特征差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05,表1)。

表1 胰腺癌患者的臨床、病理及影像學(xué)特征基線資料

圖1 胰腺癌患者生存數(shù)據(jù)的X-Tile分析。1A、1B 由X-Tile確定的CD8+ T細(xì)胞的最佳截?cái)嘀禐?9.09%;1C 依據(jù)截?cái)嘀?9.09%,將患者分為高CD8+ T細(xì)胞組和低CD8+ T細(xì)胞組;1D CD8+ T細(xì)胞高、低組患者的Kaplan-Meier曲線

二、影像組學(xué)分析結(jié)果

50例患者間ICC為0.81～0.90,患者個(gè)體內(nèi)ICC為0.83～0.91,表明一致性均良好。

從T1WI、T2WI、動(dòng)脈、門靜脈和延遲期圖像中總計(jì)提取的1 409個(gè)影像組學(xué)特征經(jīng)過(guò)組間方差分析、Person相關(guān)分析后,獲得79個(gè)顯著相關(guān)的組學(xué)特征,經(jīng)Lasso回歸降維至19個(gè)組學(xué)特征(圖2A、2B)。通過(guò)Lasso回歸公式獲得組學(xué)分值(表2)。高CD8+T細(xì)胞組的組學(xué)分值為-0.43(范圍:-1.55～0.65),低組的組學(xué)分值為0.22(范圍-0.68～2.54),兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,圖2C)。

表2 Lasso回歸篩選的影像組學(xué)特征與組學(xué)方程式

圖2 Lasso回歸特征降維。2A λ參數(shù)與變量的選擇路徑圖;2B λ參數(shù)和模型誤差;2C 經(jīng)Lasso回歸降維后的19個(gè)組學(xué)特征誤差條形圖

三、機(jī)器學(xué)習(xí)模型的構(gòu)建和性能驗(yàn)證

將腫瘤大小和組學(xué)分值納入XGBoost模型。在訓(xùn)練集中,XGBoost模型預(yù)測(cè)胰腺癌CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)程度的AUC值、靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為0.90(95%CI0.85～0.95)、75.47%、90.48%、0.84、0.87和0.81。在驗(yàn)證集中,XGBoost模型預(yù)測(cè)胰腺癌CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)程度的AUC值、靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為0.79(95%CI0.63～0.96)、90.00%、80.00%、0.85、0.82和0.89(圖3A)。校準(zhǔn)曲線顯示訓(xùn)練集(P=0.767)和驗(yàn)證集(P=0.101)模型擬合度均較好(圖3B)。圖4為臨床實(shí)際應(yīng)用中的2個(gè)病例。利用預(yù)測(cè)模型可以準(zhǔn)確區(qū)分胰腺癌CD8+T細(xì)胞高、低組患者。

圖3 基于XGBoost分類器的訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的ROC曲線(3A)和校準(zhǔn)曲線(3B)

圖4 男性,60歲,胰腺癌,高CD8+T細(xì)胞組患者。CD8免疫組織化學(xué)染色圖像,紅色為CD8染色陽(yáng)性細(xì)胞(4A,×20);胰腺癌MRI圖像感興趣區(qū)勾畫示意圖(4B);XGBoost分類器預(yù)測(cè)該患者為低CD8+T細(xì)胞組的概率為32.50%(4C)。男性,50歲,胰腺癌,低CD8+T細(xì)胞組患者。CD8免疫組織化學(xué)染色圖像,紅色為CD8染色陽(yáng)性細(xì)胞(4D,×20);胰腺癌MRI圖像感興趣區(qū)勾畫示意圖(4E);XGBoost分類器預(yù)測(cè)該患者為低CD8+T細(xì)胞組的概率為92.20%(4F)

討 論

免疫治療給惡性腫瘤的治療帶來(lái)曙光。對(duì)胰腺癌患者免疫狀態(tài)的充分評(píng)估可以幫助臨床醫(yī)師篩選出免疫治療獲益患者,以延長(zhǎng)生存,獲得更好預(yù)后。本研究以病理學(xué)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),基于腫瘤大小和影像組學(xué)特征建立的機(jī)器學(xué)習(xí)模型為指導(dǎo)臨床治療提供了重要的預(yù)測(cè)信息。

在目前的臨床實(shí)踐中,胰腺癌患者預(yù)后評(píng)估主要依靠TNM分期系統(tǒng),但TNM分期不能反映患者之間的異質(zhì)性[14],因此,即使相同疾病分期的患者,其預(yù)后也存在較大差異。盡管一些用于胰腺癌預(yù)后評(píng)價(jià)的生物化學(xué)和遺傳生物標(biāo)志物取得研究進(jìn)展,但它們受限于高成本和操作復(fù)雜性等束縛,因此,在胰腺癌患者中開(kāi)發(fā)一種新的個(gè)性化預(yù)測(cè)模型具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。越來(lái)越多的證據(jù)支持腫瘤微環(huán)境中的CD8+T細(xì)胞與胰腺癌的預(yù)后密切相關(guān)[15-21],而活化的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞可通過(guò)識(shí)別腫瘤特異性抗原發(fā)揮免疫殺傷作用[22-23]。因此,定量CD8+T細(xì)胞可用來(lái)預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。本研究結(jié)果顯示,高CD8+T細(xì)胞組患者的總體生存期顯著長(zhǎng)于低CD8+T細(xì)胞組,也證實(shí)了這一相關(guān)性。

CD8+T細(xì)胞的定量分析依賴于病理學(xué),但病理醫(yī)師閱片主要根據(jù)其知識(shí)儲(chǔ)備和臨床經(jīng)驗(yàn),存在一定的主觀性,不能精確地定量診斷,且術(shù)前活檢組織樣本量小并具有異質(zhì)性;而常規(guī)術(shù)前影像圖像對(duì)腫瘤評(píng)價(jià)均是基于解剖學(xué)和生物學(xué)評(píng)價(jià),很難與病理微觀成分建立聯(lián)系。本研究通過(guò)對(duì)腫瘤進(jìn)行三維勾畫并提取影像組學(xué)特征,能夠更直觀、便捷且無(wú)創(chuàng)地觀察腫瘤的總體特征,這一點(diǎn)對(duì)于無(wú)法切除的胰腺癌患者尤為重要。Sun等[9]構(gòu)建了基于CT的影像組學(xué)模型評(píng)估15種實(shí)體腫瘤(但未包括胰腺癌)中CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)程度,并可預(yù)測(cè)免疫治療的療效。Liao等[12]基于CT圖像篩選7個(gè)組學(xué)特征構(gòu)建的組學(xué)分值可以預(yù)測(cè)原發(fā)性肝癌患者的生存結(jié)局、CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)程度、免疫表型和PD-1/PD-L1表達(dá)。在胰腺癌方面,Li等[24]發(fā)現(xiàn)基于CT的影像組學(xué)模型在評(píng)估腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+T細(xì)胞的訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的AUC值分別為0.75和0.67。本研究基于MRI的機(jī)器學(xué)習(xí)預(yù)測(cè)模型在訓(xùn)練集(AUC值為0.90)和驗(yàn)證集(AUC值為0.79)中均具有較高診斷效能。與CT相比,MRI成像具有軟組織分辨率高、多序列多參數(shù)成像的優(yōu)勢(shì)。

本研究存在一些不足之處。第一,本研究為單中心回顧性研究,未來(lái)需納入多中心數(shù)據(jù)做驗(yàn)證集;第二,只納入了手術(shù)后患者,不可避免的存在偏倚;第三,由于胰腺癌呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng),邊緣較模糊,本研究仍采用手工勾畫腫瘤感興趣區(qū),存在勾畫者間的經(jīng)驗(yàn)差異,導(dǎo)致可重復(fù)性差,且耗時(shí)費(fèi)力,未來(lái)可借助人工智能算法實(shí)現(xiàn)腫瘤的全自動(dòng)分割。

綜上所述,基于MRI影像組學(xué)特征的機(jī)器學(xué)習(xí)模型在預(yù)測(cè)胰腺癌CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)上具有較高價(jià)值,有助于篩選可以從免疫治療中獲益的患者。但本研究?jī)H探討了CD8+T細(xì)胞,而胰腺癌的腫瘤微環(huán)境組成復(fù)雜,且各組分間存在交互作用,因此該指標(biāo)在臨床預(yù)后評(píng)估的價(jià)值仍有待進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明盧明智:研究操作、論文撰寫;劉芳、方旭:數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析; 李晶、邊云:研究醞釀、研究指導(dǎo)、工作支持;邊云、邵成偉、李晶、陸建平:研究設(shè)計(jì)、研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持