徐小珊,熊羅節(jié),馬 偉,翟春濤,李 瑋,田岳鳳△

(1.湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿與康復學院,長沙 410208;2.山西中醫(yī)藥大學第二臨床學院,山西晉中 030619)

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome,CFS)是屬于亞健康狀態(tài)的一種特殊表現(xiàn),又稱第三狀態(tài),也稱病前狀態(tài)、灰色狀態(tài)、潛病期、亞臨床期、臨床前期等,可見無明顯誘因且休息后無法緩解的疲勞?；颊呱袩o臨床癥狀或癥狀感覺輕微,但已出現(xiàn)潛在病理信息,常伴免疫力低下。團隊前期研究表明隔藥餅灸對機體免疫功能有顯著調(diào)節(jié)作用[1],但具體機制尚不明確,本次實驗采用力竭游泳與慢性束縛交替的方法復制CFS大鼠模型,觀察隔藥餅灸“神闕”“關(guān)元”“足三里”“期門”對CFS大鼠血清中免疫球蛋白(Ig)A、IgG、補體C3以及肌肉組織中T淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白(T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein, Tim)-3、淋巴細胞活化基因(lymphocyte-activation gene,LAG)-3的影響,從而探討隔藥餅灸的免疫干預效應(yīng)。本研究通過山西中醫(yī)藥大學實驗動物醫(yī)學倫理委員會批準,編號:2020DW009。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD大鼠50只,雌雄各半,體質(zhì)量(200±20)g,購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2019-0010。大鼠飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學動物房,環(huán)境溫度20～25 ℃,濕度30%～50%,鼠籠與水壺定時清洗并消毒,墊料及時更換,保證環(huán)境清潔與空氣流通。整個實驗過程中對動物的各項處理均嚴格遵守2006年發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》[2]。

1.2 主要儀器與試劑

蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色液(貨號BA4025),珠海貝索BASO公司;封片劑(貨號10004160),上海國藥廠;酶聯(lián)免疫IgA(貨號MM-0062R1)、IgG(貨號MM-0064R1)、補體C3(貨號MM-0353R1)試劑盒,上海酶聯(lián)生物科技有限公司;Trizol試劑盒(貨號B511321),上海生工生物工程股份有限公司;瓊脂糖B(貨號A600014)、核酸染色劑(貨號A606695),香港(中國)BBI生命科學公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號EP0743)、熒光定量PCR試劑盒(貨號B300721),美國賽默飛世爾科技公司。

ZH-YLS-181型懸尾測定儀,安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司;OFT-100型曠場實驗箱,成都泰盟軟件有限公司;SM600型酶標儀,上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司;CX41型生物顯微鏡,中國奧林巴斯有限公司;DYY-6C型電泳儀,北京六一生物科技有限公司;FR980型凝膠成像系統(tǒng),上海復日科技有限公司;SMA4000型微量分光光度計,北京美林恒通科技有限公司;LightCycler480 Ⅱ型熒光定量PCR儀,瑞士Rotkreuz公司。

1.3 艾灸與藥餅材料制備

艾絨(國藥準字Z32020253),江蘇康美制藥有限公司;艾炷:用模具制成底徑約0.5 cm、高0.7 cm,質(zhì)量約(0.052±0.015)g的圓錐形艾炷,備用。

逍遙散組方:柴胡、白芍、當歸、茯苓、白術(shù)各30 g,炙甘草15 g,薄荷10 g,燒生姜10 g,中藥飲片購自山西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院。按組方劑量打碎成粉末,過90目篩,將藥粉與賦型劑按1:1比例調(diào)勻成泥狀,用模具制備為底徑0.8 cm,高0.2 cm,質(zhì)量(0.12±0.03)g的藥餅,牙簽刺5個小孔,備用。假藥餅只用賦型劑制備,方法同隔藥餅。

1.4 中藥懸濁液制備

按70 kg成人每日臨床用量9 g為標準,大鼠的等效劑量相當于人的6.3倍,可得逍遙散懸濁液的濃度約為60 mg/kg。將逍遙散組方藥粉按比例配制成懸濁液,備用。

2 方法

2.1 造模方法

根據(jù)隨機數(shù)字表法將大鼠分為空白組、模型組、隔藥餅灸組、假藥餅灸組、中藥灌胃組,共5組,每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,對除空白組外其余4組大鼠進行CFS造模,依據(jù)文獻選擇復合造模方法,21 d內(nèi)施加力竭游泳(身體疲勞)與慢性束縛(心理疲勞)2種造模因素[3-5]。造模后行為學檢測(曠場實驗與懸尾實驗)結(jié)果顯示模型組大鼠各項指標均發(fā)生顯著變化,提示造模成功。

力竭游泳模型制備方法:每日上午9:00,大鼠在自制游泳箱中自由游泳,游泳時水深約30 cm,水溫(22±3)℃,以大鼠游泳動作明顯失調(diào)或頭部沉入水中10 s不能浮出水面為力竭標準。

慢性束縛模型制備方法:將大鼠放入自制束縛筒內(nèi),關(guān)閉閘門并收緊瓶身,限制活動。每日下午1:00開始,每次束縛3 h。束縛期間注意觀察大鼠狀態(tài),避免其因情緒過度緊張或呼吸不暢死亡。

2.2 干預方法

造模結(jié)束后第2天開始干預治療,空白組和模型組大鼠不做任何干預。

隔藥餅灸組:使用之前制備好的藥餅與艾炷,選取大鼠“神闕”“關(guān)元”“足三里(雙)”“期門(雙)”共6個穴位,治療前將各穴位處毛剪去,放置藥餅與艾炷,點燃艾炷、燃盡更換,每穴灸5壯,每日灸,連灸10 d。穴位定位參照《實驗針灸學》常用動物穴位定位法以及擬人比照法[6-7],“神闕”位于大鼠臍正中央;“關(guān)元”位于臍下約25 mm處,大鼠第3、第4對乳頭連線中點水平與腹白線相交處;“足三里”位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè),腓骨小頭下約5 mm處,左右各一穴;“期門”位于胸側(cè)部第6肋間,肋骨與肋軟骨交界處,左右各一穴。

假藥餅灸組:與隔藥餅灸組干預方法相同,穴位處放置賦形劑制備的假藥餅,每穴灸5壯,每日灸,連續(xù)10 d。

中藥灌胃組:使用制備好的逍遙散懸濁液,在艾灸治療基礎(chǔ)上每日按大鼠體質(zhì)量進行灌胃給藥,連續(xù)10 d。

2.3 樣品采集及處理

干預治療結(jié)束后次日,將大鼠麻醉后迅速腹主動脈取血,取上清液于-20 ℃保存待測。同時取大鼠肝臟、脾臟及雙側(cè)股四頭肌組織,置于0.9%氯化鈉溶液中清洗至表面無血跡,并用濾紙吸干。肝臟、脾臟組織置于4%多聚甲醛溶液中固定,用于常規(guī)HE染色。股四頭肌組織置于液氮中凍存,用于熒光定量PCR檢測。

2.4 指標檢測

2.4.1 血清中IgA、IgG及補體C3的含量 采用ELISA法測定各組大鼠血清中IgA、IgG及補體C3的含量,具體步驟參照試劑盒說明書。

2.4.2 大鼠肝臟、脾臟組織病理學變化 從4%多聚甲醛溶液中取出各組大鼠肝臟、脾臟組織,梯度脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片(3～5 μm),常規(guī)HE染色,顯微鏡下觀察病理學變化。

2.4.3 肌肉組織Tim-3、LAG-3 mRNA水平 采用實時熒光定量PCR方法,將各組大鼠冰凍的股四頭肌組織用Trizol法進行總RNA提取,反轉(zhuǎn)錄為互補的cDNA并設(shè)定反應(yīng)條件后擴增。以β-actin為內(nèi)參,所得數(shù)據(jù)用2-△△Ct法進行mRNA相對定量分析。引物序列見表1。

表1 引物序列表

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 行為學實驗結(jié)果

3.1.1 曠場實驗結(jié)果 與空白組比較,模型組大鼠曠場實驗水平跨格數(shù)與站立次數(shù)顯著降低(P<0.05);與模型組比較,隔藥餅灸組與中藥灌胃組大鼠水平跨格數(shù)與站立次數(shù)均顯著升高(P<0.05),且2組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);假藥餅灸組與模型組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠曠場實驗結(jié)果

3.1.2 懸尾實驗結(jié)果 與空白組比較,模型組大鼠懸尾實驗掙扎次數(shù)顯著減少,不動時間明顯增加(P<0.05);與模型組比較,隔藥餅灸組、假藥餅灸組與中藥灌胃組大鼠掙扎次數(shù)明顯上升,不動時間顯著下降(P<0.05);隔藥餅灸組與中藥灌胃組比較,大鼠掙扎次數(shù)與不動時間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與假藥餅灸組比較,隔藥餅灸組與中藥灌胃組大鼠掙扎次數(shù)上升(P<0.05),但不動時間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表3。

表3 各組大鼠懸尾實驗結(jié)果

3.2 ELISA實驗結(jié)果

與空白組比較,模型組大鼠血清IgA、IgG與補體C3含量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,隔藥餅灸組與中藥灌胃組大鼠血清IgA、IgG與補體C3含量均明顯升高(P<0.05);與中藥灌胃組比較,隔藥餅灸組大鼠血清IgA、IgG含量升高(P<0.05),補體C3含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);假藥餅灸組與模型組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表4。

表4 各組大鼠血清IgA、IgG、補體C3含量比較

3.3 HE染色實驗結(jié)果

3.3.1 肝臟組織病理結(jié)果 空白組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整且清晰,以中央靜脈為中心向四周放射狀排列,同時肝細胞結(jié)構(gòu)完整,肝竇正常,胞核結(jié)構(gòu)清晰,核大,呈圓形;模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)較完整,肝細胞索結(jié)構(gòu)模糊,肝細胞排列基本整齊,可見散在細胞體積縮小,胞質(zhì)密度增加,核質(zhì)濃縮,核膜核仁破碎,偶爾可見凋亡小體;隔藥餅灸組與中藥灌胃組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)與空白組相近,肝細胞索結(jié)構(gòu)基本整齊,偶見細胞體積縮小,核質(zhì)濃縮;假藥餅灸組大鼠肝細胞索排列不清,可見部分肝細胞體積增大,出現(xiàn)水腫,見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟組織HE染色結(jié)果比較(×200)

3.3.2 脾臟組織病理結(jié)果 空白組大鼠脾臟組織白髓結(jié)構(gòu)完整,數(shù)量多且形態(tài)較規(guī)則,紅白髓分界較清楚,脾小節(jié)較大,淋巴細胞密集。模型組大鼠白髓數(shù)量明顯減少且結(jié)構(gòu)不規(guī)則,淋巴細胞數(shù)量明顯減少,脾小節(jié)明顯縮小,紅白髓移行區(qū)消失,紅白髓交織在一起,白髓數(shù)量減少,部分被紅髓替代。隔藥餅灸組與中藥灌胃組大鼠白髓結(jié)構(gòu)較完整,紅髓數(shù)量有所上升,形態(tài)較規(guī)則,呈現(xiàn)過渡階段,脾小節(jié)較空白組有輕微變小,淋巴細胞密度較大,總體具有明顯的紅白髓移行區(qū),但部分紅白髓分界不明。假藥餅灸組大鼠淋巴細胞數(shù)量較模型組增加不明顯,脾小節(jié)變小,紅白髓交織且白髓結(jié)構(gòu)不規(guī)則,見圖2。

圖2 各組大鼠脾臟組織HE染色結(jié)果比較(×200)

3.4 熒光定量PCR結(jié)果

與空白組比較,模型組大鼠股四頭肌Tim-3、LAG-3 mRNA水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,隔藥餅灸組與中藥灌胃組大鼠股四頭肌Tim-3、LAG-3 mRNA水平顯著降低(P<0.05),假藥餅灸組Tim-3 mRNA水平降低(P<0.05);隔藥餅灸組與中藥灌胃組組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表5。

表5 各組大鼠股四頭肌Tim-3、LAG-3 mRNA水平比較

4 討論

CFS患者常出現(xiàn)無明顯原因的持續(xù)或間斷性發(fā)作疲勞(>6個月),且常伴低熱、肌肉酸痛、睡眠質(zhì)量下降等癥狀[8]。目前對于CFS發(fā)病機制的研究結(jié)果尚不明確,研究者認為與多系統(tǒng)失調(diào)相關(guān),可能為免疫系統(tǒng)紊亂、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)失調(diào)、能量代謝異常、心血管系統(tǒng)異常等復合作用導致[9]。免疫系統(tǒng)和全身能量代謝處于低水平狀態(tài)時,患者往往易產(chǎn)生疲勞癥狀,進而影響其神經(jīng)與心血管功能,導致認知功能出現(xiàn)障礙,影響患者日常工作與生活[10-11]?，F(xiàn)代醫(yī)學對CFS尚無針對性強的治療手段,多采用補充維生素等營養(yǎng)療法、抗抑郁藥物以及多種非藥物療法,但療效仍存在一定局限性[12]。而中醫(yī)治療CFS效果較好,使用中藥或針灸治療能調(diào)節(jié)細胞免疫,提高機體免疫力,減輕神疲乏力、抑郁易怒等癥狀,恢復機體活力[13-14]。

中醫(yī)學認為,CFS根據(jù)其主要臨床表現(xiàn),被稱為“郁證”“虛勞”,其病機多為本虛標實,主要與肝、脾密切相關(guān),臨床最常見的證型則為肝郁脾虛?！端貑枴の宀厣烧撈吩弧案问苎芤暋?體現(xiàn)了肝藏血主疏泄功能保障人體正常的生命活動,肝氣不舒則情志不調(diào),容易出現(xiàn)焦慮抑郁的狀態(tài)。脾主四肢肌肉,“脾氣虛則四肢不用”,脾虛則筋脈失養(yǎng)、氣血生化乏源,而見神疲乏力、不欲動。因此在臨床應(yīng)對癥治療,疏肝氣以調(diào)暢情志,補脾氣以充氣血,可以采用疏肝解郁、補氣和血的逍遙散組方。逍遙散作為經(jīng)方,由甘草、茯苓、當歸、白芍、白術(shù)、柴胡組成,善治肝郁脾虛證,對肝氣郁結(jié)所致的咽干口燥、兩脅作痛與脾虛所致的疲勞難愈、氣血虧虛都有較好的改善效果[15-16]。另一方面,實驗選取“神闕”“關(guān)元” “足三里”“期門”穴共同配合來干預CFS。“神闕” “關(guān)元”均為任脈之所屬,神闕穴與任、督、沖脈等相關(guān)進而統(tǒng)屬全身經(jīng)絡(luò),為人體生命之門,有調(diào)氣補脾、強壯保健之效,關(guān)元穴為足三陰經(jīng)交會之處,《醫(yī)經(jīng)理解》認為關(guān)元穴為“男子藏精,女子蓄血之處。是人生之關(guān)要,真元之所存也”,可培本固元、補益元氣。足三里為足陽明胃經(jīng)之合穴,善補益脾氣、調(diào)理脾胃,可以有效增強人體免疫力,抵抗疲勞[17-18]。另期門穴為肝經(jīng)之募穴,有健脾疏肝、理氣活血的作用,針刺期門可以有效緩解CFS患者抑郁焦慮的精神狀態(tài)[19]。

本實驗采用隔藥餅灸的方法,將逍遙散組方藥按標準制成藥餅,并將其置于大鼠“神闕” “關(guān)元” “足三里” “期門”等穴位上。研究結(jié)果顯示:隔藥餅灸相較于單純艾灸療效更佳,除艾灸的熱效應(yīng)外,逍遙散組方藥物透皮吸收后能夠更好地發(fā)揮療效,針對性改善CFS肝郁脾虛證。同時隔藥餅灸相較于單純口服中藥,加入了艾灸帶來的溫熱刺激效應(yīng),艾灸本就具有溫通經(jīng)脈、調(diào)和氣血作用,熱力熏蒸能促進機體透過皮膚對藥物進行吸收,還能使藥效經(jīng)穴位、經(jīng)絡(luò)傳輸,刺激人體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),有效抵御病邪,增強抵抗力。正如《靈樞·官能》所云“針所不為,灸之所宜”,隔藥餅灸療法集藥物、穴位、艾灸三者作用于一體,藥效進一步深入人體各臟腑,能夠調(diào)節(jié)免疫球蛋白濃度從而提高免疫力,增強免疫功能[20-21]。

根據(jù)CFS的發(fā)病機制假說,本次實驗主要研究隔藥餅灸能否通過干預免疫系統(tǒng)中紊亂的免疫球蛋白與T細胞調(diào)節(jié)因子,進而影響CFS發(fā)展進程。IgA、IgG是體液免疫的重要防線,與相應(yīng)抗原結(jié)合后可以激活補體,IgA為黏膜防御系統(tǒng)的重要成分,IgG的主要功能為抗感染[22]。而補體C3作為血清中含量最高的補體成分,是補體激活途徑中最重要的環(huán)節(jié),參與機體的特異性免疫[23]。它們的含量與機體免疫水平存在一定因果關(guān)系,也是實驗中常用的免疫學指標。

有實驗研究發(fā)現(xiàn)艾灸“關(guān)元”穴能有效升高CFS模型大鼠血清中的IgA、IgG與補體C3水平,提示艾灸可以提高CFS大鼠的免疫功能,且與穴位配伍能使療效更優(yōu)[24]。另有研究觀察在CFS疾病發(fā)展過程中,IgA、IgG、IgM的含量可以作為突出指標,來觀測針灸對疾病的治療效果[25]。本實驗結(jié)果顯示,與單純中藥灌胃和假藥餅灸相比,隔藥餅灸更能有效恢復CFS大鼠免疫球蛋白IgA、IgG、補體C3的含量,提示隔藥餅灸干預手段可能通過調(diào)節(jié)體液免疫、增強免疫功能來達到治療CFS的目的。

Tim-3基因是癌癥研究常觀察的靶點之一,在多種T細胞上均可存在,被認為可以提高癌癥免疫治療的療效,并被探討是否可以作為治療癌癥的新方法[26-27]。Tim-3存在于巨噬細胞、樹突狀細胞、CD4+T、CD8+T上,影響細胞凋亡與吞噬[28],同時它作為免疫負調(diào)節(jié)因子,能有效調(diào)控T細胞的增殖與分化,抑制T細胞的免疫應(yīng)答,誘導免疫耐受,與多種自身免疫性疾病、免疫衰竭疾病相關(guān)[29]。本次實驗檢測Tim-3基因表達后發(fā)現(xiàn),這種T細胞表面抑制性分子在CFS模型大鼠肌肉組織中出現(xiàn)表達上調(diào)現(xiàn)象,經(jīng)隔藥餅灸治療后下降,說明隔藥餅灸可能阻斷Tim-3基因表達,調(diào)節(jié)細胞免疫進而抑制疾病的發(fā)生發(fā)展,有助于CFS疾病免疫耐受的恢復,為后續(xù)實驗與臨床研究提供了新的思路。

LAG-3作為重要的免疫調(diào)控分子,主要表達于自然殺傷細胞、樹突狀細胞,以及活化的T細胞上,是單鏈跨膜蛋白,與主要組織相容性復合體Ⅱ類分子(major histocompatibility complex,MHC-Ⅱ)結(jié)合共同抑制T細胞活化[30]。LAG-3作為新興的免疫檢查點,與特異性T細胞的免疫調(diào)節(jié)相關(guān),屬于免疫負調(diào)節(jié)因子[31]。本次研究發(fā)現(xiàn)隔藥餅灸能下調(diào)CFS模型大鼠LAG-3 mRNA表達,再次證明隔藥餅灸增強機體免疫功能的效果顯著。

綜上所述,本研究結(jié)果提示隔藥餅灸可以明顯緩解CFS大鼠疲勞狀態(tài),且對免疫系統(tǒng)具有正向刺激作用,能夠提升IgA、IgG、補體C3的含量,下調(diào)Tim-3、LAG-3 mRNA的表達水平,同時改善肝脾組織病理形態(tài),這可能是隔藥餅灸改善CFS的作用機制之一。