張廣麗,黎壯偉,宋 卉

(廣東食品藥品職業(yè)學院,廣東 廣州 510000)

化療仍然是目前治療肺癌的主要手段之一,該療法可抑制和殺傷肺癌細胞,但由于多數(shù)化療藥物對肺癌細胞特異性并不高,在殺傷肺癌細胞的同時也破壞了機體的正常細胞,造成骨髓抑制[1],患者常出現(xiàn)貧血、白細胞下降或者血小板下降。所以加強肺癌化療者骨髓造血功能保護成為癌癥治療領(lǐng)域的重要目標。龜板固本方是治療腫瘤相關(guān)性貧血的有效經(jīng)驗方,課題組前期研究證實該方可有效防治骨髓抑制[2-3],推測其可能是通過作用于細胞DNA周期,參與受損傷的細胞DNA修復,并調(diào)控細胞凋亡相關(guān)蛋白,進而改善骨髓的抑制程度。為驗證這一假說是否正確,本課題組通過動物實驗,從骨髓細胞DNA周期損傷修復及調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達的角度,研究了龜板固本方對肺癌化療小鼠骨髓抑制的影響。

1 實驗材料與方法

1.1動物 SPF級C57BL/6小鼠60只,體重18～22 g,購于北京華阜康科技股份有限公司[生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2019-0008]。動物在SPF 級屏障環(huán)境動物房分籠飼養(yǎng),5只/籠,自由攝食飲水,室溫(21±2)℃,濕度30%～60%,照明時間12 h,換氣次數(shù)>10次/h。本實驗過程遵循2006年國家科學技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》的規(guī)定。

1.2細胞株及藥品 Lewis肺癌瘤株購于中國科學院上海生命科學生物化學與細胞生物學研究所。龜板固本方由龜板15 g、黃精30 g、桑椹30 g、黃芪30 g、紅參10 g組成,中藥飲片購自廣州致信藥業(yè)股份有限公司,按常規(guī)方法水煎取汁濃縮,實驗用藥生藥含量為0.8 g/mL,置冰箱4 ℃保存?zhèn)溆?。注射用環(huán)磷酰胺由江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司生產(chǎn),國藥準字H32020857,規(guī)格:0.2 g/瓶。重組人粒細胞刺激因子注射液,杭州九源基因工程有限公司生產(chǎn),國藥準字S10980029,規(guī)格:75 μg/支。

1.3主要試劑與儀器 Bcl-2、Bax抗體(英國Abcam公司);碘化丙啶(北京百奧萊博科技有限公司)。RNA酶(Roche公司); IMDM培養(yǎng)液(HYCLONE公司,批號: NWB0372)。Napco-5410 CO2培養(yǎng)箱 (美國Shelden公司) ;全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-SⅡ);UV2101 PC型紫外分光光度計(尤尼科上海儀器有限公司)。熒光顯微鏡(Leica Microsystems Ltd,德國);流式細胞儀(美國BECKMAN-COULTER公司)。

1.4實驗方法 將60只小鼠隨機分為空白組、模型組、龜板固本方組、粒細胞刺激因子組,每組15只。除空白組外,其他3組小鼠均進行肺癌骨髓抑制造模。具體方法:取對數(shù)生長期的Lewis肺癌細胞,常規(guī)離心,制成瘤細胞混懸液,消毒小鼠右前腋,取0.2 mL接種于皮下。待瘤體生長至直徑1～1.5 cm時,處死小鼠,選取生長良好的瘤組織,剪碎、稱重,用細胞勻漿器制成勻漿,制備成濃度為1×107/mL瘤細胞混懸液,每只小鼠右腋下接種0.2 mL[約(1～2)×106瘤細胞],接種4 d后,以小鼠右腋下皮下可觸及腫瘤塊標志肺癌造模成功。然后對肺癌造模成功小鼠一次性腹腔注射環(huán)磷酰胺250 mg/kg(于臨用前配制),以外周血WBC、RBC、Plt明顯低于正常小鼠提示肺癌骨髓抑制模型復制成功[1]。造模完成后24 h,龜板固本方組按0.4 mL/d的劑量灌胃龜板固本方懸液,空白組和模型組灌胃等量生理鹽水,粒細胞刺激因子組皮下注射重組人粒細胞刺激因子注射液5 ng/g,均1次/d,連續(xù)干預7 d。

1.5檢測指標及方法

1.5.1骨髓細胞周期 最后1次干預24 h后,經(jīng)頸椎脫臼處死各組小鼠,取左側(cè)股骨,用剪刀剪開股骨兩頭,露出骨髓腔,然后用消毒過的注射器(4號針頭)吸取2 mL培養(yǎng)液,反復沖洗骨髓腔,收集骨髓細胞,全部置離心管內(nèi),反復吹打使細胞完全分散,然后1 000 r/min離心10 min,去上清,加入適量培養(yǎng)液充分混勻,制成骨髓有核細胞懸液。加入1 mL冰浴預冷70%乙醇中,輕輕吹打混勻,4 ℃固定12 h,用PBS漂洗2次后,加100 μL PBS混勻,加入濃度為50 μg/mL的碘化丙啶染色液,37 ℃避光溫浴30 min,4 ℃避光存放。流式細胞儀檢測各組小鼠骨髓細胞周期。

1.5.2細胞凋亡相關(guān)蛋白表達情況 取各組小鼠右側(cè)股骨,4%多聚甲醛固定24 h,20% EDTA脫鈣,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、切片,用免疫組化SP法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達情況。攝像顯微鏡下觀察,Bcl-2和Bax陽性表達為細胞質(zhì)呈棕黃色,無棕黃色為陰性表達。每張切片隨機選取5個視野,計數(shù)每個視野陽性細胞數(shù),取其平均值為每張切片陽性細胞數(shù)。Bcl-2和Bax表達情況以陽性細胞所占比例和染色強度進行測定,陽性細胞所占比例評分標準: 陽性細胞數(shù)1%～25%為1分,26%～50%為2分, 51%～75%為3分, 76%～100%為4分。染色強度:無色0分,淺黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分。以兩項評分的乘積作為最終的判斷結(jié)果,≤7分為陰性,>7分為陽性。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠骨髓細胞周期比較 與空白組比較,模型組G0/G1期和S期細胞比例明顯升高(P均<0.05),G2/M期細胞比例明顯降低(P<0.05);與模型組比較,龜板固本方組和粒細胞刺激因子組G0/G1期細胞比例均明顯降低(P均<0.05),S期和G2/M期細胞比例均明顯升高(P均<0.05);與粒細胞刺激因子組比較,龜板固本方組S期細胞比例較低(P<0.05),G0/G1期和G2/M期細胞比例比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 空白組和肺癌骨髓抑制各組小鼠骨髓細胞周期比較

2.2各組小鼠骨髓細胞凋亡蛋白表達情況比較與空白組比較,模型組Bax蛋白表達量明顯升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表達量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,龜板固本方組和粒細胞刺激因子組Bax蛋白表達量均明顯降低(P均<0.05),Bcl-2蛋白表達量均明顯升高(P均<0.05);與粒細胞刺激因子組比較,龜板固本方組Bcl-2蛋白表達量較低(P<0.05),Bax蛋白表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 空白組和肺癌骨髓抑制各組小鼠骨髓細胞中凋亡蛋白Bax、Bcl-2表達量比較

3 討 論

骨髓抑制是肺癌藥物治療過程中常見的不良反應(yīng),目前仍沒有非常有效的預防方法,主要是骨髓抑制發(fā)生后采用促紅細胞生成素、重組人粒細胞刺激因子、白細胞介素-11等選擇性作用于造血祖細胞,促進其增殖、分化,改善骨髓抑制,但其作用時間比較短暫,不能長期有效解決骨髓抑制問題。細胞周期包括DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)與合成后期(G2期)、細胞分裂期(M期),骨髓細胞周期的分布情況是骨髓造血功能的重要指標,可以反映骨髓增殖的狀態(tài)。當化療使造血細胞DNA受到損傷后,骨髓細胞周期阻滯于G1期來修復損傷的DNA,對不能修復者啟動凋亡程序消除受損細胞。因此,解除骨髓細胞G1期阻滯,使細胞由G1期轉(zhuǎn)入S期,進而使S期向G2/M期轉(zhuǎn)化是拮抗放、化療藥物造成骨髓抑制的一個重要機制[4-5]。造血干細胞數(shù)量減少與骨髓細胞凋亡增加有關(guān)[6]。細胞凋亡受到一系列相關(guān)基因的調(diào)節(jié)和控制,其中Bcl蛋白家族為細胞凋亡的主要調(diào)節(jié)者[7],按其作用不同分為抗凋亡和促凋亡兩大類[8-9]。Bcl-2屬于抗細胞凋亡因子,其表達增強,可抑制骨髓細胞凋亡;Bax屬于促細胞凋亡因子,其表達增強,可促進細胞凋亡。有研究表明,中藥具有干預細胞增殖,促進細胞凋亡的作用,例如青藤堿可抑制786-O細胞增殖,誘導細胞周期G1/S期阻滯,調(diào)節(jié)786-O細胞中cmyc的表達水平,誘導凋亡相關(guān)蛋白Bax和Caspase-3表達上調(diào),促進細胞凋亡[10]。中藥復方益髓理血飲能下調(diào)骨髓增生異常綜合征大鼠Bax表達,上調(diào)Bcl-2表達,減少骨髓細胞凋亡[11]。

骨髓抑制表現(xiàn)為血液不足或血液的濡養(yǎng)功能減退,患者可見精神疲倦、乏力、頭暈、面色蒼白或萎黃、唇甲蒼白、氣促、心悸、失眠、多夢、手腳麻木,舌質(zhì)淡,脈細無力,中醫(yī)可按“血虛證”進行辨證論治。中醫(yī)認為, 脾和腎與血的生成關(guān)系最為密切,血液來源于經(jīng)中焦脾胃所化生的水谷精微,如《靈樞·決氣》所說:“中焦受氣,取汁,變化而赤,是謂血?！蹦I者主水,受五臟六腑之精而藏之,精能生血?！吨T病源候論》指出:“腎藏精,精者,血之所成也?！狈断然萚12]研究表明,健脾益腎補血法能夠明顯改善肺癌化療者骨髓造血功能,提高外周血白細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血小板計數(shù)及血紅蛋白等。劉杰等[13]研究顯示,健脾益腎顆粒不但能促進骨髓有核細胞分裂,保護造血干細胞,而且能通過提高細胞免疫功能,補充營養(yǎng)物質(zhì)和微量元素等多種途徑而發(fā)揮生血作用。馬晶潔等[14]研究結(jié)果顯示,化療期間配合使用健脾補腎方可改善貧血,提高患者的生活質(zhì)量。由此可見,健脾補腎是治療骨髓抑制的主要原則。龜板固本方具有健脾補腎、填精益髓的功效。前期動物實驗證實,龜板固本方能明顯提升肺癌骨髓抑制小鼠外周血白細胞、血小板和紅細胞計數(shù),能提高骨髓造血微環(huán)境的促紅細胞生成素 、血小板生成素、粒細胞集落刺激因子含量[15],從而改善骨髓抑制,促進骨髓細胞分化增殖。

本實驗結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組G0/G1期和S期細胞比例顯著升高,G2/M期細胞比例顯著降低,表明化療不僅引起G1期阻滯,而且還造成S期阻滯;與模型組比較,龜板固本方組G0/G1期細胞比例顯著下降,S期和G2/M期細胞比例顯著升高,表明龜板固本方可能通過解除細胞G0/G1期和S期阻滯,促使G1期細胞進入S期,使S期細胞向G2/M期細胞轉(zhuǎn)化,從而促進骨髓細胞增殖,改善骨髓抑制。同時模型組Bax蛋白表達升高,Bcl-2蛋白表達降低,提示化療促進骨髓細胞凋亡;龜板固本方組Bcl-2蛋白表達上調(diào),Bax蛋白表達下調(diào),說明龜板固本方可調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達,從而抑制骨髓細胞凋亡。

本實驗在以往臨床和實驗研究的基礎(chǔ)上,進一步證實龜板固本方可通過上調(diào)Bcl-2蛋白表達和下調(diào)Bax蛋白表達,抑制肺癌骨髓抑制小鼠骨髓細胞凋亡,促進骨髓細胞增殖,為龜板固本方治療骨髓抑制提供了實驗依據(jù)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。