廖彬旭，唐善虎，李思寧，駱卓伶，周海棟，馬 源，李巧艷，陳臘梅，潘 坤

（西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041）

益生菌能產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，能在調(diào)控腸道微生態(tài)平衡及防治某些疾病中發(fā)揮重要作用[1-3]，然而胃酸和腸道膽汁鹽、消化酶等體內(nèi)環(huán)境會(huì)致多數(shù)益生菌死亡。益生菌想要發(fā)揮其益生功效，必須保證益生菌在產(chǎn)品和宿主中都保持活性和代謝穩(wěn)定[4]。GB 19302-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳》規(guī)定乳酸菌數(shù)≥106CFU/g（mL）益生菌才能發(fā)揮益生作用。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是一種能維持宿主腸道菌群平衡和提高人體免疫力的益生菌[5]。但部分植物乳桿菌穩(wěn)定性較差，進(jìn)入消化道后難以耐受胃酸、消化酶、膽汁酸等作用，限制了其益生功效的發(fā)揮[6]。

近年來，國(guó)內(nèi)外研究人員使用了不同壁材對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行包埋。Ma 等[7]采用乳蛋白為壁材制備植物乳桿菌微膠囊，包埋率達(dá)82%±5%。張宇琪等[8]采用海藻酸鹽、低酯果膠和卵磷脂復(fù)合壁材制備植物乳桿菌微膠囊，包埋率最高達(dá)89.05%。要經(jīng)緯等[6]采用海藻酸鈉為壁材制備植物乳桿菌微膠囊，包埋率達(dá)85.1%。此外，微膠囊化是常用的益生菌包埋法，通過機(jī)械攪拌或者物理化學(xué)方法，使得壁材包埋芯材，使芯材與外部環(huán)境隔絕從而提高益生菌在惡劣環(huán)境中的生存能力，并有助于其在宿主腸道的定植，提高穩(wěn)定性[7,9]。內(nèi)源乳化法是微膠囊化的常用方法，其原理是將交聯(lián)劑與芯材、壁材共混形成乳滴，在酸的作用下，內(nèi)部交聯(lián)形成微膠囊[10]。內(nèi)源乳化法制備的微膠囊具有形態(tài)及粒徑分布較為均一、安全可食用等特點(diǎn)，在食品加工中的應(yīng)用前景廣泛[11]。與一般微膠囊相比，經(jīng)過二次包埋形成的“益生菌晶球”能有效提高益生菌的穩(wěn)定性，如貯存穩(wěn)定性、胃酸耐受性和溫度耐受性等[12]。“益生菌晶球”是指包埋了益生菌的非干燥透明球體，晶球的主要成分為一種或多種具有離子凝膠性質(zhì)的食品膠體[1]。Bosnea等[13]制備的微膠囊晶球在pH=2.0 條件下處理3 h后，益生菌僅失活1.24 lg CFU/g，較微膠囊有大幅提高；劉仁杰等[14]制備的微膠囊晶球在體外消化實(shí)驗(yàn)中菌體存活率達(dá)85.73%。目前，未見有關(guān)于不同壁材的性能比較及其對(duì)微膠囊晶球制備的影響。同時(shí)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)益生菌微膠囊晶球的研究較少。

因此，本實(shí)驗(yàn)以內(nèi)源乳化法制備微膠囊晶球，通過對(duì)微膠囊形態(tài)、植物乳桿菌的包埋率與存活率釋放量等的研究，比較分析和探討海藻酸鈉、黃原膠、結(jié)冷膠及果膠作為壁材包埋植物乳桿菌的效果及優(yōu)缺點(diǎn)，為微膠囊晶球壁材的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆油 金龍魚官方旗艦店；刺梨水提物（含50%刺梨多糖） 食品級(jí)，陜西艾特生物科技有限公司；植物乳桿菌CICC-20265 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；MRS 肉湯、MRS 培養(yǎng)基 杭州微生物制劑有限公司；海藻酸鈉、吐溫80、冰乙酸、氯化鈣 成都市科隆試劑有限責(zé)任公司；黃原膠 上海瑞永生物科技有限公司；果膠 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；結(jié)冷膠、司盤80、豬膽鹽（生物試劑）

上海麥克林生化科技股份有限公司；以上試劑均為分析純；胃蛋白酶（3000 U/g） 上海如吉生物科技有限公司；胰蛋白酶（250 U/g） 上海源葉生物有限公司。

HMS-203D 加熱型磁力攪拌器 上海滬析儀器設(shè)備有限公司；MP511 pH 計(jì) 上海三信儀表廠；5804R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf 公司；MLS-3020 高壓滅菌鍋 日本Sanyo 公司；SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái)

蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHP-9052 電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；XDS-1B 倒置生物顯微鏡 重慶光電儀器有限公司；Apreo 2C 場(chǎng)發(fā)射電鏡 德國(guó)Thermo 公司；ZWY-240 全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；Spectrum RX/BX 傅里葉變換紅外光譜儀 PeakinElmer 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備 植物乳桿菌在液體MRS 培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化傳代2～3 次。將活化好的菌液于4 ℃，轉(zhuǎn)速4000 r/min 離心10 min，并用生理鹽水洗滌2 次，將洗滌后的菌體懸于生理鹽水中，根據(jù)國(guó)標(biāo)《GB 4789.35-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》對(duì)菌懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，使菌液濃度為109CFU/mL。

1.2.2 植物乳酸菌微膠囊晶球的制備 參考周艷林[11]和張明[15]的方法并略作修改。分別稱取0.6 g 刺梨水提物、3 g 海藻酸鈉/結(jié)冷膠/黃原膠/果膠和CaCO3粉末溶解于100 mL 水中，攪拌均勻，配制含刺梨水提物、海藻酸鈉/結(jié)冷膠/黃原膠/果膠和CaCO3的混合液；將植物乳桿菌懸液與配制的混合溶液按照體積比1:1 混合均勻后，加入到3 倍體積大豆油中（含體積分?jǐn)?shù)1%的司盤80）；機(jī)械攪拌形成油包水液滴后，加入200 μL 冰醋酸（純度≥99.5）繼續(xù)攪拌；用水（含體積分?jǐn)?shù)1%的吐溫80）洗滌微膠囊乳液，收集微膠囊乳液；再將收集到的微膠囊乳液與0.6%海藻酸鈉溶液按1:1 混合，經(jīng)磁力攪拌混合均勻后形成微膠囊乳液海藻酸鈉溶膠；然后將微膠囊乳液海藻酸鈉溶膠使用注射器從距液面5 cm 處滴入5%氯化鈣溶液中，制備微膠囊晶球；交聯(lián)0.5 h 后，即可獲得刺梨多糖-水凝膠微膠囊晶球，再使用去離子水洗滌微膠囊晶球3 次，最終獲得刺梨多糖-水凝膠植物乳桿菌微膠囊晶球，備用。

1.2.3 包埋率的測(cè)定 將1 g 微膠囊晶球加入到9 mL檸檬酸三鈉溶液中，在搖床中于37 ℃、230 r/min搖晃30 min，取樣，參照1.2.1 進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。植物乳桿菌包埋率（encapsulation yield，EY）可表示為：

式中：EY，包埋率，%；m0，起始添加的活菌數(shù)，CFU/mL；m2，微膠囊晶球中包埋的活菌數(shù)，CFU/g。

1.2.4 水分含量的測(cè)定 參考曹珺等[1]的方法。稱取約3 g 微膠囊晶球，在105 ℃恒溫烘箱中烘干，直到前后兩次測(cè)定質(zhì)量不變。水分含量可表示為：

式中：M1為烘干前質(zhì)量，g；M2為烘干后質(zhì)量，g。

1.2.5 微膠囊晶球的形態(tài)觀察及粒徑測(cè)定 參考周艷林等[16]的方法。取一個(gè)微膠囊晶球，置于載玻片上，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察。用測(cè)微尺測(cè)定微膠囊的粒徑，計(jì)數(shù)30 個(gè)以上，取平均值。通過掃描電子顯微鏡觀察經(jīng)-80 ℃冷凍干燥12 h 后的微膠囊晶球的微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.6 傅里葉紅外光譜掃描 參考Wu 等[17]的方法。稱取經(jīng)-80 ℃冷凍干燥12 h 的微膠囊晶球粉末，置于ATR 附件上掃描，采集范圍4000～600 cm-1，掃描次數(shù)16 次，分辨率為4 cm-1。

1.2.7 微膠囊晶球儲(chǔ)藏穩(wěn)定性 用西林瓶密封保存微膠囊晶球，并于4 ℃冰箱中冷藏放置28 d，在0、7、14、21、28 d 取微膠囊晶球按照1.2.1 的方法測(cè)定活菌數(shù)，以菌懸液活菌數(shù)為對(duì)照。

1.2.8 模擬胃液消化的存活率 參考Hu 等[18]的方法并略作修改。用0.2%（w/v）NaCl 配制模擬胃液，用HCl 調(diào)節(jié)pH 至2.0，121 ℃滅菌15 min。在胃蛋白酶參與消化的情況下，在胃液中添加0.3%（w/v）胃蛋白酶。為了進(jìn)行模擬消化，將0.5 g 樣品置于含有5 mL 胃液的試管中，然后在37 ℃下以120 r/min 連續(xù)攪拌2 h，將未經(jīng)胃液消化的微膠囊晶球與經(jīng)胃液消化2 h 后微膠囊晶球分別加入到4.5 mL 檸檬酸三鈉溶液中，在搖床中于37 ℃、230 r/min 搖晃30 min，取樣，測(cè)定包被活菌數(shù)。存活率可表示為：

式中：E1為未經(jīng)胃液消化的微膠囊晶球包埋的活菌數(shù)，CFU/g；E2為經(jīng)胃液消化2 h 后的微膠囊晶球包埋的活菌數(shù)，CFU/g。

1.2.9 模擬腸液消化釋放 參考Hu 等[18]的方法并略作修改。將0.5 g 樣品置于5 ml 無(wú)菌模擬腸液（0.05 mol/L KH2PO4、0.6%（w/v）膽鹽和1.0%（w/v）的胰蛋白酶），調(diào)節(jié)pH 為7.43，再在37 ℃下孵育3 h，模擬腸道消化。參照1.2.1 的方法測(cè)定經(jīng)腸道消化后釋放的游離活菌數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019 和Origin 2021 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和繪圖，用SPSS Statistics v 20 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行One Way 方差分析（ANOVA），采用Duncan 法進(jìn)行平均數(shù)的多重比較，顯著水平設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同壁材微膠囊晶球的包埋率

不同壁材微膠囊晶球的包埋率如圖1 所示，四種不同壁材制作的微膠囊的包埋率從大到小依次為海藻酸鈉、果膠、結(jié)冷膠、黃原膠，其中海藻酸鈉的包埋率最高，達(dá)到86.99%±0.69%，黃原膠的包埋率較低僅為18.75%±1.08%。這可能是由于黃原膠微膠囊的表面膜層較厚且較致密，植物乳桿菌不易被包埋，故包埋率較低，王遠(yuǎn)一飛等[19]在制備殼聚糖黃原膠鼠李糖乳桿菌微膠囊時(shí)也發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。此外，黃原膠、結(jié)冷膠、果膠與其他生物材料之間存在分子間相互作用及粘度協(xié)同作用，相較于單一壁材，用于二元或三元膠復(fù)合體系中能提高芯材的包埋率[20]。

圖1 不同壁材微膠囊晶球的包埋率Fig.1 Embedding rate of microcapsule pellet with different wall materials

2.2 不同壁材微膠囊晶球的理化性質(zhì)

2.2.1 不同壁材微膠囊晶球的顯微形態(tài) 如圖2 所示，利用海藻酸鈉、黃原膠、結(jié)冷膠、果膠四種不同的膠體為壁材形成的植物乳桿菌晶球均成型，其中除果膠制備的晶球的粘黏強(qiáng)度高，其余3 種膠體制備的植物乳桿菌晶球表面光滑。Hu 等[18]表示果膠的加入會(huì)影響晶球的形成，添加量過高會(huì)形成絮凝物，從而影響微膠囊成型。將制備的微膠囊晶球經(jīng)光學(xué)顯微鏡掃描，如圖3 所示，內(nèi)源乳化法制備的微膠囊為油包水結(jié)構(gòu)，圖中黑褐色部位為包埋物質(zhì)。由圖3可知，黃原膠制備的微膠囊具有更多的油包水液泡，這可能是由于黃原膠中羥基的存在使得微膠囊具有更高的親水性，Rukmanikrishnan 等[21]在制備κ-卡拉膠/黃原膠/結(jié)冷膠水凝膠膜時(shí)發(fā)現(xiàn)在膜中添加較高比例的黃原膠可顯著提高膜的含水率也印證了此觀點(diǎn)。

圖2 不同壁材制備的植物乳桿菌微膠囊晶球圖Fig.2 Spherules of Lactobacillus plantarum microcapsules prepared with different wall materials

圖3 不同壁材制備的植物乳桿菌微膠囊的光學(xué)顯微鏡圖Fig.3 Optical microscopy of Lactobacillus plantarum microcapsules prepared with different wall materials

通過掃描電子顯微鏡觀察微膠囊晶球，如圖4所示。可知微膠囊晶球經(jīng)冷凍干燥后，呈蜂窩狀，表面褶皺，凹陷，仍維持球形外觀，這是冷凍干燥常有的現(xiàn)象，其中海藻酸鈉制備的微膠囊晶球經(jīng)凍干后未出現(xiàn)孔隙，而黃原膠、結(jié)冷膠、果膠制成的微膠囊晶球出現(xiàn)孔隙，這可能是由于在冰醋酸的作用下，Ca2+釋放與海藻酸鈉形成致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提高了微膠囊晶球的穩(wěn)定性。Sharifi 等[22]利用乳清蛋白粉和阿拉伯結(jié)冷膠制備的植物乳桿菌微膠囊經(jīng)凍干后也出現(xiàn)此現(xiàn)象。

2.2.2 不同壁材微膠囊晶球的水分含量和粒徑 由表1 可知，黃原膠和結(jié)冷膠制備的晶球粒徑顯著大于海藻酸鈉和果膠制備的晶球（P<0.05），這可能是由于海藻酸鈉和果膠較于黃原膠和結(jié)冷膠有更好的水溶性，也可能是海藻酸鈉在交聯(lián)過程中海藻酸鏈間的擁擠效應(yīng)和靜電斥力減小，導(dǎo)致Ca2+局部濃度的增加和海藻酸聚合物鏈間的局部聚集，從而使海藻酸水凝膠網(wǎng)絡(luò)收縮[17,23]。結(jié)冷膠制備的微膠囊粒徑最小，為（69.65±33.96）μm，黃原膠制備的微膠囊粒徑最大，為（85.67±29.09）μm，這可能是由于結(jié)冷膠的粘度較高[24]。Yu 等[25]在制備結(jié)冷膠包埋的疏水蝦青素-親水藻青素雙重乳液時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著結(jié)冷膠濃度的增加，雙乳狀液凝膠球尺寸逐漸減小也印證了此觀點(diǎn)。微膠囊的粒徑影響微膠囊的特性[26]，研究表明，粒徑較小的微膠囊具有高比表面積和表面能，易自發(fā)團(tuán)聚，影響微膠囊的粘附性和流動(dòng)性[27]。

表1 不同壁材微膠囊晶球的物理特性Table 1 Physical characteristics of microcapsule hydrogel ball with different wall materials

水分含量也是一個(gè)必須評(píng)估的重要參數(shù)，因?yàn)樗赡軙?huì)影響包封益生菌的活性，微生物在高水分含量值時(shí)仍然具有代謝活性，而在低水分含量值時(shí)則處于潛伏狀態(tài)[27]。在本實(shí)驗(yàn)中四種壁材制作的晶球含水率較高，均達(dá)到90%以上，是由于用擠壓法二次包埋了益生菌微膠囊，從而增加了制備的晶球的含水量，其中結(jié)冷膠制得的微膠囊晶球的水分含量最高，可能是由于結(jié)冷膠網(wǎng)絡(luò)的形成使得水分子被限制在凝膠網(wǎng)絡(luò)中[25]。此外，較高的含水量能賦予微膠囊晶球更佳的口感，從而增加可食用性[18]。

2.3 不同壁材微膠囊晶球的紅外光譜表征

傅里葉變換紅外圖譜能夠顯示物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和具有特征性的化學(xué)鍵[28]，從而對(duì)微膠囊晶球結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。圖5 分別為海藻酸鈉、黃原膠、結(jié)冷膠以及果膠制作的微膠囊晶球的紅外圖譜，四條曲線在3400、1600、1450、1050 cm-1附近均具有特征吸收峰，其中3400 cm-1處寬而強(qiáng)的吸收峰是由-OH 的伸縮振動(dòng)形成的，其他三處依次為C=O、C-H 的彎曲振動(dòng)、C-O-C 的伸縮振動(dòng)[29]，不同壁材包埋的微膠囊晶球均結(jié)合了壁材和芯材的特征峰，說明植物乳桿菌被有效的包埋起來。海藻酸鈉包埋的微膠囊晶球相較于其他三種微膠囊晶球在3345 cm-1處具有更寬的峰型，說明可能形成了更強(qiáng)的氫鍵[26]。氫鍵的形成支持了壁材的相互作用，增加了微膠囊晶球的密封性。

圖5 不同壁材微膠囊晶球紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of microencapsulated hydrogel balls with different wall materials

2.4 不同壁材微膠囊晶球的貯藏穩(wěn)定性

如圖6 所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各組植物乳桿菌均有所減少（P<0.05），這可能是由于環(huán)境脅迫所致[30]。其中，微膠囊化后的活菌數(shù)在7 d 下降趨勢(shì)有所放緩，經(jīng)海藻酸鈉包埋后的效果最佳，28 d 時(shí)仍保留了66.95%。益生菌在作為配方產(chǎn)品時(shí)，應(yīng)具有貯存期的耐受性[11]。用水凝膠作為壁材包埋益生菌可以延長(zhǎng)益生菌的儲(chǔ)藏時(shí)間。羧甲基魔芋葡甘聚糖-殼聚糖[31]、果膠-殼聚糖[32]等水凝膠做為壁材包埋益生菌的研究均印證了微膠囊化可增加益生菌的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。黃原膠包埋的微膠囊在14 d 左右下降到較低指數(shù)級(jí)，這可能是由于黃原膠單一壁材的穩(wěn)定性不高，在貯藏中易從固態(tài)變?yōu)槿橐簯B(tài)[21]。

圖6 不同壁材微膠囊晶球貯藏穩(wěn)定性Fig.6 Storage stability of microencapsulated hydrogel balls with different wall materials

2.5 不同壁材微膠囊晶球在模擬胃液中的存活率

益生菌在模擬胃液中的存活率是確保菌體通過胃部定植腸道中發(fā)揮益生功能的重要指標(biāo)。由圖7可知，海藻酸鈉和黃原膠制備的微膠囊晶球相較于果膠和結(jié)冷膠有更強(qiáng)的耐胃酸能力（P<0.05），兩組微膠囊晶球在模擬胃液處理120 min 后益生菌存活率仍有71.49%±1.63%和70.54%±1.05%，說明微膠囊可以有效保護(hù)益生菌在酸性環(huán)境中的存活。這可能是由于微膠囊結(jié)構(gòu)致密，孔徑較少，機(jī)械強(qiáng)度高，能較好地抵御胃液滲透，從而可以提高益生菌的存活率[16]。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，海藻酸鈉制備的微膠囊晶球在胃酸中收縮，這可能是由于：在酸性條件下，海藻酸納羧基質(zhì)子化，由于靜電斥力減弱，導(dǎo)致海藻酸鈉收縮[33]。元博[34]在使用海藻酸鈉制備嗜酸乳桿菌及雙歧桿菌微膠囊的研究中發(fā)現(xiàn)胃酸環(huán)境下，包埋后的微膠囊菌體存活率更高，達(dá)到70%以上，與本研究基本吻合。

圖7 不同壁材微膠囊晶球經(jīng)胃消化植物乳桿菌存活率Fig.7 Survival rate of gastric digestion of microencapsulated hydrogel balls with different wall materials

2.6 不同壁材微膠囊晶球在模擬腸液中的釋放試驗(yàn)

益生菌微膠囊晶球在腸道中能否釋放是判定微膠囊是否具有益生效果的重要條件。不同壁材制備的微膠囊晶球經(jīng)模擬腸液消化后的釋放活菌數(shù)見圖8。由圖可知，經(jīng)腸道消化180 min 后海藻酸鈉制備的微膠囊晶球釋放量最大，達(dá)（2.51±0.1）×109CFU/g，表明其具有良好的腸溶性，而黃原膠、結(jié)冷膠、果膠制備的微膠囊晶球釋放量均低于2×108CFU/g。產(chǎn)生這一結(jié)果的主要原因可能是海藻酸鈉可依賴Ca2+形成可逆性凝膠，當(dāng)外界環(huán)境中存在與Ca2+結(jié)合能力更強(qiáng)的PO43+時(shí)，將引起凝膠結(jié)構(gòu)破裂，進(jìn)而釋放出益生菌[35]。此外，植物乳桿菌微膠囊晶球在腸液中的釋放量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在胃液中的釋放量，Zhao 等[36]在研究中也發(fā)現(xiàn)微膠囊在腸液中的溶脹性明顯要大于在胃液中的溶脹性，在胃液中，微膠囊呈收縮趨勢(shì)，能有效保護(hù)益生菌免受酸性損傷。

圖8 不同壁材微膠囊晶球經(jīng)腸消化釋放結(jié)果Fig.8 Release of microencapsulated hydrogel balls with different wall materials through intestinal digestion

3 結(jié)論

本文以植物乳桿菌為芯材，以海藻酸鈉、黃原膠、結(jié)冷膠以及果膠四種多糖水凝膠為壁材，通過內(nèi)源乳化法制備微膠囊，并通過擠壓法制備微膠囊晶球，探討不同壁材對(duì)微膠囊晶球性能的影響。本研究認(rèn)為四種壁材對(duì)植物乳桿菌的包埋具有較好的效果，形成的微膠囊晶球均為球形，外貌形態(tài)較好。海藻酸鈉對(duì)植物乳桿菌的包埋率為86.99%，經(jīng)胃液消化后存活率為71.49%，在模擬腸液中菌體的溶出量為2.51×109CFU/g，表現(xiàn)出優(yōu)異的效果，制成的微膠囊晶球貯藏穩(wěn)定性好、結(jié)構(gòu)緊密、性能良好。研究結(jié)果為植物乳桿菌微膠囊晶球的壁材選擇提供借鑒方法，并有利于植物乳桿菌微膠囊化生產(chǎn)及其在食品工業(yè)中應(yīng)用。