尹 苗，扶星星，陳希文，王 聰，謝作杰，董鵬宇，鄧永濤

（1.四川百諾吉科技有限公司，四川綿陽(yáng) 621000；2.四川生豬重大疫病監(jiān)測(cè)與防控工程研究中心，四川綿陽(yáng) 621000）

豬細(xì)小病毒（PPV）是一種無(wú)包膜、二十面體對(duì)稱病毒，其基因組大小為4.0～6.3 kb，存在多種基因型（PPV1～7）。PPV感染可導(dǎo)致初產(chǎn)母豬和經(jīng)產(chǎn)母豬出現(xiàn)不孕，流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎以及重復(fù)返情等繁殖障礙[1-2]，同時(shí)PPV也是造成斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合癥的病原之一[3]。此外，PPV還可與豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、偽狂犬病病毒（PRV）、豬瘟病毒（CSFV）及多種細(xì)菌發(fā)生混合感染，加重對(duì)動(dòng)物機(jī)體的致病程度[4-6]，因此加強(qiáng)PPV感染監(jiān)測(cè)十分必要。

豬細(xì)小病毒2型（PPV2）是新型病毒，由單股負(fù)鏈DNA構(gòu)成，兩端具有不同的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，2001年被緬甸學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)[7]，2006年被正式歸類為PPV2。PPV2全長(zhǎng)5 486 bp，包含兩個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），其中ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2編碼結(jié)構(gòu)蛋白。研究[8-12]發(fā)現(xiàn)，PPV2普遍存在于歐洲、亞洲和北美洲。近幾年，PPV2、PPV3在我國(guó)的檢出率呈上升趨勢(shì)[13]。綿陽(yáng)市是四川省生豬養(yǎng)殖大市，每年可供應(yīng)育肥豬數(shù)百萬(wàn)頭，目前尚缺少該地區(qū)集約化養(yǎng)豬場(chǎng)PPV2的感染及毒株變異信息。

本研究采集了2021—2022年綿陽(yáng)市三臺(tái)縣、梓潼縣、北川縣、江油市等地區(qū)10個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)的296份臨床病豬血清樣品，利用PCR技術(shù)進(jìn)行了PPV2檢測(cè)，并利用DNA MAN等軟件進(jìn)行了全基因組遺傳變異分析，旨在了解PPV2感染及遺傳變異現(xiàn)狀。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

2021—2022年采集綿陽(yáng)市三臺(tái)縣、梓潼縣、北川縣、江油市等地區(qū)10個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)中表現(xiàn)高燒、流產(chǎn)或腹瀉癥狀的296份生豬血清樣品。所有樣品均由四川生豬重大疫病監(jiān)測(cè)與防控工程研究中心鑒定和保存。

1.2 主要試劑

DL 2 000 DNA Maker、DNA提取試劑盒、2×TaqPCR Master Mix、ddH2O、Gene Green核酸染料，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖，購(gòu)自上海必德生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

下載GenBank中已發(fā)表的PPV2基因序列，利用DAN MAN和Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1），送至擎科生物科技股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 核酸提取與目的片段擴(kuò)增

血清樣品經(jīng)12 000 r/min離心后，吸取200 μL樣品上清液，按DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒DNA。以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系見(jiàn)表2。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并置于凝膠成像儀下觀察是否有目的條帶。陽(yáng)性樣品送至擎科生物科技股份有限公司測(cè)序。

表2 PCR反應(yīng)體系

1.5 PPV2全基因組序列擴(kuò)增與測(cè)序

下載GenBank中已公布的PPV2全基因組序列，使用DNA MAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)。按照退火溫度50～70 ℃，GC含量40%～60%設(shè)計(jì)PPV2全基因組引物，利用PCR對(duì)全基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增，具體引物信息見(jiàn)表3。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將陽(yáng)性產(chǎn)物切膠回收、克隆后，送至擎科生物科技股份有限公司測(cè)序。

表3 全基因組引物信息

1.6 PPV2全基因組序列分析

應(yīng)用DNA MAN軟件將拼接序列與參考毒株序列（表4）進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列同源性比對(duì)。利用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（Neighbor-Joining），分析分離株的遺傳特征。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 PPV2-11-MY全基因組分段擴(kuò)增結(jié)果

表4 參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 PPV2檢測(cè)情況

利用PCR方法對(duì)296份臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（圖1、表5）顯示：PPV2檢出率為1.69%（5/296），其中三臺(tái)縣檢出率為2.19%（2/91），梓潼縣為1.81%（1/55），江油市為1.00%（1/100），北川縣為2.00%（1/50）。

表5 不同地區(qū)PPV2檢出情況

2.2 PPV2全基因組序列分析

2.2.1 PPV2全基因組擴(kuò)增 選取其中1份PPV2陽(yáng)性樣品（命名為PPV2-11-MY）進(jìn)行全基因組PCR分段擴(kuò)增。結(jié)果（圖2）顯示，PPV2-11-MY在568、901、1 099、986、991、1 067、689、406 bp處均出現(xiàn)目的條帶。

2.2.2 PPV2全基因組遺傳變異分析 將分段基因測(cè)序、拼接后進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，利用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果（圖3）顯示，PPV2-11-MY與12株P(guān)PV2參考毒株的核苷酸同源性為93.96%～99.30%，氨基酸同源性為52.50%～73.80%，其中與我國(guó)江蘇省毒株MW853949.1的同源性最高，二者屬于同一分支。

圖3 PPV2-11-MY與參考毒株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

將PPV2-11-MY株全基因組序列轉(zhuǎn)換為氨基酸序列，使用DNA MAN軟件與參考毒株進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。結(jié)果（圖4）顯示：PPV2-11-MY全基因組序列存在兩個(gè)ORF。ORF1長(zhǎng)度1 848 bp，編碼616個(gè)氨基酸；ORF2長(zhǎng)度3 126 bp，編碼1 042個(gè)氨基酸。存在3個(gè)高突變區(qū)，第一突變區(qū)（91～218 aa）有85個(gè)氨基酸突變和13個(gè)氨基酸缺失，第二突變區(qū)（513～626 aa）有81個(gè)氨基酸突變和12個(gè)氨基酸增加，第三突變區(qū)（776～1 065 aa）有189個(gè)氨基酸突變、11個(gè)氨基酸增加和19個(gè)氨基酸缺失。此外，在ORF2編碼蛋白的保守區(qū)有少量氨基酸突變，包括第1 127位Lys（K）變?yōu)镚ln（Q），第1 562位Gln（Q）變?yōu)锳rg（R），第1 656位Thr（T）/Pro（P）變?yōu)锳la（A）以及第1 791位Ala（A）/Leu（L）變?yōu)閂al（V）。

圖4 PPV2-11-MY株氨基酸比對(duì)結(jié)果

3 討論

近年來(lái)，PPV2在全球范圍內(nèi)的檢出率逐漸增高，引起各國(guó)學(xué)者的廣泛關(guān)注。雖然國(guó)外已經(jīng)有部分PPV2調(diào)查研究，但其在我國(guó)特別是四川省的研究相對(duì)較少。隨著PPV的傳播變異，現(xiàn)有疫苗已無(wú)法有效防控PPV2等新型PPV。因此，了解各地PPV2遺傳變異情況對(duì)于新疫苗開(kāi)發(fā)至關(guān)重要。

研究顯示：2010年，PPV在德國(guó)100頭豬心臟和扁桃體樣品中的陽(yáng)性檢出率分別為32%和46%[14]；2011年，在泰國(guó)清邁地區(qū)80份組織樣品中的陽(yáng)性檢出率為83%[15]；2004—2014年，在我國(guó)450頭家豬組織樣本中的陽(yáng)性檢出率為22.44%[16]；2015—2017年，在波蘭254份豬血清中的陽(yáng)性檢出率為53.9%[17]；2016—2020年，在我國(guó)435份豬血清中的陽(yáng)性檢出率為22.53%[18]；2022年，在韓國(guó)268份血清樣品中的陽(yáng)性檢出率為12.2%[19]。為了解四川省綿陽(yáng)市是否存在PPV2流行，本研究對(duì)從4個(gè)地區(qū)10個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)收集的296份豬血樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果PPV2檢出率為1.69%，在4個(gè)地區(qū)均有檢出。雖然PPV2檢出率較低，但仍證明PPV2在綿陽(yáng)市存在一定的傳播面。

為進(jìn)一步了解綿陽(yáng)市PPV2與其他地區(qū)PPV2毒株之間的親緣性和遺傳變異性，將PPV2-11-MY進(jìn)行分段擴(kuò)增拼接后，獲得全長(zhǎng)為5 506 bp的全基因組序列。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示：PPV2-11-MY株與我國(guó)江蘇省毒株（MW853949.1）親緣性最近且屬于同一分支，與其余11條參考序列的親緣性相對(duì)較遠(yuǎn)。PPV2 ORF1編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白，主要參與病毒復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過(guò)程；ORF2主要編碼的結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒的骨架構(gòu)成及抗原表位形成，其中172～412 aa和713～924 aa的抗原指數(shù)和親水性最高[20-23]。測(cè)序結(jié)果顯示：PPV2-11-MY的ORF1和ORF2編碼蛋白存在3個(gè)高突變區(qū)（91～218、513～626、776～1 065 aa），其中第一和第三高變區(qū)位于上述抗原指數(shù)和親水性高的區(qū)域。結(jié)果提示，PPV2-11-MY可能在致病性和免疫原性等方面發(fā)生了較大變化，但其病原特性的具體變化還有待于進(jìn)一步研究。

對(duì)綿陽(yáng)市進(jìn)行PPV2檢測(cè)和遺傳變異分析不僅豐富了PPV2感染流行病學(xué)數(shù)據(jù)，為后續(xù)疫苗研究提供理論依據(jù)，同時(shí)也為進(jìn)一步研究PPV2致病機(jī)理及毒力奠定基礎(chǔ)。雖然綿陽(yáng)市PPV2感染率較低，但在當(dāng)前全國(guó)豬病復(fù)雜、貿(mào)易頻繁的背景下，包括PPV2感染在內(nèi)的各種疫病防控壓力依然很大。為了降低疫病傳播風(fēng)險(xiǎn)，養(yǎng)殖場(chǎng)必須進(jìn)一步提高生物安全意識(shí)，加強(qiáng)引種檢測(cè)，強(qiáng)化基礎(chǔ)免疫，優(yōu)化飼養(yǎng)管理，定期做好免疫監(jiān)測(cè)，確保豬群健康無(wú)疫。