朱小麗，陳小麗，程曉霞，林鋒強(qiáng)，王 劭，江丹丹

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建福州 350013；2.三明市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，福建三明 365000）

番鴨呼腸孤病毒病從1997年開始在福建省莆田市、福州市等多地發(fā)生，臨床上以肝、脾表面有多量針尖狀白色壞死點(diǎn)為主要病理變化，俗稱番鴨“肝白點(diǎn)病”[1-2]。該病主要發(fā)生于40日齡內(nèi)番鴨，發(fā)病率可達(dá)30%～90%，病死率可達(dá)60%～80%[3-4]。2010年前，福建省為國內(nèi)主要番鴨飼養(yǎng)區(qū)，番鴨呼腸孤病毒病在莆田市、漳州市等地多有發(fā)生，造成的危害尤其嚴(yán)重[3，5-7]。2010年后番鴨在江西、浙江和廣東等省份的養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，番鴨呼腸孤病毒病流行范圍隨之越來越廣。

番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）活疫苗2013年獲得國家一類新獸藥證書，2014年商品化疫苗上市。隨著商品化疫苗的推廣應(yīng)用，番鴨呼腸孤病毒病的發(fā)病率和病死率大大降低。臨床生產(chǎn)表明，MDRV活疫苗對(duì)番鴨呼腸孤病毒病的保護(hù)率可達(dá)90%以上[8-9]。然而小規(guī)模的番鴨呼腸孤病毒病疫情依然零星發(fā)生，其主要原因是很多散養(yǎng)戶沒有進(jìn)行疫苗免疫[9]。為了解MDRV的分子流行病學(xué)特征，2021—2022年在福建省不同地區(qū)的番鴨發(fā)病飼養(yǎng)場收集臨床樣品進(jìn)行病毒檢測、病原分離鑒定和基因序列分析，來評(píng)價(jià)MDRV流行毒株的生物學(xué)特性，以期為該病防控提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

80只1日齡雛番鴨和12日齡番鴨胚，購自漳州昌龍農(nóng)牧有限公司；樣品基因組提取試劑盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit和RT-PCR試劑Onestep RT-PCR SuperMix，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；MDRV-MW9710株，由本實(shí)驗(yàn)室保存；所用引物，由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 樣品來源

2021—2022年從福建省莆田、三明、漳州、南平等地收集15～20日齡番鴨疑似臨床病例的肝脾組織病料樣品125份。病例臨床癥狀為采食量降低、精神沉郁、軟腳等，剖檢無包心包肝癥狀。

1.3 病原檢測

MDRV檢測引物，按照MDRV-MW9710株S4基因（KY580159）設(shè)計(jì)。上游引物MDRV-P1：CTACC TCAAA TGGTC GCAAT GGAG；下游引物MDRV-P2：GATCG TGTTG CCAAG TTAGA ACGAG（擴(kuò)增長度500 bp，退火溫度56 ℃）。將臨床病料樣品按照1:5比例磨成勻漿，取200 μL按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit說明書提取病毒RNA。將所得核酸通過One-step RT-PCR SuperMix進(jìn)行MDRV RT-PCR檢測。RT-PCR反應(yīng)體系（50 μL）：病毒RNA 5 μL，2×TS Onestep Reaction Mix 25 μL，One-step Enzyme Mix 1 μL，上游和下游引物各1 μL，無核酶水17 μL。反應(yīng)程序：45 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將所得產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠，120 V電泳20 min，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

1.4 病原分離

按照文獻(xiàn)[10]方法，將MDRV陽性病料接種12日齡番鴨胚，收集48～96 h死亡胚尿囊液，提取DNA/RNA后進(jìn)行MDRV、番鴨小鵝瘟病毒（MDGPV）、番鴨細(xì)小病毒（MDPV）、鴨新型呼腸孤病毒（NDRV）、鴨病毒性肝炎病毒（DHV）病原檢測。

1.5 母源抗體檢測

采集1日齡番鴨血液0.2 mL，分離血清后按照文獻(xiàn)[9]中的方法檢測中和抗體。

1.6 攻毒試驗(yàn)

將40只1日齡雛番鴨分成8組，每組5只，其中MDRV分離株攻毒組6組（6株分離毒株各1組）、MDRV-MW9710株攻毒組1組和空白對(duì)照組1組。攻毒組每只番鴨肌內(nèi)注射0.2 mL MDRV尿囊液，空白對(duì)照組每只注射同劑量的Hanks液。攻毒后觀察和記錄番鴨的發(fā)病死亡情況。

1.7 免疫攻毒試驗(yàn)

將40只1日齡雛番鴨免疫M(jìn)DRV活疫苗1羽份/只。7日齡時(shí)分成8組進(jìn)行攻毒試驗(yàn)（攻毒劑量0.2 mL/只），每組5只，其中攻毒組7組（6組MDRV分離株和1組MDRV-MW9710毒株），對(duì)照組1組。攻毒后觀察和記錄番鴨發(fā)病死亡情況。

1.8 序列測定及進(jìn)化樹分析

按照MDRV-ZJ2000M株S4基因（KF306091）設(shè)計(jì)引物（上游引物MDRV-S4P1：GCTTTTTCCTTCTCCTTAGTG；下游引物MDRVS4P2：GATGAATAGCCCTTCCCC GCGG），擴(kuò)增長度1 124 bp。取200 μL MDRV分離株尿囊液，按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit說明書提取病毒RNA。RT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同1.3。按照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行PCR檢測。將所得到的產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司福州分公司進(jìn)行序列測定以及同源性和進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床樣品病原檢測

收集的臨床病料樣品來自福建省4個(gè)地區(qū)的125家養(yǎng)殖場。115家養(yǎng)殖場在番鴨1日齡時(shí)免疫過MDRV活疫苗，在其病料樣品中均未檢測到MDRV強(qiáng)毒；10家在1日齡時(shí)沒有免疫M(jìn)DRV活疫苗，在其病料樣品中檢測出MDRV強(qiáng)毒6份，其中4份來自南平市，2份分別來自三明市和莆田市（表1）。結(jié)果表明，MDRV活疫苗能夠有效預(yù)防MDRV感染。

表1 臨床樣品MDRV檢測結(jié)果 單位：份

2.2 病毒分離及檢測

在番鴨胚上將6份MDRV臨床陽性病料進(jìn)行傳代，結(jié)果發(fā)現(xiàn)番鴨胚接種病料后均100%死亡，解剖發(fā)現(xiàn)胚體肝臟有白色壞死點(diǎn)。對(duì)相應(yīng)尿囊液進(jìn)行PCR檢測，僅能檢測到MDRV，其他病毒均為陰性（表2）。

表2 MDRV分離株尿囊液病毒檢測結(jié)果

2.3 母源抗體檢測及攻毒試驗(yàn)

80只番鴨1日齡血清中和抗體效價(jià)檢測結(jié)果顯示，63份血清效價(jià)為20，17份血清效價(jià)為2-1。6株MDRV攻毒4～5 d后，攻毒組番鴨開始發(fā)病，7～14日齡多發(fā)，各組發(fā)病率為60%～100%，主要表現(xiàn)為拉稀、不愿站立、少食。番鴨死亡時(shí)間為攻毒后7～14 d（7～14日齡），死亡率為40%～60%（表3）。對(duì)死亡番鴨解剖發(fā)現(xiàn)，其肝臟和脾臟均有大量灰白色針尖狀壞死點(diǎn)。20日齡后，存活番鴨臨床癥狀逐漸消失，但生長緩慢，變成僵鴨。6組分離株攻毒組的發(fā)病率、病死率和臨床癥狀均與MDRVVMW9710株攻毒組相近（表3）。

表3 番鴨攻毒試驗(yàn)結(jié)果 單位：只

2.4 免疫攻毒試驗(yàn)

1日齡番鴨免疫M(jìn)DRV活疫苗后，7日齡時(shí)使用6株分離株和MW9710株分別進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，結(jié)果各組均未見發(fā)病和死亡現(xiàn)象（表4），表明MDRV活疫苗能夠抵抗不同MDRV分離株的感染。

表4 番鴨免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果 單位：只

2.5 序列測定及進(jìn)化樹分析

6株MDRV分離株均能擴(kuò)增出1 124 bp條帶（圖1）。同源性分析結(jié)果（圖2）顯示：6株MDRV分離株的S4基因核苷酸序列與MDRVMW9710株一致。6株MDRV分離株之間的同源性為99.3%～99.7%，與國內(nèi)MW9710株和ZJ2000M株同源性分別為98.9%～99.2%和96.1%～96.5%，與MDRV國外分離株89026和D2044株同源性分別為89.9%～90.6%和86.9%～87.2%。結(jié)果表明，2021—2022年福建省流行的MDRV毒株與國內(nèi)流行株同源性較近，而與國外流行株同源性較遠(yuǎn)。進(jìn)化樹分析結(jié)果（圖3）顯示：6株分離株與MDRVMW9710株屬于同一分支，而與國外分離株屬于不同分支。

圖1 MDRV分離株S4基因擴(kuò)增圖譜

圖2 6株MDRV分離株與參考株同源性分析結(jié)果

圖3 6株MDRV分離株進(jìn)化樹分析結(jié)果

3 討論

番鴨呼腸孤病毒病自1997年在福建省莆田市和福州市大規(guī)模暴發(fā)后，逐漸在廣東、浙江等省份蔓延開來，造成番鴨大量死亡，經(jīng)濟(jì)損失極為嚴(yán)重[3]。由于當(dāng)時(shí)沒有特效藥物和疫苗，疫情難以控制[1]，給番鴨養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失，導(dǎo)致鴨農(nóng)飼養(yǎng)番鴨信心不足[5，7]。

目前福建省番鴨飼養(yǎng)區(qū)主要集中在漳州市、三明市、莆田市、南平市等地。這幾個(gè)地區(qū)的番鴨總飼養(yǎng)量占全省90%以上。2014年MDRV活疫苗被成功研制上市后，該病的大規(guī)模暴發(fā)大大減少。臨床生產(chǎn)證實(shí)，MDRV活疫苗免疫對(duì)MDRV感染的保護(hù)率可達(dá)90%以上[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，目前福建省番鴨群中依然存在MDRV感染，但其主要散發(fā)于未免疫M(jìn)DRV疫苗的鴨群，流行毒株與國內(nèi)早期流行毒株同源性較高。

MDRV的S4基因序列在整個(gè)基因組中變異程度最大，其編碼的σC蛋白是病毒外殼上一種結(jié)構(gòu)蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量最小，其功能是結(jié)合細(xì)胞，啟動(dòng)病毒感染。σC蛋白氨基酸序列38～72位存在一個(gè)卷曲螺旋（coiled-coil）結(jié)構(gòu)，它與N末端的疏水性氨基酸形成一個(gè)具有錨定功能的纖維性尾部，通過識(shí)別宿主細(xì)胞啟動(dòng)病毒感染[11-14]。6株分離株的纖維性尾部高度保守，與1997年流行毒株MDRV-MW9710株同源性為98.6%～99.4%，存在變異的可能。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，6株分離株與MDRV-MW9710株屬于同一分支，而與國外分離株屬于不同分支。

綜上，MDRV感染在福建省未免疫番鴨群中依然存在，流行毒株的生物學(xué)特性和基因組特性較為穩(wěn)定，變異程度小，當(dāng)前疫苗的可有效防控該病流行，因此要重視MDRV活疫苗的免疫。