王非凡　王慶?！埓T　李廣忠

摘要：目的 探討TiO₂納米管表面聚合物輔助沉積五氧化二鉭（Ta₂O₅）涂層對小鼠成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1生物學(xué)活性的影響。方法 制備出Ta/TiO₂納米管（Ta/NT組）、Ta₂O₅/純鈦（Ta₂O₅/PT組）及Ta₂O₅/TiO₂納米管（Ta₂O₅/NT組）3組樣本，其中后2組的Ta₂O5涂層通過聚合物輔助沉積法制備。對3組樣品進(jìn)行表征檢測：掃描電鏡（SEM）觀察表面形貌，X射線光電子能譜（XPS）分析表面元素組成，X射線衍射（XRD）檢測表面化合物。選用MC3T3-E1細(xì)胞探討3組樣品對細(xì)胞生物學(xué)活性影響；熒光顯微鏡觀察細(xì)胞骨架和細(xì)胞核的黏附；CCK-8法測定細(xì)胞活性；檢測細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）活性；茜素紅染色后半定量分析鈣沉積；Real-time PCR檢測成骨標(biāo)志基因重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）、ALP、骨鈣蛋白（OCN）和骨橋蛋白（OPN）的基因表達(dá)。結(jié)果 SEM圖像顯示Ta₂O₅/NT組表面可見TiO₂納米管基底表面覆蓋片狀、帶狀交聯(lián)的微-納米級(jí)Ta₂O₅涂層結(jié)構(gòu)；XRD顯示Ta₂O₅/NT組的TiO₂納米管呈現(xiàn)微量的脫礦鈦及金紅石晶體結(jié)構(gòu)；與Ta/NT組比，Ta₂O₅/NT組和Ta₂O₅/PT組黏附細(xì)胞核密度較高，細(xì)胞骨架塊狀、絲狀結(jié)構(gòu)相對較大，交聯(lián)、團(tuán)簇狀較多，細(xì)胞骨架張力較大，具有較高的細(xì)胞活力；茜素紅染色樣本半定量分析顯示Ta₂O₅/NT組、Ta/NT組、Ta₂O₅/PT組鈣沉積量依次降低（P＜0.01）；Ta₂O₅/NT組、Ta/NT組和Ta₂O₅/PT組7 d和14 d 的ALP活性、鈣沉積量和ALP、OCN、OPN mRNA含量依次降低，14 d Ta₂O₅/NT組的BMP-2 mRNA含量在3組中最高（P＜0.05）。結(jié)論 Ta₂O₅/TiO₂納米管復(fù)合涂層可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞黏附、細(xì)胞活性、ALP活性、礦化及成骨相關(guān)基因的表達(dá)，有利于其生物學(xué)活性的發(fā)揮。

關(guān)鍵詞：鈦；納米管；Ta；Ta₂O₅涂層；聚合物輔助沉積；表面改性；生物活性

中圖分類號(hào)：R783.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20230648

Effects of polymer assisted deposition of Ta₂O₅coating on the surface of TiO₂nanotubes on improving the biological activity of MC3T3-E1 cells

WANG Feifan1， WANG Qingfu1， ZHANG Shuo1， LI Guangzhong2△

1 Department of Oral Implantology， Tianjin Stomatological Hospital， School of Medicine， Nankai University， Tianjin 300041， China; 2 State Key Laboratory of Porous Metal Materials， Northwest Institute for Nonferrous Metal Research

△Corresponding Author E-mail： shlgznin@126.com

Abstract： Objective To explore the effect of polymer assisted deposition of tantalum pentoxide （Ta₂O₅） coating on the surface of TiO₂nanotubes on the biological activity of mouse bone forming precursor cells， MC3T3-E1 cells. Methods Three sets of samples were prepared， including Ta/TiO₂nanotubes （the Ta/NT group）， Ta₂O₅/pure titanium （the Ta₂O₅/PT group） and Ta₂O₅/ TiO₂nanotubes （the Ta₂O₅/NT group）. The Ta₂O₅/PT group and the Ta₂O₅/NT group were prepared by polymer-assisted deposition. The three sets of samples were characterized and tested by scanning electron microscopy （SEM） to observe the surface morphology. X-ray photoelectron spectroscopy （XPS） was used to analyze surface element composition， and X-ray diffraction （XRD） was used to detect surface compounds. MC3T3-E1 cells were selected to explore the effect of three groups of samples on cell biological activity. Fluorescence microscope was used to observe the adhesion of cytoskeleton and nucleus. Cell activity was determined by CCK-8 method. Cell alkaline phosphatase （ALP） activity was detected. Calcium deposition was detected by alizarin red staining and semi-quantitative analysis. The expression levels of recombinant human bone morphogenetic protein-2 （BMP-2）， ALP， osteocalcin （OCN） and osteopontin （OPN） were detected by real-time PCR. Results SEM images showed that on the surface of the Ta₂O₅/NT group， the TiO₂nanotube substrate was covered with a sheet-like， banded cross-linked micro-nano Ta₂O₅coating structure. XRD showed that the TiO₂nanotubes in the Ta₂O₅/NT group presented a trace of demineralized titanium and rutile crystal structure. Compared with the Ta/NT group， the Ta₂O₅/NT group and the Ta₂O₅/PT group showed higher cell density， larger cytoskeletal mass and filamentous structure， more crosslinking and clusters， higher cytoskeletal tension and higher cell activity. The semi-quantitative analysis of alizarin red staining samples showed that calcium deposition decreased successively in the Ta₂O₅/NT group， the Ta/NT group and the Ta₂O₅/PT group? （P＜0.01）. The ALP activity， calcium deposition and ALP， OCN and OPN mRNA contents on day 7 and 14 were decreased successively in the Ta₂O₅/NT group， the Ta/NT group and the Ta₂O₅/PT group， and the BMP-2 mRNA content on day 14 in the Ta₂O₅/NT group was the highest in the three groups （P＜0.05）. Conclusion Ta₂O₅/TiO₂nanotube composite coating can promote the adhesion of MC3T3-E1 cells， the expression of mineralization and osteogenic genes， and enhance the activities of cell and ALP， which is conducive to the play of biological activities.

Key words： Titanium; nanotubes; Tantalum; Tantalum pentoxide coating; polymer-assisted deposition; surface characterization; biological activity

對鈦種植體進(jìn)行表面改性是近年來學(xué)者們研究的熱點(diǎn)，可縮短種植周期并增強(qiáng)骨結(jié)合強(qiáng)度。TiO₂納米管具有獨(dú)特的納米管形貌、優(yōu)異的理化特性（粗糙度和親水性）及成骨活性［1-2］。目前，TiO₂納米管成骨研究方向主要集中在復(fù)合表面處理以協(xié)同發(fā)揮骨結(jié)合作用［3-5］。鉭（Ta）涂層具有優(yōu)良的化學(xué)穩(wěn)定性、生物相容性及成骨性能［6-8］。然而Ta優(yōu)良性能可歸功于其表面穩(wěn)定的五氧化二鉭（Ta₂O₅）［9］。相關(guān)研究顯示，與單純Ta涂層相比，Ta₂O₅涂層具有較強(qiáng)的生物相容性及親水性，有利于鈣磷的沉積［10-11］。聚合物輔助沉積法是一種較好的Ta₂O₅涂層制備方法，工藝簡單有效，可控性較強(qiáng)，還可以通過熱處理提高涂層的致密度及結(jié)合強(qiáng)度［12］。本課題組前期已在TiO₂納米管上制備Ta薄膜，結(jié)果顯示此復(fù)合涂層可協(xié)同促進(jìn)小鼠成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞的分化及鈣磷沉積［13］。本研究擬進(jìn)一步通過聚合物輔助沉積法將Ta₂O₅涂層加載至TiO₂納米管表面形成Ta₂O₅/TiO₂納米管復(fù)合涂層，以期制備出具有較強(qiáng)生物學(xué)活性的種植體表面改性涂層。

1 材料與方法

1.1 材料

純鈦購自西北有色金屬研究院；MC3T3-E1細(xì)胞購自蘇州海星生物公司；五氯化鉭（TaCl5）購自德國默克公司；胎牛血清購自美國Sciencell公司；青霉素鏈霉素、多聚甲醛、Triton X-100購自北京索萊寶公司；α-MEM完全培養(yǎng)基、Trizol及X射線光電子能譜分析儀購自美國賽默飛世爾公司；骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基購自美國賽業(yè)生物公司；Hoechst購自上海聯(lián)邁生物公司；Phalloidin-Alexa-Fluor 555購自英國艾博抗公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)；堿性磷酸酶（ALP）活性測定試劑盒購自蘇州科銘公司；RNA提取試劑盒購自德國凱杰公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司；掃描電鏡購自日本電子公司；X射線衍射儀購自德國布魯克公司；激光共聚焦掃描顯微鏡購自德國徠卡公司；酶標(biāo)儀購自瑞士帝肯公司。

1.2 各組試樣制備

將直徑1.4 cm的純鈦片用280、600、1 200目碳化硅砂紙序列打磨拋光，依次經(jīng)丙酮、無水乙醇及去離子水進(jìn)行超聲清洗10 min后，室溫下自然干燥備用。將處理好的試樣隨機(jī)分成Ta/TiO₂納米管（Ta/NT）組、Ta₂O₅/純鈦（Ta₂O₅/PT）組及Ta₂O₅/TiO₂納米管（Ta₂O₅/NT）組。TiO₂納米管及Ta/NT組試樣制備參照文獻(xiàn)［10］。Ta₂O₅/PT組及Ta₂O₅/NT組的Ta₂O₅涂層通過聚合物輔助沉積法制備：將6 g TaCl5溶解到1 L無水乙醇中。隨后將預(yù)處理的純鈦及TiO₂納米管放置在此溶液中30 s，取出后放入烘箱80 ℃烘干，并在500 ℃馬弗爐中處理1 h。Ta₂O₅/PT組重復(fù)此操作3遍，而Ta₂O₅/NT組僅操作1次。

1.3 表征檢測

1.3.1 掃描電鏡（SEM）觀察表面形貌

通過濺射鍍膜法在3組表面濺射20 nm厚的金鈀薄膜，在5 kV加速電壓下采用SEM觀察試樣的表面形貌。

1.3.2 X射線光電子能譜（XPS）分析表面元素組成

采用XPS檢測3組試樣表面元素的組成及化學(xué)狀態(tài)，采用單色Al Kα（hv=1 486.6 eV）X射線，使用45°發(fā)射角氬離子轟擊濺射，結(jié)合能的參考值為284.8 eV的C1s峰。

1.3.3 X射線衍射（XRD）檢測表面化合物

在40 kV、40 mA及銅Kα輻射（λKα=1.540 6 ?）的條件下，采用XRD儀檢測樣品表面產(chǎn)生的化合物。

1.4 體外細(xì)胞試驗(yàn)

1.4.1 MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)

選用MC3T3-E1細(xì)胞探討3組樣品對細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。在37 ℃、5%CO2條件下，將MC3T3-E1細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每3 d采用0.25%胰蛋白酶消化傳代細(xì)胞，將第3代用于隨后的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。將3組樣品經(jīng)高壓滅菌后置于24孔板中。將MC3T3-E1細(xì)胞以2×104個(gè)/mL的密度接種于樣品表面，在上述培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在第3天更換為含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素、10 nmol/L地塞米松、150 mg/L抗壞血酸和10 mmol/L β-磷酸甘油的α-MEM骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞分化檢測（ALP活性檢測、茜素紅染色、成骨標(biāo)志基因檢測），每3 d更換骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

1.4.2 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞骨架和細(xì)胞核黏附

將MC3T3-E1細(xì)胞在3組試樣表面培養(yǎng)1 d后，采用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，并使用0.1%Triton X-100進(jìn)行滲透。隨后加入Phalloidin-Alexa-Fluor 555和Hoechst分別染色黏附細(xì)胞的細(xì)胞骨架及細(xì)胞核，采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察。

1.4.3 CCK-8法測定細(xì)胞活性

使用CCK-8試劑盒檢測MC3T3-E1細(xì)胞在3組試樣的細(xì)胞活力。培養(yǎng)1、4、7 d后，在每孔中加入900 μL新鮮α-MEM培養(yǎng)基和100 μL CCK-8溶液。孵育1 h后，采用酶標(biāo)儀檢測在450 nm波長下的光密度（OD）值。

1.4.4 ALP活性檢測

采用ALP活性測定試劑盒檢測3組MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性。成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)7 d和14 d后，收集上清液，用ALP活性測定試劑盒處理上清液，采用酶標(biāo)儀在510 nm波長下測定各樣本OD值。

1.4.5 茜素紅染色檢測鈣沉積

采用茜素紅檢測MC3T3-E1細(xì)胞在3組表面的鈣沉積。成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)培養(yǎng)14 d后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，使用茜素紅對樣本進(jìn)行染色，隨后進(jìn)一步半定量分析鈣沉積，向每個(gè)樣品中加入茜素紅洗脫液（10%乙酸∶無水乙醇=8∶2）。采用酶標(biāo)儀在490 nm波長下測試洗脫液的OD值。

1.4.6 Real-time PCR檢測成骨標(biāo)志基因表達(dá)

成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)7 d、14 d后，采用Trizol法提取MC3T3-E1細(xì)胞總RNA，隨后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對各RNA樣本逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，采用Real-time PCR定量分析成骨標(biāo)志基因：重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）、ALP、骨鈣蛋白（OCN）和骨橋蛋白（OPN）的基因表達(dá)。引物序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，序列見表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系20 μL：cDNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，SYBR Green Master Mix 10 μL，ddH2O 8 μL。分別以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 表面形貌

SEM圖像顯示，Ta/NT組為TiO₂納米管基底，表面部分覆蓋球狀、帶狀交錯(cuò)的微-納米級(jí)Ta涂層結(jié)構(gòu)。Ta₂O₅/PT組表面覆蓋較為廣泛且平整的Ta₂O₅涂層結(jié)構(gòu)，偶見球狀及帶狀結(jié)構(gòu)；高倍鏡下可見涂層分布較為均勻致密且主要為微米級(jí)的Ta₂O₅涂層。Ta₂O₅/NT組可見TiO₂納米管基底表面覆蓋較為平滑的片狀、帶狀交聯(lián)的微-納米級(jí)Ta₂O₅涂層結(jié)構(gòu)；高倍鏡下呈現(xiàn)暴露的納米管及部分覆蓋納米管的塊狀Ta₂O₅涂層的復(fù)合結(jié)構(gòu)，見圖1。Ta/NT組及Ta₂O₅/NT組TiO₂納米管管徑為（70±10）nm，管壁厚度約10 nm。

2.2 表面元素組成及化合物分析

XPS結(jié)果顯示，Ta/NT組、Ta₂O₅/PT組及Ta₂O₅/NT組的表面元素組成相似，主要為Ti、O、C及Ta元素（圖2a—c）。XRD分析顯示，Ta/NT組表面化合物為Ti、Ta₂O₅和TaO₂（圖2d）。Ta₂O₅/PT組XRD檢測顯示僅由Ti組成（圖2e）。Ta₂O₅/NT組表面化合物主要為Ti，并含有微量的脫礦鈦及金紅石晶體結(jié)構(gòu)的TiO₂（圖2f）。

2.3 細(xì)胞骨架和細(xì)胞核黏附的熒光顯微鏡觀察

Hoechst細(xì)胞核染色顯示，培養(yǎng)1 d后Ta₂O₅/NT組、Ta₂O₅/PT組黏附細(xì)胞核密度高于Ta/NT組，見圖3。Phalloidin-Alexa-Fluor 555細(xì)胞骨架染色結(jié)果顯示，Ta₂O₅/PT組和Ta₂O₅/NT組黏附細(xì)胞骨架塊狀、絲狀結(jié)構(gòu)相對較大，細(xì)胞骨架張力較大，交聯(lián)、團(tuán)簇狀較多，而Ta/NT組細(xì)胞骨架分布?jí)K狀、絲狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)較小，細(xì)胞骨架張力較小。Ta₂O₅/PT組與Ta₂O₅/NT組細(xì)胞骨架張力較為接近，見圖3。

2.4 細(xì)胞活力比較

培養(yǎng)1、4、7 d，Ta₂O₅/PT組及Ta₂O₅/NT組細(xì)胞活力高于Ta/NT組（P＜0.05），Ta₂O₅/NT組與Ta₂O₅/PT組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

2.5 ALP活性比較

Ta₂O₅/NT組、Ta/NT組和Ta₂O₅/PT組7 d和14 d ALP活性逐次降低（P＜0.05），見表3。

2.6 鈣沉積比較

培養(yǎng)14 d后茜素紅染色樣本半定量分析顯示Ta₂O₅/NT組、Ta/NT組、Ta₂O₅/PT組鈣沉積量（OD₄₉₀）依次降低，分別為0.408±0.018、0.289±0.017和0.142±0.010（n=3，F(xiàn)=223.663，P＜0.01）。

2.7 成骨基因表達(dá)情況

在誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d和14 d，Ta₂O₅/NT組、Ta/NT組和Ta₂O₅/PT組ALP、OCN、OPN的mRNA含量逐次降低，14 d Ta₂O₅/NT組的BMP-2 mRNA含量在3組中最高（P＜0.05）。見表4。

3 討論

Ta表面在空氣中極易氧化形成致密的氧化物Ta₂O₅，Ta₂O₅結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，且具有優(yōu)良的生物相容性和耐腐蝕性。本課題組前期在Ta/TiO₂納米管復(fù)合涂層的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步引入Ta₂O₅涂層至TiO₂納米管表面形成Ta₂O₅/TiO₂納米管復(fù)合涂層，分析其表面特征及對MC3T3T-E1細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。

聚合物輔助沉積技術(shù)制備Ta₂O₅涂層是將溶解TaCl5的有機(jī)溶液沉積在基質(zhì)表面，隨后進(jìn)行高溫退火處理形成Ta₂O₅涂層。其操作簡單可控，降低了生產(chǎn)成本，還通過熱處理提高了涂層的致密度及結(jié)合強(qiáng)度。本研究通過調(diào)整樣品在TaCl5的有機(jī)溶液中的浸泡次數(shù)，在純鈦表面制備了較為致密的Ta₂O₅涂層，在TiO₂納米管表面制備了部分覆蓋的Ta₂O₅涂層，SEM圖像顯示Ta/NT組與Ta₂O₅/NT組呈現(xiàn)微納米的復(fù)合結(jié)構(gòu)，微納米結(jié)構(gòu)不僅可發(fā)揮TiO₂納米管的仿生性，還有利于成骨信號(hào)通路的傳導(dǎo)及骨細(xì)胞向微孔中長入［14-16］。

本研究從XPS結(jié)果可以推測出Ta及Ta₂O5涂層已分別加載至Ti及TiO₂基底表面。C元素可歸因于樣本表面形成的污染層。由于僅有晶體可對X射線發(fā)生衍射，而Ta/NT組及Ta₂O₅/NT組XRD檢測TiO₂納米管是以非晶體化合物的無定形結(jié)構(gòu)組成，所以僅檢測出Ti。此外，Ta₂O₅/NT組表面檢測出微量的脫礦鈦及金紅石晶體結(jié)構(gòu)的TiO₂。研究表明，TiO₂納米管在500～600 ℃時(shí)可形成金紅石與脫鈦礦復(fù)合結(jié)構(gòu)［17］。此復(fù)合結(jié)構(gòu)可以顯著改善其表面和生物學(xué)性質(zhì)，促進(jìn)TiO₂納米管的親水性，并促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附、增殖、分化、羥基磷灰石的沉積［18］。故本研究選擇500 ℃進(jìn)行聚合物輔助沉積法熱處理，XPS元素組成及XRD化合物分析顯示Ta₂O₅/NT組的TiO₂納米管呈現(xiàn)微量的脫礦鈦及金紅石晶體結(jié)構(gòu)。此外，研究顯示聚合物輔助沉積法只有在高于700 ℃熱處理才能獲得結(jié)晶的Ta₂O₅涂層［19］。因此，XRD結(jié)果顯示Ta₂O₅/PT組及Ta₂O₅/NT組未檢測出Ta₂O₅晶體結(jié)構(gòu)存在。

與Ta₂O₅涂層組（Ta₂O₅/NT組和Ta₂O₅/PT組）相比，Ta/NT組細(xì)胞核黏附密度、細(xì)胞骨架張力均較高。此結(jié)果歸因于Ta₂O₅較Ta具有更強(qiáng)的生物活性。Ta₂O₅/NT組與Ta/NT組的細(xì)胞活性、ALP活性、鈣沉積及BMP-2、ALP、OCN和OPN表達(dá)均高于Ta₂O₅/PT組，尤其是Ta₂O₅/NT組。究其原因?yàn)?，MC3T3-E1細(xì)胞的分化能力可受樣本表面元素生物學(xué)活性、形貌、細(xì)胞黏附、增殖能力的影響［20-21］。納米管復(fù)合涂層組（Ta₂O₅/NT組與Ta/NT組）可具有協(xié)同的生物學(xué)成骨分化作用，且呈現(xiàn)微納米管形貌，因此分化作用強(qiáng)于單純Ta₂O₅涂層即Ta₂O₅/PT組。此外，Ta₂O₅/NT組的TiO₂納米管具有微量的脫礦鈦及金紅石晶體結(jié)構(gòu)，可增強(qiáng)TiO₂納米管復(fù)合涂層的分化作用。

綜上所述，Ta₂O₅/TiO₂納米管復(fù)合涂層可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞黏附、細(xì)胞活性、ALP活性、礦化及成骨相關(guān)基因的表達(dá)，有利于生物學(xué)活性的發(fā)揮，為制備出一種新型成骨性能較優(yōu)的種植體表面改性涂層提供了材料學(xué)及細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。未來本課題組擬進(jìn)一步通過調(diào)整Ta₂O₅/TiO₂納米管的工藝參數(shù)來優(yōu)化生物活性，并通過開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對此復(fù)合涂層進(jìn)行成骨機(jī)制方面的探討制及動(dòng)物學(xué)探討。

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（2023-04-28收稿 2023-06-02修回）

（本文編輯 李志蕓）