張立群　烏日吉木斯　鄭曉明　汪琳　韓玉秀　張薇　閻濤

摘要：目的 探討circFAT1吸附miR-1182調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β/Smad信號通路對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）增殖、侵襲、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的調(diào)控作用及機(jī)制。方法 收集50例GBM樣本和5例非瘤腦組織（NBT）樣本，隨機(jī)抽取3例GBM和3例NBT樣本進(jìn)行組織RNA測序。體外培養(yǎng)GBM細(xì)胞系U87、U251、T98G、LN229及星形膠質(zhì)細(xì)胞系NHA，通過qRT-PCR檢測組織和細(xì)胞系中circFAT1表達(dá)。通過RNase R選擇性降解線性轉(zhuǎn)錄本以明確circFAT1成環(huán)特性。將GBM細(xì)胞分為sh-對照組和sh-circFAT1組，采用慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后集落形成實(shí)驗、Transwell實(shí)驗、Western blot實(shí)驗分別檢測細(xì)胞增殖、侵襲及EMT能力。熒光原位雜交（FISH）檢測circFAT1在GBM細(xì)胞內(nèi)定位，通過雙螢光素酶報告基因和RNA免疫共沉淀（RIP）實(shí)驗驗證circFAT1和miR-1182的相互作用。Western blot實(shí)驗驗證敲低circFAT1后或抑制miR-1182表達(dá)對TGF-β/Smad信號通路的調(diào)控作用。結(jié)果 circFAT1在GBM組織和細(xì)胞中表達(dá)增加（P＜0.05）。RNase R可減少線性FAT1表達(dá)（P＜0.05），而不影響circFAT1。敲除circFAT1抑制了GBM細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT（P＜0.05）。雙螢光素酶報告基因和RIP實(shí)驗證實(shí)circFAT1靶向結(jié)合miR-1182。敲低circFAT1后TGFB2、p-SMAD2、p-SMAD3蛋白表達(dá)下降，抑制miR-1182表達(dá)后GFB2、p-SMAD2、p-SMAD3蛋白表達(dá)升高。結(jié)論 敲除circFAT1可抑制GBM細(xì)胞增殖、侵襲和EMT，其作用機(jī)制可能與吸附miR-1182調(diào)控TGF-β/Smad信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；細(xì)胞增殖；轉(zhuǎn)化生長因子β；微RNAs；circFAT1；上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

中圖分類號：R739.41文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20230224

The mechanisms of circFAT1 on the biological process of GBM cells

ZHANG Liqun WURI Jimusi ZHENG Xiaoming WANG Lin HAN Yuxiu ZHANG Wei YAN Tao

1 Tianjin Neurological Institute， Tianjin Medical University General Hospital， Tianjin 300052， China;

2 Department of Obstertrics and Gynecology， Tianjin First Central Hospital

Corresponding Author E-mail： taoyan@tmu.edu.cn

Abstract： Objective To investigate the regulation and mechanism of circFAT1 on proliferation， invasion and epithelial-mesenchymal transition （EMT） of glioblastoma （GBM）. Methods Fifty GBM samples and 5 non-tumor brain tissue （NBT） samples were collected， and 3 GBM and 3 NBT samples were randomly selected for tissue RNA sequencing. The expression levels of circFAT1 in U87， U251， T98G， LN229 GBM cell lines and NHA astrocyte lines were detected by qRT-PCR. The cyclic properties of circFAT1 were determined by selective degradation of linear transcripts by RNase R. GBM cells were divided into the sh-control group and the sh-circFAT1 group. Cell proliferation， invasion and EMT were detected by colony formation assay， transwell assay and Western blot assay after lentivirus transfection. Fluorescence in situ hybridization （FISH） was used to detect the localization of circFAT1 in GBM cells， and the interaction between circFAT1 and miR-1182 was verified by dual-luciferase reporter and RNA immunocoprecipitation （RIP） assay. Finally， Western blot assay was performed to verify the regulatory effect of circFAT1 knockdown or inhibition of miR-1182 expression on TGF-β/Smad signaling pathway. Results The expression of circFAT1 was increased in GBM tissue and cells （P＜0.05）. RNase R reduced linear FAT1 expression without affecting circFAT1 （P＜0.05）. Knockout of circFAT1 inhibited the proliferation， invasion and EMT of GBM cells （P＜0.05）. Dual-luciferase reporter and RIP assay confirmed that circFAT1 targeting on miR-1182. The protein levels of TGFB2， p-SMAD2 and p-SMAD3 were decreased after circFAT1 knockdown， while protein expressions of TGFB2， p-SMAD2 and p-SMAD3 increased after inhibiting the expression of miR-1182 （all P＜0.05）. Conclusion Knockout of circFAT1 can inhibit proliferation， invasion and EMT of GBM cells， and its mechanism may be related to the regulation of TGF-β/Smad signaling pathway by sponge miR-1182.

Key words： glioblastoma; cell proliferation; transforming growth factor beta; microRNAs; circFAT1; epithelial-mesenchymal transition

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是癲癇的誘發(fā)因素之一［1］，患者的預(yù)后與癲癇的臨床表現(xiàn)有關(guān)［2］。研究表明，GBM患者經(jīng)過手術(shù)聯(lián)合系統(tǒng)放化療后的中位生存時間也低于15個月［3］。因此，進(jìn)一步研究GBM發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找GBM診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)具有重要意義。環(huán)狀RNA（circRNA）已被證實(shí)與細(xì)胞的病理生理過程相關(guān)［4］。研究表明，多種circRNAs通過不同的分子機(jī)制參與癌癥的發(fā)展過程［5］。但環(huán)狀RNA脂肪非典型鈣黏蛋白1（circRNA FAT atypical cadherin 1，circFAT1）在腫瘤特別是GBM中的作用及相應(yīng)機(jī)制尚不明確。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）通路因其在腫瘤早期抑制腫瘤細(xì)胞增殖，而在腫瘤晚期通過調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、血管生成、免疫逃逸、侵襲和轉(zhuǎn)移促進(jìn)腫瘤的發(fā)展而備受關(guān)注。研究表明，TGF-β信號通路促進(jìn)細(xì)胞增殖與EMT進(jìn)程，從而促進(jìn)GBM的發(fā)展［6］。本研究旨在觀察敲除circFAT1對GBM細(xì)胞增殖、侵襲、EMT以及TGF-β通路的影響，為探求GBM診治靶點(diǎn)提供新的思路與方向。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞及組織樣本

選取2019年6月—2022年1月天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科患者經(jīng)手術(shù)切除的50例GBM和5例非瘤腦組織（NBT）標(biāo)本，所有組織樣本均經(jīng)病理證實(shí)，凍存于-80 ℃以備后續(xù)研究。所有患者均簽署書面知情同意書。本研究方案經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批件號：2019-SR-479）。本研究所用GBM細(xì)胞系U87、U251、T98G、LN229，星形膠質(zhì)細(xì)胞系NHA和工具細(xì)胞HEK293T均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑與儀器

高糖Dulbecco改良Eagles（DMEM）培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自美國Sigma公司；TRIzol法RNA提取試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高敏qRT-PCR試劑盒購自中國Vazyme公司；RiboMinus真核細(xì)胞試劑盒購自德國Qiagen公司；Agilent DNA 1000測序芯片購自美國Agilent公司；EntransterTM-R4000轉(zhuǎn)染試劑購自中國英格恩公司；核糖核酸酶R（RNase R）購自美國Epicentre公司；兔抗人鈣黏蛋白E（E-cadherin）、鈣黏蛋白N（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、轉(zhuǎn)化生長因子β2（transforming growth factor beta 2，TGFB2）、磷酸化SMAD2（p-SMAD2）、磷酸化SMAD3（p-SMAD3）蛋白抗體購自英國Abcam公司，兔抗人GAPDH和小鼠抗人β-actin抗體購自美國cell signaling technology公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗購自美國Thermo Fisher公司。雙螢光素酶報告基因試劑盒購自美國Promega公司；Transwell小室（含基質(zhì)膠）購自美國Corning公司。熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）試劑盒、sh-circFAT1、sh-ctrl、miR-1182 inhibitor、miR-NC inhibitor購自中國RiboBio公司。RNA免疫共沉淀（RIP）試劑盒、人源argonaute2（ago2）抗體、小鼠IgG抗體購自美國Millipore公司。野生型circFAT1、突變型circFAT1報告質(zhì)粒、miR‐1182 mimics、miR‐NC、sh-circFAT1及sh-對照序列均由中國銳博生物構(gòu)建。NanoDrop 2000分光光度計購自美國Thermo-Fisher公司；7900HT PCR系統(tǒng)購自美國Applied Biosystems公司；Agilent 2100生物分析儀購自美國Agilent公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 RNA測序（RNA-seq）分析

采用TRIzol試劑從隨機(jī)抽取的3例GBM組織和3例NBT組織中提取總RNA［7］，采用NanoDrop 2000分光光度計對RNA進(jìn)行質(zhì)控及定量檢測。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性及是否存在gDNA污染。在構(gòu)建RNA-seq文庫之前，先用RiboMinus真核細(xì)胞試劑盒去除核糖體RNA。測序文庫由Agilent 2100生物分析儀通過使用Agilent DNA 1000芯片進(jìn)行測定。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

所有細(xì)胞均在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5%CO2。

1.2.3 RNA提取及qRT-PCR檢測

使用TRIzol試劑從細(xì)胞或組織中提取總RNA［7］。根據(jù)試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)高敏qRT-PCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系。然后在7900HT系統(tǒng)上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，65 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共計40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，并通過2-ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量，β-actin作為內(nèi)參對照。引物序列見表1。選取circFAT1表達(dá)水平最高的細(xì)胞系用作后續(xù)研究。

1.2.4 GBM細(xì)胞中circFAT1表達(dá)穩(wěn)定性鑒定

將GBM細(xì)胞按是否經(jīng)過RNase R處理分為對照組和RNase R組，按1.2.3方法提取細(xì)胞總RNA。各組分別取2 ?g總RNA，RNaseR組加入6 U的RNase R，37 ℃消化20 min，對照組加入等量PBS。消化后的RNA根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行純化，按1.2.3方法通過qRT-PCR檢測circFAT1及線性FAT1（linerFAT1）表達(dá)。引物序列見表1。

1.2.5 sh-circFAT1及miR‐1182抑制劑（inhibitor）轉(zhuǎn)染

細(xì)胞轉(zhuǎn)染方案同本課題組前期研究方案［7］。將GBM細(xì)胞分為sh-對照組、sh-circFAT1-1組、sh-circFAT1-2組及sh-circFAT1-3組。將細(xì)胞鋪于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后將50 pmol shRNA溶于Opti-MEM培養(yǎng)基（200 ?L）中，與EntransterTM-R4000轉(zhuǎn)染試劑充分混合后轉(zhuǎn)染48 h。通過qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效率，選取效率最高的shRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。miR‐1182 inhibitor轉(zhuǎn)染：將細(xì)胞鋪于6孔板中，待融合度達(dá)60%～70%、細(xì)胞貼壁后將質(zhì)粒（根據(jù)需要3～5 ?g）溶于Opti-MEM培養(yǎng)基（200 ?L）中，與EntransterTM-R4000轉(zhuǎn)染試劑充分混合后轉(zhuǎn)染48 h。

1.2.6 集落形成實(shí)驗檢測細(xì)胞增殖

將GBM細(xì)胞分為sh-對照組及sh-circFAT1組。轉(zhuǎn)染目的RNA 48 h后，將2組細(xì)胞分別接種于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)11 d。所得細(xì)胞集落用PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min。普通攝像機(jī)拍照后使用Image J軟件計數(shù)集落數(shù)目。

1.2.7 Transwell實(shí)驗檢測細(xì)胞侵襲

細(xì)胞分組同1.2.6。使用由聚碳酸酯濾器（8 μm孔徑；0.33 cm2）組成的直徑為6.5 mm的Transwell小室進(jìn)行實(shí)驗。轉(zhuǎn)染目的RNA 48 h后，將GBM細(xì)胞（3×104個）轉(zhuǎn)移至含有無血清培養(yǎng)基的上層小室中，下層小室加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。37 ℃孵育48 h后，去除上層未侵襲的細(xì)胞，剩余細(xì)胞用4%多聚甲醛固定20 min。用0.1%結(jié)晶紫染色，用Nikon ECLIPSE E800熒光倒置顯微鏡觀察。

1.2.8 Western blot檢測EMT能力

細(xì)胞分組同1.2.6。用免疫沉淀緩沖液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。使用10%濃度的SDS-PAGE進(jìn)行蛋白電泳分離蛋白。220 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中封閉1 h；一抗稀釋后（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin稀釋比例為1∶1 000，GAPDH稀釋比例為1∶2 000），4 ℃與PVDF膜共同孵育過夜，二抗稀釋后（1∶2 000），與PVDF膜在37 ℃搖床孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光液均勻涂抹于PVDF膜，BIO-RAD化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀拍照。

1.2.9 FISH檢測circFAT1在細(xì)胞中的分布

通過FISH檢測試劑盒（RiboBio）檢測［7］。使用0.5%Triton X-100對經(jīng)甲醛固定的細(xì)胞行透性處理，并與特異性探針在37 ℃下雜交過夜。用4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）標(biāo)記細(xì)胞核。熒光圖像由蔡司LSM 700共聚焦顯微鏡拍攝得到。

1.2.10 RIP

RIP實(shí)驗方案同本課題組先前研究方案［7］。制備GBM細(xì)胞裂解物，用含磁珠的RIP緩沖液孵育，磁珠與人源ago2抗體結(jié)合，按1.2.3方法通過qRT-PCR檢測免疫沉淀RNA表達(dá)。裂解物組（Input）作為陽性對照，IgG抗體組作為陰性對照，抗ago2（anti-Ago2）抗體組檢測circFAT1富集水平。

1.2.11 雙螢光素酶報告基因檢測

螢光素酶測定方案同同本課題組先前研究方案［7］。從DIANA數(shù)據(jù)庫（http：//diana.imis.athena-innovation.gr/）預(yù)測circFAT1與miR-1182的結(jié)合位點(diǎn)，并將野生型（WT）或突變型（MUT）circFAT1報告質(zhì)粒、miR‐1182 mimics或miR‐NC和海腎螢光素酶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞。使用雙螢光素酶報告基因試劑盒檢測所有熒光素酶活性。螢火蟲螢光素酶活性通過海腎螢光素酶活性進(jìn)行均一化。

1.2.12 Western blot檢測TGF-β信號通路蛋白表達(dá)

將GBM細(xì)胞分為A組（轉(zhuǎn)染sh-對照序列+miR-NC inhibitor）、B組（轉(zhuǎn)染sh-circFAT1+miR-NC inhibitor）、C組（轉(zhuǎn)染sh-對照序列+miR-1182 inhibitor）、D組（轉(zhuǎn)染sh-circFAT1+miR-1182 inhibitor）。按1.2.7方法檢測TGMB2、p-SMAD2、p-SMAD3、β-actin蛋白表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參蛋白，計算TGMB2、p-SMAD2、p-SMAD3相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circFAT1在GBM組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況

組織間circRNA測序顯示，在GBM中共有29個表達(dá)上調(diào)的circRNA（|log2| fold change≥1且P＜0.05），其中包含has_circ_0001461（即circFAT1［8］），見圖1。NHA、U87、LN229、T98G、U251細(xì)胞系中circFAT1表達(dá)水平分別為1.00±0.02、3.99±0.25、2.01±0.05、1.89±0.18和2.83±0.11，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=31.514，P＜0.01）。U87細(xì)胞系中circFAT1表達(dá)水平最高，用作后續(xù)研究。GBM組織中circFAT1表達(dá)水平高于NBT組織（4.17±1.10 vs. 1.24±0.41，t=12.091，P＜0.01）。

2.2 circFAT1的環(huán)狀結(jié)構(gòu)及表達(dá)穩(wěn)定性鑒定

circFAT1是通過FAT1基因第2外顯子與兩側(cè)內(nèi)含子中的Alu元件的反向剪接而產(chǎn)生，見圖2。linerFAT1在對照組和RNase R組中相對表達(dá)量分別為1.02±0.01和0.26±0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.963，P＜0.01），而circFAT1的表達(dá)量分別為0.95±0.00和1.03±0.01，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.061，P＞0.05）。

2.3 敲除circFAT1基因抑制GBM細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT能力

sh-對照組、sh-circFAT1-1組、sh-circFAT1-2組及sh-circFAT1-3組circFAT1相對表達(dá)量分別1.00±0.01、0.15±0.00、0.34±0.02、0.65±0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=48.082，P＜0.05）。其中sh-circFAT1-1序列敲除效率最高，用于后續(xù)實(shí)驗。與sh-對照組相比，sh-circFAT1組U87細(xì)胞集落數(shù)量和侵襲率下降，E-cadherin表達(dá)增高，N-cadherin和Vimentin表達(dá)降低，見圖3、表2。

2.4 雙螢光素酶報告基因驗證circFAT1下游靶點(diǎn)

circFAT1在GBM細(xì)胞中定位于細(xì)胞質(zhì)。RIP實(shí)驗顯示，與陰性對照相比，anti-Ago2可顯著富集circFAT1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=549.152，P＜0.01）。雙螢光素酶報告基因顯示，與miR-NC組相比，miR-1182 mimic組可降低含circFAT1-WT報告載體細(xì)胞的螢光素酶活性（t=6.726，P＜0.01），對含circFAT1-MUT報告載體細(xì)胞的螢光素酶活性無明顯影響（t=0.555，P＞0.05）。見圖4。

2.5 circFAT1對TGF-β/Smad信號通路的影響

與A組比較，B組TGFB2、p-SMAD2、p-SMAD3表達(dá)量下降，而C組中相應(yīng)蛋白表達(dá)升高；與C組比較，D組TGFB2、p-SMAD2、p-SMAD3表達(dá)量下降；與B組比較，D組TGFB2、p-SMAD2、p-SMAD3表達(dá)量升高（均P＜0.05），見圖5、表3。

3 討論

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的原發(fā)性腫瘤，成人的發(fā)病率最高，占顱內(nèi)腫瘤的50%［9］，其中GBM約占膠質(zhì)瘤的46.6%［10］，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。目前，GBM患者的平均生存時間僅為15個月左右，即使在接受標(biāo)準(zhǔn)化膠質(zhì)瘤治療方案（即手術(shù)切除加術(shù)后放化療）后效果亦不顯著［11］。因此，有必要進(jìn)一步研究GBM發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制，改進(jìn)現(xiàn)有治療方案，以改善患者預(yù)后。

circRNA是通過前體mRNA的反向剪接而形成［12］，其核心形成機(jī)制包括單外顯子環(huán)化、多外顯子環(huán)化及協(xié)同環(huán)化［13］。circRNA的形成機(jī)制主要包括套索驅(qū)動環(huán)化、RNA結(jié)合蛋白驅(qū)動環(huán)化和反向剪接［14］。盡管circRNA的表達(dá)量遠(yuǎn)不如其線性轉(zhuǎn)錄本，但由于其存在共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)且缺乏游離末端，使其可免受RNase R的降解作用，進(jìn)而具有高度穩(wěn)定性及保守性［15］。因此，circRNA可用于識別不同的腫瘤類型［16］。circRNA表達(dá)具有組織特異性和發(fā)育階段特異性，在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用［17-18］。環(huán)狀RNA瘙癢E3泛素蛋白連接酶（circRNA itchy E3 ubiquitin protein ligase，circITCH）在食管癌中的表達(dá)明顯低于癌旁組織。此外，環(huán)狀RNA-7（circRNA 7，ciRS-7）在神經(jīng)母細(xì)胞瘤和膠質(zhì)瘤中廣泛表達(dá)［19］。circRNAs在腫瘤中的差異表達(dá)提示它們可能在腫瘤進(jìn)展中起調(diào)節(jié)作用，可作為診斷和預(yù)后評估的潛在生物標(biāo)志物［20］。本研究對GBM和NBT樣本進(jìn)行circRNAs測序分析，發(fā)現(xiàn)circFAT1在GBM組織中異常高表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)，在RNase R處理下，circFAT1具有較高的表達(dá)穩(wěn)定性，敲除circFAT1可抑制GBM細(xì)胞的增殖和侵襲。這些結(jié)果表明，circFAT1在GBM的侵襲性生長過程中起重要作用。

目前，circRNA的主要作用機(jī)制包括以下3點(diǎn)：（1）circRNA作為miRNA“分子海綿”發(fā)揮作用。（2）circRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合相互作用。（3）circRNA可直接進(jìn)行翻譯，得到相應(yīng)蛋白進(jìn)而發(fā)揮作用。circRNA的亞細(xì)胞定位決定其自身的生物學(xué)功能［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，circFAT1主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。circRNA已被證明可通過定向結(jié)合任意miRNA發(fā)揮作用，從而形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［22-23］。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-1182可能是circFAT1的潛在靶點(diǎn)。miR-1182過表達(dá)可以抑制卵巢癌的轉(zhuǎn)移和增殖以及非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展，表明其可能作為多種腫瘤結(jié)局的預(yù)測指標(biāo)，并可作為潛在的診斷和治療靶點(diǎn)［24］。本研究結(jié)果表明，circFAT1可作為miR-1182的分子海綿吸附miR-1182，進(jìn)而參與miR-1182在GBM中的功能調(diào)控。進(jìn)一步的通路研究表明，敲除circFAT1可下調(diào)TGF-β通路相關(guān)蛋白TGFB2、p-SMAD2、p-SMAD3的表達(dá)，抑制該通路活化，而TGF-β信號通路的活化已被證實(shí)在多種惡性腫瘤中起著重要的促進(jìn)作用［25］。

綜上所述，敲低circFAT1可抑制TGF-β信號通路激活，延緩GBM細(xì)胞的增殖和EMT過程。因此，circFAT1可能是GBM的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。但circFAT1/miR-1182軸在GBM中的下游基因尚未被闡明，并且circFAT1的功能仍需進(jìn)一步的體內(nèi)研究進(jìn)行驗證。

參考文獻(xiàn)

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（2023-02-22收稿 2023-05-16修回）

（本文編輯 魏杰）