武海博　梁燕　沈雷　范展　傅國惠

摘要：目的 探究復(fù)方藤梨湯含藥血清對人腦膠質(zhì)瘤U251細胞增殖、凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。方法 將24只雄性SD大鼠分為對照組和低、中、高劑量組[復(fù)方藤梨湯6、12、24 g/（kg·d）]，每組6只，制備含藥血清處理人腦膠質(zhì)瘤U251細胞。采用CCK-8法檢測細胞活力，集落形成實驗檢測細胞克隆形成能力，流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布與細胞凋亡，定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測原癌基因C-myc、細胞周期蛋白D1（CyclinD1）基因表達，Western blot法檢測細胞凋亡蛋白［B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶（Caspase）-3、Caspase-8］以及β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、上皮性黏附蛋白（E-cadherin）及波形蛋白（Vimentin）表達。結(jié)果 選取體積分數(shù)10%的含藥血清為最終劑量。與對照組比較，低、中、高劑量組細胞活力、克隆形成數(shù)、C-myc mRNA、CyclinD1 mRNA、Vimentin表達水平降低，處于S期細胞比例、Bax/Bcl-2比值、Caspase-3表達水平升高（P＜0.05）；低、高劑量組G1期細胞比例降低（P＜0.05）；中、高劑量組G2期細胞比例、β-catenin表達水平降低，Caspase-8和E-cadherin表達水平升高（P＜0.05）；高劑量組細胞凋亡率升高（P＜0.05）。結(jié)論 復(fù)方藤梨湯含藥血清可促使人腦膠質(zhì)瘤U251細胞阻滯于S期，抑制細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，通過調(diào)節(jié)β-catenin、E-cadherin和Vimentin表達抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

關(guān)鍵詞：神經(jīng)膠質(zhì)瘤；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；細胞增殖；細胞凋亡；細胞增殖抑制藥（中藥）；復(fù)方藤梨湯含藥血清；人腦膠質(zhì)瘤U251細胞

中圖分類號：R739.41文獻標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20221840

Effects of Fufang Tengli Decoction drug-containing serum on proliferation， apoptosis and epithelial-mesenchymal transition of human glioma U251 cells

WU Haibo， LIANG Yan， SHEN Lei， FAN Zhan， FU Guohui

Department of Neurology， Nanyang Central Hospital， Nanyang 473000， China

Corresponding Author E-mail： fgh377818@sina.com

Abstract： Objective To explore effects of Fufang Tengli Decoction drug-containing serum on the proliferation， apoptosis and epithelial-mesenchymal transition （EMT） of human glioma U251 cells. Methods A total of 24 male SD rats were divided into the control group， the low-dose， medium-dose and high-dose Fufang Tengli Decoction groups [6， 12， 24 g/（kg·d）]， 6 rats in each group. After 10 d of continuous intragastric administration， blood samples was collected to prepare drug-containing serum， and human glioma U251 cells were treated for 24 h. The cells activity was detected by Cell Counting Kit-8. The cell cloning was detected by colony formation assay. The distribution of cells cycles and apoptosis were detected by flow cytometry. The expressions of proto-oncogene C-myc and cyclin D1 （CyclinD1） genes were detected by quantitative polymerase chain reaction. The expressions of B-cell lymphoma-2 （Bcl-2）， Bcl-2 associated X protein （Bax）， cysteine aspartase-3 （caspase-3）， caspase-8， β-catenin， epithelial cadherin （E-cadherin） and vimentin （Vimentin） were detected by Western blot assay. Results The drug-containing serum with 10% volume fraction was selected as the final dose. Compared with the control group， cells activity， number of clone formation and expression levels of C-myc， CyclinD1 mRNA and Vimentin were decreased， while numbers of cells in S phase and expression levels of Bax/Bcl-2 and Caspase-3 were increased in the low-dose， medium-dose and high-dose Fufang Tengli Decoction groups （P＜0.05）. The proportion of cells in G2 phase and expression level of β-catenin were decreased， while expression levels of Caspase-8 and E-cadherin were increased in the medium-dose and high-dose Fufang Tengli Decoction groups （P＜0.05）. Cell apoptosis rate was increased in the high-dose Fufang Tengli Decoction group （P＜0.05）. Conclusion Fufang Tengli Decoction drug-containing serum can block human glioma U251 cells in S phase， inhibit cell proliferation， induce apoptosis， regulate expressions of β-catenin， E-cadherin and Vimentin， and inhibit EMT.

Key words： glioma; epithelial-mesenchymal transition; cell proliferation; apoptosis; cell proliferation inhibitors （TCD）; Fufang Tengli Decoction; human glioma U251 cells

膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤，發(fā)病部位呈多樣性，會破壞功能區(qū)，致殘、致死率高于其他腦部疾病，嚴重影響患者預(yù)后［1-2］。替莫唑胺、貝伐單抗等常用的抗膠質(zhì)母細胞瘤藥物毒副作用較大，會損傷正常腦組織，且長時間使用易形成耐藥性［3］。因此，尋找新型抗GBM藥物成為其治療領(lǐng)域的研究熱點。目前，中醫(yī)藥已廣泛用于GBM的治療，具有多靶點、多途徑、多功效的優(yōu)勢［4］。中醫(yī)認為，機體升降失衡，致清陽不升、濁陰不降，阻塞清竅，日久成積致瘤［5］。復(fù)方藤梨湯系用于GBM、胃癌、肝癌等惡性腫瘤治療的經(jīng)驗方，全方具有燥濕化痰、軟堅散結(jié)、益氣通絡(luò)的功效［6］。然而，目前有關(guān)其抗癌抑瘤的作用機制、治療靶點等尚不明確。本研究采用復(fù)方藤梨湯含藥血清體外干預(yù)人膠質(zhì)瘤U251細胞，觀察膠質(zhì)瘤細胞增殖、凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力的變化，以期為中醫(yī)藥抗GBM提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量180～220 g，6～8周齡，購自湖南斯萊克景達實驗動物公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004。人腦膠質(zhì)瘤細胞株U251購自中國科學(xué)院分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心。復(fù)方藤梨湯組分購自中國北京同仁堂（集團）有限公司；細胞計數(shù)試劑盒8（CCK-8）購自江蘇凱基生物科技股份有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒、細胞周期染色試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；Trizol試劑、超純總RNA提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；2×SYBR Green PCR Master Mix購自廈門生命互聯(lián)科技有限公司；兔源抗B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶（Caspase）-3、Caspase-8、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、上皮性黏附蛋白（E-cadherin）及波形蛋白（Vimentin）抗體購自英國Abcam公司；鼠源抗3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）購自武漢博士德生物工程有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。NovoCyte?流式細胞儀（NovoCyte 2060R）購自艾森生物（杭州）有限公司；熒光PCR儀（CFX ConnectTM 實時）購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.2 大鼠含藥血清制備

藤梨根30 g、黃芪30 g、鱉甲20 g、冬凌20 g及當(dāng)歸20 g，加入600 mL水熬制復(fù)方藤梨湯，濃縮成含生藥3 g/mL湯劑。參照文獻［6］，60 kg成人每日復(fù)方藤梨湯用藥量120 g，即2 g/（kg·d），換算成大鼠用藥劑量為12 g/（kg·d）［7］，分別以0.5、1、2倍設(shè)定大鼠低、中、高劑量為6、12、24 g/（kg·d）。將大鼠于20～26 ℃、相對濕度50%～60%的條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。采用隨機數(shù)表法將大鼠分為對照組和低、中、高劑量組，每組6只。低、中、高劑量組分別給予6、12、24 g/（kg·d）復(fù)方藤梨湯灌胃，對照組大鼠給予15 mL/（kg·d）生理鹽水灌胃，每次為標(biāo)準(zhǔn)計算劑量的一半，充分模擬人體服藥習(xí)慣，不禁食，每日2次，連續(xù)灌胃10 d。于第10天灌胃后60 min腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉處死大鼠，腹主動脈采血5 mL，3 000 r/min離心30 min后保留上層血清制備含藥血清，合并同組血清置于56 ℃水浴30 min滅活補體，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，置于-20 ℃冰箱備用。

1.3 細胞培養(yǎng)

配制含有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，重懸U251細胞，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼滿瓶底后添加0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 CCK-8法檢測細胞活力

將細胞以5 000個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基體積分數(shù)為5%、10%、20%的各組含藥血清，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再添加10 μL/孔CCK-8試劑，避光培養(yǎng)2 h，于450 nm波長處檢測各孔光密度（OD）值，細胞活力=實驗孔OD值/對照孔OD值×100%。取細胞活力均在50%以上且差異最明顯的給藥體積分數(shù)進行后續(xù)克隆形成能力、細胞凋亡等實驗。

1.5 集落形成實驗

將細胞以100個/孔接種于6孔板，培養(yǎng)14 d，去除培養(yǎng)基，95%乙醇固定，滴加0.1%結(jié)晶紫并于4 ℃下靜置染色過夜，次日取出復(fù)溫45 min，光鏡下計數(shù)克隆形成數(shù)（每個克隆數(shù)含有50個以上細胞，直徑0.3～1.0 mm）。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布與細胞凋亡率

取各組細胞3×106個，以預(yù)冷PBS重懸，800 r/min離心5 min后留取底部細胞，并添加DNA Staining solution和Permeabilization solution染液渦旋混勻，37 ℃孵育40 min，800 r/min離心5 min后再添加PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測細胞周期分布。取各組細胞3×106個，預(yù)冷1×Binding Buffer重懸細胞，再分別加入Annexin V-FITC和PI染料混勻，室溫避光孵育10 min，再添加1×Binding Buffer至500 μL混勻，上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.7 qPCR檢測細胞中相關(guān)基因mRNA水平

收集各組細胞，添加Trizol提取RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，構(gòu)建qPCR體系（20 μL）：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.4 μL，去RNA酶水8.2 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min；變性95 ℃ 10 s，退火52.3 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。原癌基因C-myc：上游5'-GACAGCAGCTCGCCCAAGT-3'，下游5'-CTCCAGCAGAAGGTGATCCAG-3'，產(chǎn)物大小254 bp；細胞周期蛋白D1（CyclinD1）：上游5'-CCCACTGGTACGATACGC-3'，下游5'-AGCCTGGGAAACACCC-3'，產(chǎn)物大小169 bp；GAPDH引物：上游5'-AAATCCCATCACCATCTTCCAG-3'，下游5'-TGAGTCCTTCCAGGATACCAAA-3'，產(chǎn)物大小320 bp。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法分析C-myc、CyclinD1 mRNA的相對表達水平。

1.8 Western blot法檢測細胞中相關(guān)蛋白表達

收集各組細胞，于冰上裂解30 min，以12 000 r/min離心10 min后吸取上清液即為總蛋白。經(jīng)BCA試劑盒測定濃度，置于100 ℃水浴變性5 min，各組取50 μg變形蛋白上樣，行SDS-PAGE電泳1.5 h，濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入一抗Bcl-2、Bax、Caspase-3（均1∶1 500）和Caspase-8、β-catenin、E-cadherin、Vimentin、GAPDH（均1∶1 000），4 ℃孵育過夜，再置于二抗（1∶4 000）溶液室溫孵育1 h，最后滴加ECL曝光液，曝光顯影。應(yīng)用Image J 1.7.0軟件分析各蛋白條帶，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值比值為目的蛋白相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞活力比較

5%體積分數(shù)低、中、高劑量組細胞活力分別為（89.79±3.44）%、（81.74±4.01）%、（79.93±3.73）%；10%體積分數(shù)低、中、高劑量組細胞活力分別為（80.81±6.51）%、（64.93±6.46）%、（59.78±3.05）%；20%體積分數(shù)低、中、高劑量組細胞活力分別為（59.07±6.68）%、（49.00±1.50）%、（38.19±5.03）%。10%體積分數(shù)低、中、高劑量組細胞活力均在50%以上，且差異明顯，選擇10%體積分數(shù)的含藥血清作為最終劑量；與對照組細胞活力（100.00±0.00）%比較，低、中、高劑量組細胞活力依次降低（n=3，F(xiàn)=42.127，P＜0.001）。

2.2 各組細胞克隆形成能力比較

對照組和低、中、高劑量組細胞克隆形成數(shù)分別為（37.33±3.51）、（26.67±6.11）、（23.33±4.51）及（16.00±2.65）個，與對照組比較，低、中、高劑量組克隆形成數(shù)依次減少（n=3，F(xiàn)=12.254，P＜0.05），見圖1。

2.3 各組細胞周期分布情況和C-myc、CyclinD1 mRNA相對表達水平比較

與對照組比較，低、中、高劑量組細胞處于S期比例增多，C-myc和CyclinD1 mRNA相對表達水平降低，低、高劑量組G1期比例降低，而中、高劑量組G2期細胞比例降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組處于S期細胞比例升高，C-myc mRNA相對表達水平降低，中、高劑量組G2期細胞比例和CyclinD1 mRNA相對表達水平均降低（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組S期細胞比例升高，G1期細胞比例降低（P＜0.05），見圖2，表1、2。

2.4 各組細胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達水平比較

與對照組比較，高劑量組細胞凋亡率升高，低、中、高劑量組細胞中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3表達水平升高，中、高劑量組Caspase-8表達水平升高（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組細胞凋亡率和Caspase-3、Caspase-8表達水平升高，中、高劑量組細胞中Bax/Bcl-2升高（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組細胞凋亡率和Caspase-3、Caspase-8表達水平升高，見表3，圖3、4。

2.5 各組細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)記物表達水平比較

與對照組比較，中、高劑量組β-catenin表達水平均降低，E-cadherin表達水平均升高，低、中、高劑量組Vimentin表達水平均降低（P＜0.05）；低、中、高劑量組β-catenin表達水平依次降低，高劑量組E-cadherin表達水平較低、中劑量組升高（P＜0.05）；中、高劑量組Vimentin表達水平較低劑量組降低（P＜0.05），見表4、圖5。

3 討論

復(fù)方藤梨湯方中黃芪、當(dāng)歸是氣血雙補的經(jīng)典組合，鱉甲散結(jié)逐瘀，冬凌草、藤梨根清解熱毒，全方攻補兼施，具有扶正祛邪，抗癌抑瘤的功效［8-9］。曹劉薦等［10］選取結(jié)直腸化療患者為研究對象，在mFLFOX6化療方案基礎(chǔ)上加服復(fù)方藤梨湯治療，發(fā)現(xiàn)患者生存質(zhì)量明顯提高，而且復(fù)方藤梨湯還可促進機體免疫功能提升，發(fā)揮減毒作用。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方藤梨湯含藥血清處理后的U251細胞活力和克隆形成能力較對照組明顯降低，表明復(fù)方藤梨湯含藥血清可抑制U251細胞增殖。通過流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布顯示，復(fù)方藤梨湯含藥血清可誘導(dǎo)細胞大量停滯于S期，G2期細胞比例明顯減少，提示復(fù)方藤梨湯阻滯了正常細胞周期發(fā)展。C-myc和CyclinD1在細胞周期中發(fā)揮重要調(diào)控作用，其中原癌基因C-myc在細胞周期紊亂細胞和大量腫瘤細胞中過表達，是細胞周期發(fā)展的必需信號；CyclinD1作為細胞周期蛋白，主要調(diào)控G1/S期，促進細胞生長［11-12］。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方藤梨湯含藥血清處理后的細胞中C-myc、CyclinD1 mRNA相對表達水平較對照組降低，提示復(fù)方藤梨湯含藥血清可能通過下調(diào)C-myc、CyclinD1基因表達，阻斷細胞進入G2期，降低細胞增殖能力。

細胞凋亡機制缺陷是腫瘤細胞異常增殖的主要原因，將凋亡調(diào)節(jié)分子作為抗腫瘤藥物篩選靶點已應(yīng)用于臨床，如酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼可靶向凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的Bcl-2家族成員，發(fā)揮殺傷慢性髓系白血病細胞的作用［13-14］。細胞凋亡主要涉及Bcl-2和Caspase這2個進化保守的蛋白家族。細胞應(yīng)激狀態(tài)下，抗凋亡因子Bcl-2被拮抗，解除對促凋亡因子Bax的抑制，促進細胞色素C釋放入胞漿，形成凋亡復(fù)合體，活化Caspase-9，進一步激活下游Caspase-3、Caspase-8，促進細胞凋亡［15-16］。藤梨根是復(fù)方藤梨湯的抗癌主藥。楊譽佳等［17］研究顯示，藤梨根提取物可增強Bax、Caspase-3表達，促進人宮頸癌Hela細胞的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，低、中、高劑量組細胞中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3表達水平升高，中、高劑量組Caspase-8表達水平升高，提示復(fù)方藤梨湯含藥血清可能通過促進Bax/Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8表達，誘導(dǎo)細胞凋亡。

腦實質(zhì)內(nèi)浸潤生長是彌漫性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的典型特征，上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化在此過程中起關(guān)鍵作用，腫瘤細胞通過降低細胞間黏附作用，獲得間質(zhì)細胞表型，增強細胞侵襲、遷移能力，促進新生血管的生成，以應(yīng)對微環(huán)境信號［18-20］。E-cadherin是細胞黏附分子，可結(jié)合多功能蛋白β-catenin，參與黏合帶的形成，導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號通路活性降低，抑制腫瘤細胞的侵襲與遷移［21］。Vimentin則是間質(zhì)細胞標(biāo)志物，其表達升高是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生的重要信號［22］。吳幸冬等［23］研究表明，黃芪可調(diào)節(jié)上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達，影響腫瘤細胞遷移。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方藤梨湯含藥血清可上調(diào)E-cadherin，下調(diào)β-catenin、Vimentin表達，從而抑制細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。

綜上所述，復(fù)方藤梨湯含藥血清可促使人腦膠質(zhì)瘤U251細胞阻滯于S期，抑制細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，并調(diào)節(jié)β-catenin、E-cadherin和Vimentin表達，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究為復(fù)方藤梨湯應(yīng)用于人腦膠質(zhì)瘤的治療提供了參考依據(jù)，但該復(fù)方湯劑的抗癌作用機制仍有待深入分析，各指標(biāo)間的劑量作用效果并不完全一致，考慮為含藥血清干預(yù)時間尚短所致，后續(xù)將延長實驗時間深入分析不同劑量含藥血清對細胞增殖、凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達的影響。

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（2022-11-09收稿 2023-02-05修回）

（本文編輯 陸榮展）