許江飛，周海燕，王寬紅

新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院（新鄉(xiāng)醫(yī)學院第四臨床學院）神經(jīng)內(nèi)科，新鄉(xiāng) 453000

腦缺血為臨床常見腦血管疾病之一，70%患者會發(fā)生腦缺血再灌注（cerebral ischemia-reperfusion，CIR）損傷，CIR損傷的死亡率達10%，致殘率高于50%，再灌注不僅可造成腦組織缺血損傷，還會誘發(fā)遠隔重要臟器（例如肺臟）損傷，這是造成患者死亡的重要原因之一［1］。核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶1（nuclear factor E2-related factor 2/heme oxygenase-1，Nrf2/HO-1）屬于內(nèi)源性抗氧化通路，既往研究顯示激活Nrf2/HO-1通路對腦出血、腦梗死等多種腦損傷均具有重要的保護作用［2-3］，也有基礎(chǔ)研究證實激活Nrf2/HO-1通路可減輕內(nèi)毒素誘發(fā)的急性肺損傷［4］。降低再灌注繼發(fā)性臟器損傷為治療CIR的重要環(huán)節(jié)，但目前尚缺乏明確療效的靶向藥物。七葉皂苷鈉（sodium aescinate）是從七葉樹科植物天師栗中提取的多酯鍵三萜皂苷鈉鹽，臨床研究顯示其能夠緩解腦出血患者的腦水腫，降低出血量［5］，然而對CIR引發(fā)的肺損傷是否有保護作用目前尚不清楚。本研究采用七葉皂苷鈉對CIR大鼠進行干預，探究其對CIR引發(fā)肺損傷的改善作用，初步探討作用機制，以期為藥物應(yīng)用提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠74只，8～10周齡，體重200～220g，由北京科宇動物養(yǎng)殖中心提供，許可證號：SYXK（京）2018-0036。所有大鼠均在23℃、50%濕度環(huán)境中統(tǒng)一飼養(yǎng)，大鼠自由飲食飲水。本研究符合《實驗動物管理條例》，且經(jīng)動物倫理委員會批準（倫理批號：20201028）。

1.2 藥品、試劑與儀器

1.2.1 藥品與試劑

注射用七葉皂苷鈉（武漢普生制藥有限公司，國藥準字H20057826，規(guī)格5mg，批號：180215）；Nrf2特異性抑制劑（ML385）（美國Selleck Chemicals公司，規(guī)格5mg，貨號：846557-71-9）；水合氯醛、多聚甲醛購自德國Sigma-Aldrich公司，貨號分別為C8383、P6148；生理鹽水（江西江藍純生物試劑有限公司，貨號：JLC-E1400）；HE染色試劑盒、RIPA裂解液均購自碧云天生物技術(shù)研究所，貨號分別為C0105、P0013E；白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒均購自北京百奧萊博科技有限公司，貨號分別為ZN2877-MBG、KFS230-AVD；活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒、免疫組化試劑盒購自南京建成生物工程研究所，貨號分別為E004-1-1、A003-1-2、A001-3-2、I001-1；Tris、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、甲醇購自北京索萊寶生物科技有限公司，貨號分別為T1160、T8190、S8010、M9330；過氧化氫溶液（北京萬佳首化生物科技有限公司，貨號：SH-00546）；檸檬酸鈉（德國默克公司，貨號：PHR1416）；兔抗鼠Nrf2、HO-1、抗氧化響應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）抗體、核內(nèi)參LaminB購自英國Abcam公司，貨號分別為ab62352、ab137749、ab99975、ab16048；山羊抗兔HRP標記二抗、山羊抗鼠HRP標記二抗購自美國CST公司，貨號分別為14708、96714；鼠抗鼠β-actin抗體（美國RcD公司，貨號：MAB8929）。

1.2.2 儀器

Vi-Cell XR細胞計數(shù)儀（美國貝克曼公司）；FA3004電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；DHG-9023A烤箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；Centrifuge 5702 RH離心機（德國Eppendorf公司）；JJ-2B勻漿器（上海達洛科學儀器有限公司）；XDS-200C倒置顯微鏡（蔡康光學儀器有限公司）；Mini-PROTEANTetra1658033垂直電泳儀、Mini-Trans Blot1703930轉(zhuǎn)膜儀購于美國Bio-Rad公司；CUT4062石蠟切片機（德國SLEE公司）；Gel-Doc IT TS2凝膠成像儀（美國UVP公司）。

1.3 CIR大鼠模型建立

參照改良Zea-Longa線栓法構(gòu)建CIR模型［6］。隨機選取62只大鼠，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，在頸部正中部位做一切口，將左頸總動脈、左頸外動脈及左頸內(nèi)動脈依次分離，于左頸外動脈遠端用棉線環(huán)向纏繞1cm結(jié)扎。將栓線插入左頸總動脈，沿著左頸總動脈及左頸內(nèi)動脈推送入大腦中動脈起始處，推入深度距離分叉部位2cm，阻斷大腦中動脈血流，2h后將栓線從左頸總動脈緩慢抽出，使中動脈血流恢復（即缺血再灌注），24h后縫合頸部切口。大鼠清醒2h后，依據(jù)Zea Longa標準進行評分［7］，評分為1～3分者即認為造模成功，納入研究。本研究的模型制備過程中共14只大鼠死亡，造模成功率為77.42%。

1.4 大鼠分組方法與給藥處理

選取造模成功的48只大鼠，依據(jù)隨機數(shù)字表法分為CIR模型（Model）組、七葉皂苷鈉（SA）組、Nrf2抑制劑（ML385）組、七葉皂苷鈉聯(lián)合Nrf2抑制劑（SA+ML385）組，每組12只。另選取12只大鼠作為假手術(shù)（Sham）組，即不植入栓線，其他操作與Model組相同。

造模結(jié)束后，SA組給予注射用七葉皂苷鈉，尾靜脈注射，劑量為10mg/kg［8］；ML385組給予Nrf2特異性抑制劑（ML385），尾靜脈注射，劑量為30mg/kg［9］；SA+ML385組尾靜脈注射10mg/kg SA，15min后注射30mg/kg ML385；Sham、Model組尾靜脈注射等體積生理鹽水。各組均連續(xù)給藥4周。

1.5 觀察指標與檢測方法

1.5.1 樣本收集

末次給藥處理后，將大鼠麻醉處死，左肺用1.8 mm氣管插管行支氣管肺泡灌洗，灌洗液用量為2.5ml/次，回收率80%，共灌洗5次，得到支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）；取右肺上葉組織，清洗后部分組織用4%多聚甲醛固定，部分組織用于制備肺組織勻漿液；右肺中葉組織用于評估肺的濕/干重比（wet/dry，W/D）；右肺下葉組織置于-80℃保存。

1.5.2 CIR大鼠肺組織病理形態(tài)學變化及肺組織病理損傷程度

取出4%多聚甲醛固定的肺組織，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后用切片機制備5μm肺組織石蠟切片，烘烤、脫蠟脫水后參照HE染色試劑盒說明書對肺組織切片進行染色，封片后置于倒置顯微鏡下觀察并保存病理形態(tài)學圖片。采用半定量法［10］評估肺組織病理損傷程度，評價項目包括肺泡充血、炎癥細胞浸潤、間質(zhì)水腫、肺泡水腫及肺泡壁厚度，每個項目0～4分，共20分，評分越高代表損傷越嚴重。

1.5.3 CIR大鼠肺組織的干重、濕重

采用電子天平稱取右肺中葉組織的重量，記錄濕重（wet，W）；將右肺中葉組織置于80℃烤箱中，當兩次測量重量差不超過0.2mg時即為恒重，記錄干重（dry，D）；計算肺組織的W/D值。

1.5.4 CIR大鼠BALF中的炎癥因子水平與炎癥細胞計數(shù)

將BALF在4℃、3000r/min的條件下離心10min后，保留上清液，采用ELISA法檢測BALF上清液中TNF-α、IL-1β水平（參照相關(guān)試劑盒說明書進行操作）；采用全自動細胞計數(shù)儀測定BALF原液中總細胞數(shù)、多形核白細胞數(shù)量。

1.5.5 CIR大 鼠 肺 組 織 中 的SOD、MDA、ROS水平

稱取1mg肺組織，添加9ml生理鹽水，研磨后置于勻漿器中制備勻漿液。采用硫代巴比妥酸法檢測MDA水平；采用氮藍四唑光還原法檢測組織SOD水平；采用二氫乙錠（dihydroethidium，DHE）法［11］檢測肺組織中ROS相對水平。

1.5.6 免疫 印 跡（Western blotting，WB）法測定CIR大鼠肺組織Nrf2、ARE、HO-1蛋白表達水平

實驗開始前先進行配液：①電泳緩沖液（5×）配制：Tris 15.1g，甘氨酸72.0g，SDS 5.0g，蒸餾水定容至1L，pH調(diào)至8.3，制得電泳緩沖液（5×），置于4℃保存。使用時將電泳緩沖液（5×）稀釋為電泳緩沖液（1×），即：取200ml電泳緩沖液（5×），蒸餾水定容至1L，即得。②轉(zhuǎn)膜緩沖液配制：甘氨酸2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，600ml蒸餾水充分溶解，加200ml甲醇后混勻，定容至1L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

配液完成后，取-80℃保存的右肺下葉組織，加入RIPA裂解液裂解，冰浴勻漿后，4℃12000r/min離心20min，上清液即為蛋白樣本。測定蛋白含量后，取20μg蛋白行10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳，將凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，用山羊血清封閉膜，清洗后用Nrf2、ARE、LaminB、HO-1、β-actin一抗（1∶300）孵育，4℃過夜。洗滌后于37℃下用山羊抗兔HRP標記二抗或山羊抗鼠HRP標記二抗（1∶3000）孵育2h。經(jīng)增強化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色后，在凝膠成像儀中觀察成像情況，以鼠抗鼠β-actin抗體為內(nèi)參蛋白，采用ImageJ 1.8.0軟件對蛋白相對表達情況進行分析。

1.5.7 免疫組化法檢測CIR大鼠肺組織Nrf2、ARE、HO-1陽性表達情況

肺組織石蠟切片經(jīng)脫蠟水化后加入過氧化氫溶液，浸泡10min以消除內(nèi)源性過氧化酶，清洗后加入檸檬酸鈉進行抗原熱修復，滴加山羊血清后室溫下封閉20min，用兔抗鼠Nrf2、ARE、HO-1一抗及鼠抗鼠β-actin一抗（1∶300）于4℃孵育，過夜，用山羊抗兔HRP標記二抗或山羊抗鼠HRP標記二抗（1∶3000）室溫下孵育45min，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色后行蘇木精復染、氨水反藍，經(jīng)脫水、透明、封片后進行鏡檢，利用ImageJ 1.8.0軟件分析Nrf2、ARE、HO-1陽性表達率，蛋白陽性表達率=視野下陽性染色細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較行單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 CIR大鼠肺組織病理形態(tài)學變化及肺組織病理損傷程度

Model組、ML385組肺組織中肺血管及肺泡隔膜毛細血管擴張，肺泡壁變厚，肺泡腔變窄，肺泡隔變寬，伴有炎癥細胞浸潤，肺間質(zhì)出現(xiàn)水腫、充血；與Model組比較，SA組、SA+ML385組均明顯改善。各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果（100×）

與Sham組比較，Model組肺損傷評分升高（P＜0.05），證明CIR模型構(gòu)建成功。ML385組肺損傷評分高于Model組（P＜0.05）。SA組、SA+ML385組肺損傷評分低于Model組，且SA+ML385組肺損傷評分高于SA組、低于ML385組（P＜0.05）。各組大鼠肺損傷評分趨勢見圖2。

2.2 CIR大鼠肺組織的W/D

與Sham組比較，Model組肺組織的W/D值升高（P＜0.05）。ML385組肺組織的W/D值高于Model組（P＜0.05）。SA組、SA+ML385組肺組織的W/D值低于Model組，且SA+ML385組肺組織的W/D值高于SA組、低于ML385組（P＜0.05）。各組大鼠肺組織的W/D趨勢見圖3。

圖3 各組肺組織的W/D值比較（n=12）

2.3 CIR大鼠BALF中的炎癥因子水平與炎癥細胞計數(shù)

與Sham組比較，Model組BALF中IL-1β、TNF-α、總細胞數(shù)量、多形核白細胞數(shù)量均升高（P＜0.05）。ML385組BALF中各指標均高于Model組（P＜0.05）。SA組、SA+ML385組BALF中各指標均低于Model組，且除TNF-α外，SA+ML385組BALF中各指標高于SA組、低于ML385組（P＜0.05）。各組BALF中的IL-1β、TNF-α、總細胞數(shù)量、多形核白細胞數(shù)量趨勢見圖4。

圖4 各組IL-1β、TNF-α、總細胞數(shù)量、多形核白細胞數(shù)量比較（n=12）

2.4 CIR大鼠肺組織中的SOD、MDA、ROS水平

與Sham組比較，Model組ROS、MDA水平均升高，SOD水平降低（P＜0.05）。ML385組ROS、MDA水平高于Model組，SOD水平低于Model組（P＜0.05）。SA組和SA+ML385組ROS、MDA水平低于Model組，SOD水平高于Model組；SA+ML385組ROS、MDA水平高于SA組，SOD水平低于SA組、高于ML385組（P＜0.05）。各組ROS、MDA、SOD水平趨勢見圖5。

圖5 各組ROS、MDA、SOD水平比較（n=12）

2.5 CIR大鼠肺組織Nrf2、ARE、HO-1蛋白表達

與Sham組比較，Model組肺組織Nrf2、ARE、HO-1蛋白表達降低（P＜0.05）。ML385組Nrf2、ARE、HO-1蛋白表達低于Model組（P＜0.05）。SA組 和SA+ML385組Nrf2、ARE、HO-1蛋白表達高于Model組；SA+ML385組Nrf2、ARE、HO-1蛋白表達低于SA組、高于ML385組（P＜0.05），各組Nrf2、ARE、HO-1蛋白表達量趨勢見圖6。

圖6 各組肺組織Nrf2、ARE、HO-1蛋白表達水平變化（n=12）

2.6 CIR大鼠肺組織Nrf2、ARE、HO-1陽性表達情況

與Sham組比較，Model組肺組織Nrf2、ARE、HO-1陽性表達降低（P＜0.05）。ML385組Nrf2、ARE、HO-1陽性表達低于Model組（P＜0.05）。SA組 和SA+ML385組Nrf2、ARE、HO-1陽性表達高于Model組；SA+ML385組Nrf2、ARE、HO-1陽性表達低于SA組、高于ML385組（P＜0.05）。各 組Nrf2、ARE、HO-1蛋白陽性表達見圖7。

圖7 各組Nrf2、ARE、HO-1蛋白陽性表達比較（n=12）

3 討論

本研究采用改良Zea-Longa線栓法［6］構(gòu)建CIR致肺損傷大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Model組肺組織出現(xiàn)肺泡壁變厚，肺泡腔變窄，肺泡隔變寬，伴有炎癥細胞浸潤，且伴有肺間質(zhì)水腫、充血，大鼠肺組織的W/D值升高，以上結(jié)果說明Model組大鼠肺組織發(fā)生嚴重炎癥性損傷及病理改變，符合肺損傷大鼠模型特征，提示造模成功。

七葉皂苷鈉是從中藥天師栗果實中提取的重要活性成份，藥理學研究結(jié)果提示其具有修復毛細血管通透性、消腫、抗炎等功效［12］，有臨床研究表明七葉皂苷鈉在治療腦出血、腦水腫方面療效較佳［13］。七葉皂苷鈉可通過調(diào)控缺氧誘導因子-1α發(fā)揮對心肺復蘇后大鼠腦組織的保護作用［14］，但其對CIR致腦損傷的治療作用尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)七葉皂苷鈉干預后，大鼠肺組織病理學得到明顯改善，肺組織評分降低，肺組織的W/D值降低，提示七葉皂苷鈉可以緩解CIR所致大鼠肺組織水腫，緩解肺組織的炎癥反應(yīng)。

肺組織中的肺泡巨噬細胞能夠釋放大量的IL-1β、TNF-α等促炎性細胞因子，進一步擴大炎癥反應(yīng)。此外IL-1β、TNF-α水平升高能夠加速中性粒細胞浸潤至肺組織損傷區(qū)，擴大組織炎癥反應(yīng)，造成惡性循環(huán)［15］?；A(chǔ)研究顯示，抑制IL-1β分泌可緩解大鼠肺損傷［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，Model組肺組織BALF中IL-1β、TNF-α、總細胞數(shù)量、多形核白細胞數(shù)量均升高，經(jīng)七葉皂苷鈉干預后各指標均降低，提示七葉皂苷鈉可能通過抑制肺組織炎癥因子釋放而降低炎癥反應(yīng)，緩解肺組織損傷。

Nrf2為細胞核轉(zhuǎn)錄因子，一般與Keap1結(jié)合并存在于細胞質(zhì)內(nèi)，當受到氧化應(yīng)激刺激后，Nrf2與Keap1解離，移位到細胞核中與ARE蛋白結(jié)合調(diào)控下游HO-1等抗氧化酶，發(fā)揮抗氧化作用［17］。Nrf2/HO-1與腦組織氧化損傷有關(guān)，過往研究顯示激活Nrf2/HO-1通路有利于降低腦組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)揮腦損傷的神經(jīng)保護作用［18］。Li等［19］發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷Ⅱ可通過激活Nrf2/HO-1通路而減輕腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平；Cattani等［20］發(fā)現(xiàn)激活Nrf2/HO-1可減弱小鼠肺組織氧化應(yīng)激、減弱NF-κB/TNF-α途徑而降低炎癥反應(yīng)。然而Nrf2/HO-1與CIR繼發(fā)肺損傷的關(guān)系目前尚不明確。本研究中，Model組大鼠肺組織中Nrf2、ARE、HO-1表達水平降低，提示CIR繼發(fā)肺損傷發(fā)生可能與Nrf2/HO-1信號通路的抑制有關(guān)。經(jīng)七葉皂苷鈉干預后，大鼠肺組織中Nrf2、ARE、HO-1表達水平升高，推測七葉皂苷鈉緩解CIR大鼠肺部炎癥反應(yīng)的作用可能與Nrf2/HO-1信號通路的激活有關(guān)。腦損傷或腦出血后，腦組織中會釋放大量ROS，造成氧自由基增多，并進一步導致SOD減少，MDA 等氧化物質(zhì)增多，加重氧化應(yīng)激損傷［21］。本研究中，Model組MDA、ROS水平均升高，SOD水平降低；經(jīng)七葉皂苷鈉干預后，MDA、ROS水平均降低，SOD水平升高，提示七葉皂苷鈉可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路降低CIR引發(fā)的氧自由基堆積，發(fā)揮抗氧化作用。為證實這一推測，本研究采用Nrf2特異性抑制劑處理CIR大鼠發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Nrf2特異性抑制劑干預后，CIR大鼠肺組織損傷更為嚴重，BALF中炎癥因子表達水平及炎癥細胞數(shù)量均高于Model組，肺組織中Nrf2、ARE、HO-1表達水平均低于Model組，提示抑制Nrf2表達后能夠加重CIR后肺組織炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激水平，加重肺損傷；Nrf2特異性抑制劑聯(lián)合七葉皂苷鈉干預后發(fā)現(xiàn)，大鼠肺部炎癥反應(yīng)、肺損傷得到一定緩解，進一步說明七葉皂苷鈉能夠通過激活Nrf2/HO-1信號通路，降低CIR后肺組織炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激水平，改善肺組織損傷。

綜上所述，七葉皂苷鈉可在一定程度上改善CIR繼發(fā)肺損傷，其機制可能與激活Nrf2/HO-1信號通路、降低CIR后肺組織炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激水平有關(guān)。本研究也存在一定的缺陷，例如CIR繼發(fā)肺損傷發(fā)生機制較為復雜，七葉皂苷鈉是否還可能通過參與其他信號通路對CIR繼發(fā)肺損傷的保護作用還有待后續(xù)深入探究。