黃 武,孟易禹,張麗娜

0 引言

鼻咽癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤,是我國南方最常見的腫瘤之一[1],具有位置深、侵襲性強(qiáng)、進(jìn)展快、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)。鼻咽癌是一種放射敏感性腫瘤,放射治療是其主要的治療策略。盡管放療可以提高鼻咽癌患者的5年生存率,但由于疾病位置較深,早期診斷困難,部分患者在治療時已有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,總體效果仍然較差[2-3]。因此,對鼻咽癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的探討,尋找有價值的生物標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)顯得尤為重要。

miRNA是一種高度保守的非編碼單鏈小RNA分子,約18～25個核苷酸,通過與靶基因的3′UTR序列結(jié)合,調(diào)控靶基因的表達(dá)。miR-155在包括鼻咽癌、乳腺癌在內(nèi)的許多腫瘤組織中高表達(dá)[4-5],但是miR-155與鼻咽癌之間的關(guān)系及其分子機(jī)制尚未見報道。而ETS1(Eythroblastosis virus E26癌基因同源物1)作為一個轉(zhuǎn)錄因子,在鼻咽癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。本研究通過分析鼻咽癌細(xì)胞中miR-155和ETS1對侵襲轉(zhuǎn)移的作用來探究其分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系 人鼻咽癌細(xì)胞CNE1、CNE2、CNE2Z、HKP、5-8F和人正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

圖1 miR-155和ETS1在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)

1.2 主要試劑 胎牛血清購自美國Hyclone公司;RPMI-1640液體培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司;miR-155 mimics、miR-157 inhibitor和ETS1 siRNA均由吉瑪基因公司設(shè)計合成;4%多聚甲醛購自上海博谷生物科技有限公司;青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶消化液和結(jié)晶紫染色液購自上海碧云天科技有限公司;Matrigel基質(zhì)膠(354234)購自美國BD公司;Fibronectin(F8180)購自北京索萊寶科技有限公司;Transwell小室購自美國corning公司;Lipofectamine 3000試劑盒購自美國賽默飛世爾科技公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒[miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop),MR101]和q-PCR試劑盒(miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix,MQ101-01)購自南京諾唯贊生物科技有限公司;兔單克隆抗體ETS1(14069S)、兔單克隆抗體MMP2(40994S)、兔單克隆抗體MMP9(13667S)和兔單克隆抗體GAPDH (2118)購自美國CST公司;HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(A0208)購自上海碧云天科技有限公司;HRP化學(xué)發(fā)光底物購自美國Miliipore公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人鼻咽癌細(xì)胞CNE1、CNE2、CNE2Z、HKP、5-8F以含10% FBS和1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng);人正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69以含12% FBS和1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng);細(xì)胞正常培養(yǎng)環(huán)境為95% 空氣、5% CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱。取對數(shù)生長期的CNE1細(xì)胞和5-8F細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),轉(zhuǎn)染時,按照說明書步驟[6],通過 Lipofectamine3000 轉(zhuǎn)染miR-155 NC(5′-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGG GGU-3)、miR-155 inhibitor(5′-UCCCCTUTCUCGUTTUGCUTTUU-3′)、miR-155 mimics(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)和ETS1 siRNA(5′-GCA GAAAGAGGATGTGAAA-3′),以上4個質(zhì)粒均購自廣州市銳博生物科技有限公司。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-155和ETS1的mRNA表達(dá) 采用TRIZOL法提取人鼻咽癌細(xì)胞CNE1、CNE2、CNE2Z、HKP、5-8F和人正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69中總RNA,按照說明書步驟建立16 μl反應(yīng)體系,后行基因組DNA去除,并在上述體系中加入4 μl 的5×HiScript?Ⅱ qRT SuperMix Ⅱ 混勻,并按50 ℃ 15 min和85 ℃ 5 s的程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。后利用StepOne Plus實(shí)時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)將逆轉(zhuǎn)錄的cDNA用SYBR Green 法進(jìn)行qPCR反應(yīng)。采用2-△△CT法計算mRNA表達(dá)水平。引物由生工生物工程(上海) 股份有限公司設(shè)計合成。miR-155:5-ACATTGATTATACGTGCTCGG-3 (forward),5-GCTCGGCCGAAGTTTAG-3(reverse);U6:5- CTCGCTTCGGCAGCACA-3(forward),5-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3(reverse);ETS1:5-TGCCCTGGGTAAAGAATG-3 (forward),5-GATACCGTAGCTGATGAAG-3 (reverse)。

1.5 蛋白印跡法測定ETS1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá) 提取各組蛋白后,按照文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行蛋白印跡法[7],其中抗體配比如下:ETS1(1∶1 000)、MMP2(1∶1 000)、MMP9(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)。

1.6 Transwell測定miR-155對人鼻咽癌CNE1和5-8F細(xì)胞的遷移作用 分別將150 μl無血清濃度為 2.0×106個/ml的轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor、miR-155 NC的鼻咽癌CNE1細(xì)胞和轉(zhuǎn)染miR-155 mimics、ETS1 siRNA和miR-155 NC的鼻咽癌5-8F細(xì)胞,加入Transwell上室;并在Transwell下室,加入含纖連蛋白和20%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室,并拭去其上層鼻咽癌細(xì)胞后,加入甲醇固定15 min,結(jié)晶紫30 min染色后,洗去干燥。

1.7 Transwell測定miR-155對人鼻咽癌CNE1和5-8F細(xì)胞的侵襲作用 取預(yù)冷的無血清基質(zhì)膠稀釋液(Matrigel基質(zhì)膠∶RPMI-1640培養(yǎng)基=1∶2) 50 μl,加入Transwell上室中,風(fēng)干過夜后,其余步驟同“1.6”。

2 結(jié)果

2.1 miR-155和ETS1在鼻咽癌細(xì)胞和鼻咽上皮細(xì)胞中的表達(dá) 在鼻咽癌細(xì)胞CNE1、CNE2、CNE2Z、HKP、5-8F和人正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69中,miR-155的表達(dá)量逐漸降低(P<0.05,見圖1A),ETS1蛋白的表達(dá)量在鼻咽癌細(xì)胞CNE1、CNE2、CNE2Z、HKP、5-8F和人正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69中也逐漸降低(P<0.05,見圖1B)。在鼻咽癌細(xì)胞中,CNE1細(xì)胞的miR-155表達(dá)量和ETS1蛋白的表達(dá)量最高,5-8F細(xì)胞的兩者表達(dá)量最低,因此,對鼻咽癌細(xì)胞CNE1和5-8F進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 miR-155對鼻咽癌細(xì)胞CNE1和5-8F侵襲遷移的影響 分別將miR-155 inhibitor和miR-155 mimics轉(zhuǎn)染至CNE1細(xì)胞和5-8F細(xì)胞(見圖2A、2B),在CNE1細(xì)胞中,與miR-155 NC組相比,miR-155 inhibitor組的侵襲遷移能力明顯下降[侵襲:(237.33±15.63) 個vs.(117.00±5.72)個;遷移:(331.00±9.42) 個vs.(262.00±11.05)個](P<0.05,見圖2C、2D)。在5-8F細(xì)胞中,與miR-155 NC組相比,miR-155 mimics組的侵襲遷移能力顯著提高[侵襲:(134.00±8.83)個vs. (326.00±12.68)個;遷移:(236.67±12.39個vs. (458.00±18.38)個](P<0.05,見圖2E、2F)。

圖2 miR-155對鼻咽癌細(xì)胞侵襲遷移的影響

2.3 miR-155 對 ETS1、MMP2、MMP9蛋白的影響 ETS1可以作為miR-155的下游調(diào)控基因。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn),在鼻咽癌組織中,ETS1表達(dá)量高于正常組織(P<0.05,圖3A)。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示,在鼻咽癌CNE1細(xì)胞中,與miR-155 NC組相比,miR-155 inhibitor組ETS1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)減弱[ETS1:1.00vs. (0.77±0.04);MMP2:1.00vs. (0.58±0.05);MMP9:1.00 vs. (0.38±0.06)](P<0.05,圖3B、3C);在鼻咽癌5-8F細(xì)胞中,與miR-155 NC組相比,miR-155 mimics組ETS1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)增強(qiáng)[ETS1:1.00vs. (1.61±0.06);MMP2:1.00vs. (2.63±0.06);MMP9:1.00vs. (3.38±0.06)](P<0.05,圖3B、3D)。

圖3 miR-155 對 ETS1、MMP2、MMP9蛋白的影響

2.4 miR-155通過ETS1促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲 轉(zhuǎn)染ETS1 siRNA后,5-8F鼻咽癌細(xì)胞中ETS1的蛋白和mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05,圖4A),miR-155 mimics+ ETS1 siRNA組的細(xì)胞遷移[(451.67±22.10) 個vs. (229.00±14.45)個]和侵襲[(402.33±8.22)個vs. (229.00±24.91)個]明顯弱于miR-155 mimics組細(xì)胞(P<0.05,圖4B),而ETS1、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)也弱于miR-155 mimics組[ETS1:(1.63±0.28)vs. (0.51±0.02);MMP2:(2.41±0.02)vs. (1.00±0.07);MMP9:(2.37±0.03)vs. (1.02±0.11)](P<0.05,圖4C)。

圖4 miR-155促進(jìn)鼻咽癌5-8F細(xì)胞侵襲遷移的機(jī)制

3 討論

鼻咽癌患者死亡的一個主要原因是發(fā)生轉(zhuǎn)移[2-3]。在鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中,細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)降解是重要步驟,腫瘤細(xì)胞只有通過降解ECM并侵入血管,隨全身血液循環(huán)才能到達(dá)轉(zhuǎn)移靶器官。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是降解ECM最重要的蛋白水解酶,其中MMP2和MMP9在包括鼻咽癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)[8-9]。與慢性鼻咽炎組相比,鼻咽癌組織中MMP2及MMP9陽性表達(dá)率明顯提高,與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相比,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組MMP2及MMP9陽性表達(dá)率顯著升高,并且低分化鱗癌高于高分化鱗癌[10-11]。

ETS是在禽逆轉(zhuǎn)錄病毒E26的研究中發(fā)現(xiàn)的,其具有高度保守的DNA結(jié)合域,可以結(jié)合特定序列來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。ETS1是ETS轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員,通過與靶基因結(jié)合的順式作用元件激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄,并對細(xì)胞生長、分化、凋亡、造血、組織重塑、血管生成等發(fā)揮作用[12-13]。已有研究證實(shí),ETS1可以調(diào)節(jié)鼻咽癌的發(fā)展[14-15],體外下調(diào)ETS1的表達(dá)可顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和侵襲性[16]。

ETS1對下游靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用也受miRNA調(diào)節(jié),本研究通過TargetScan網(wǎng)站(https://www.targetscan.org/)收集相關(guān)數(shù)據(jù),結(jié)果顯示,ETS1可以作為miR-155的下游靶基因,并在鼻咽癌組織和正常組織中差異表達(dá)。研究顯示,miR-155在鼻咽癌中高表達(dá),并且能夠提高鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力,抑制鼻咽癌細(xì)胞凋亡[17]。

本研究顯示,miR-155能夠促進(jìn)鼻咽癌5-8F細(xì)胞的侵襲和遷移,并提高ETS1、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá);抑制miR-155能夠降低鼻咽癌CNE1細(xì)胞的侵襲和遷移能力,并降低ETS1、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)。為進(jìn)一步探索miR-155促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制,本研究在5-8F鼻咽癌細(xì)胞中將ETS1蛋白干擾后,再次進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)干擾ETS1蛋白表達(dá)后,能夠指抗miR-155 mimics增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的能力,并減弱MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)量。

越來越多的研究表明,miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[18-19]。部分對miRNA的研究已從實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入到臨床階段,目前有很多成功的Ⅰ期臨床試驗(yàn)以及正在開展的Ⅱ期臨床試驗(yàn)[20-22]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-155能夠在體外促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的遷移與侵襲,其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子ETS1促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解過程而實(shí)現(xiàn)的,進(jìn)一步揭示了鼻咽癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,有利于對鼻咽癌疾病的認(rèn)識,對于尋找鼻咽癌生物標(biāo)志物和新的藥物治療靶點(diǎn)具有指導(dǎo)意義。