包卓聰,王慶慶,賈 輝,陸 瑤,時 娜,張 艷

0 引言

肝癌作為一種最為普遍的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在全球范圍內排名第五,而死亡率高居全球第三[1]。肝癌包括原發(fā)性肝癌和繼發(fā)性肝癌,其中肝細胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌,全世界每年約有50萬新發(fā)病例[2-3]。手術切除腫瘤及肝臟移植為當前主要治療手段,但其復發(fā)幾率大,手術難度大,肝源不足,預后差[4]。因此,通過非手術方法治療中晚期肝癌是重要的補充手段[5]。目前,中藥成為抗腫瘤新藥研發(fā)的新方向[6]。姜黃素(Curcumin,CUR)是從姜科屬植物姜黃的根莖中提取的主要活性成分。研究表明,姜黃素具有調節(jié)細胞周期、抑制腫瘤發(fā)生和轉移的活性,其對正常細胞的毒性較低,副作用較小,并且姜黃素還具有抑制HCC生長、侵襲轉移、血管生成及抑制肝星狀細胞活性、乙肝病毒表達復制的作用[7],因此,成為潛在的腫瘤干預藥物的選擇。

四氫姜黃素(Tetrahydrocurcumin,THC)是姜黃素在體內主要的活性代謝產物,自然存在于姜黃中,其結構上缺乏α,β-不飽和羰基部分[8]。四氫姜黃素的結構決定了其獨特和特異性的分子機制,從而使其成為預防和治療癌癥的潛在候選藥物。研究表明,姜黃素可以抑制多種癌癥細胞。姜黃素在肝臟中被內源性還原酶系統還原為四氫姜黃素和六氫姜黃素[9-11]。與姜黃素不同,四氫姜黃素在各種pH值的鹽水和磷酸鹽緩沖液中具有穩(wěn)定性[12]。與姜黃素相比,四氫姜黃素因其較好的化學穩(wěn)定性和生物利用度,以及與姜黃素的結構高度相似,成為開發(fā)癌癥預防和治療藥物的有價值的先導化合物[13]。

網絡藥理學通過系統生物學、生物信息學和多方面藥理學等跨學科理論,揭示了疾病、基因、靶標和藥物之間的復雜網絡關系[14-15],能夠更加準確地找到藥物的治療靶點。網絡藥理學強調通過多途徑調控信號通路來改善藥物治療效果、減少毒副作用以提高新藥臨床試驗成功率、節(jié)約藥物研發(fā)費用等[16]。網絡藥理學已成為一種篩選治療靶標的快速、有效、經濟的方法[14]。本研究應用網絡藥理學的研究手段,在系統層次上,以生物網絡為總體視角,解析四氫姜黃素與肝細胞癌之間的分子關聯規(guī)律,分析預測藥物靶標機制,分子對接技術驗證成分與靶點的相互作用,為其后續(xù)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 收集和篩選與四氫姜黃素相關的靶點 本次實驗利用小分子結構的相似性來預測藥物分子的靶點,并且以文獻檢索進行補充,從而確定THC的作用機制。首先以“Tetrahydrocurcumin”為關鍵詞檢索并下載四氫姜黃素的3D化學結構,存儲為mol2格式并上傳至SwissTargetPrediction[17](http://www.swisstargetprediction.ch)中進行成分靶點預測,下載預測結果,下載完成后,針對所得到的結果進行篩選,以“概率”值大于0進行篩選。此外,通過探索PubMed數據庫(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)中以“Tetrahydrocurcumin”為關鍵字的文獻,補充了其他潛在的四氫姜黃素靶標。最終,經過UniProt數據庫(http://www.uniprot.org)的處理,所有的靶標名稱均已被轉化為基因符號。對所獲得的靶點進行綜合匯總,并進行去重處理。檢索時間自建庫至2022年10月。

1.2 收集和篩選與肝細胞癌相關的靶點 利用Genecards數據庫[18](https://www.genecards.org/)、OMIM數據庫[19](https://omim.org/),以關鍵詞“Hepatocellular carcinoma”進行檢索,在Genecards數據庫中,疾病靶點的篩選條件為相關性得分值≥2倍的中位數,合并去重后,獲取肝細胞癌疾病相關靶點。檢索時間自建庫至2022年12月。

1.3 四氫姜黃素與肝細胞癌共同靶點的篩選以及網絡模型的構建 利用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)[20]在線韋恩圖分析工具,將四氫姜黃素藥物靶點與肝細胞癌疾病靶點導入,繪制韋恩圖,以獲取共同的治療靶標,將交集靶點作為四氫姜黃素治療肝細胞癌的潛在靶點,并且采用Cytoscape 3.9.1軟件包,對整理獲得的四氫姜黃素、肝細胞癌等相關靶點信息建立網絡以及進行可視化處理,得到“四氫姜黃素-靶點-肝細胞癌”網絡。

1.4 靶蛋白互作PPI網絡的構建與核心靶點的篩選 將四氫姜黃素與肝細胞癌共同靶點導入String數據庫[21](https://www.string-db.org/),設置物種為Homo sapiens,其他參數保持默認,獲得其PPI網絡信息,將其導入Cytoscape3.9.1軟件[22],使用Centiscape插件[23]對其進行網絡拓撲分析,以度值(Degree)、中介中心性(Betweenness)和接近中心性(Closeness)作為參考值,選出疾病的核心靶點。

1.5 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析 將獲得的四氫姜黃素和肝細胞癌的核心靶點導入到Metascape (https://metascape.org)[24]在線富集分析平臺中,并將該物種設置為“Homo sapiens”,然后進行GO功能和KEGG通路富集分析,以獲得生物過程、細胞組分、分子功能和代謝途徑。對這些數據進行保存,并利用微生信在線可視化處理網站(http://www.bioinformatics.com.cn)進行可視化呈現。檢索時間自建庫至2023年3月。

1.6 通過分子對接技術對活性成分和核心靶點進行對接 將四氫姜黃素分子與篩選關鍵靶點進行半柔性分子對接和結合構象打分。在PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[25]和PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)[26]中,分別下載THC的2D結構sdf格式的文件和度值(Degree)較高的核心靶點蛋白的PDB格式文件,然后使用ChemBio3D軟件將活性成分sdf格式文件轉化為mol2格式文件,并進行能量最小化處理[27]。將以上文件一并導入Sybyl2.0軟件[28],以提取靶點蛋白中的配體小分子,并且進行去除水分子和加氫等處理,隨后進行分子對接,并利用打分函數進行評估。制作分子對接示意圖時,選擇高分結合構象的對接結果繪制。

2 結果

2.1 四氫姜黃素與肝細胞癌靶點篩選與交集靶點的獲取及網絡關系圖的構建 經過篩選,成功確定114個四氫姜黃素的作用靶點,同時發(fā)現2 361個與肝細胞癌相關的靶點。共有77個靶點是重疊于藥物作用和疾病相關的靶點。通過對數據進行分析和總結,建立重疊靶點的韋恩圖(見圖1)。77個交集靶點作為四氫姜黃素治療肝細胞癌的潛在靶點,對潛在靶點信息進行網絡構建以及可視化處理,其“四氫姜黃素-靶點-肝細胞癌”網絡如圖2所示。

圖1 四氫姜黃素和肝細胞癌靶點韋恩圖

圖2 四氫姜黃素-靶點-肝細胞癌網絡關系圖

2.2 靶蛋白互作PPI網絡的構建與核心靶點的篩選 通過將77個靶點蛋白信息上傳至STRING平臺并進行PPI網絡分析,獲得靶點蛋白之間的相互作用關系,并將其導入Cytoscape 3.9.1進行可視化處理,以節(jié)點表示靶點,以邊表示各靶點之間的相互作用關系。在去除2個孤立節(jié)點后,構建一個PPI網絡,其中包含了77個節(jié)點和767條相互作用連線。PPI網絡如圖3所示。利用Centiscape插件進行網絡拓撲學分析,以Degree、Betweenness和Closeness為篩選條件,篩選出16個核心靶點,這些靶點的相關拓撲參數見表1。隨著數值的增加,PPI網絡中該節(jié)點的重要性也增加,其在生物學功能方面的作用也可能隨之增強[29]。隨著面積的增大,Degree值也呈現出逐漸增大的趨勢(圖3)。

表1 四氫姜黃素與肝細胞癌核心靶點及拓撲參數

圖3 四氫姜黃素與肝細胞癌交集靶點蛋白互作PPI網絡構建

2.3 GO功能富集分析 GO功能富集分析的結果包括495條生物學過程(BP),19條細胞組分(CC)和39條分子功能(MF)。根據P值排序,隨著P值的增大和顏色的變紅,所代表的富集程度也隨之增加。分別挑選出排名前10的富集結果作為氣泡圖,由圖4可見,核心靶點所涉及到的與癌癥相關的生物學過程主要有酶聯受體蛋白信號通路(Enzyme-linked receptor protein signaling pathway)、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路(Transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway)、細胞對氧水平降低的反應(Cellular response to decreased oxygen levels)等,細胞組分主要涉及到膜閥(Membrane raft)、內吞囊泡(Endocytic vesicle)、RNA聚合酶Ⅱ轉錄調節(jié)復合物(RNA polymerase II transcription regulator complex)等,分子功能主要包括轉錄因子結合(Transcription factor binding)、核受體活性(Nuclear receptor activity)、蛋白激酶結合(Protein kinase binding)等。

圖4 四氫姜黃素與肝細胞癌核心靶點GO富集分析氣泡圖

2.4 KEGG通路富集分析 據KEGG通路富集分析結果所示,涉及核心靶點的通路數量高達97條。根據P值排序,隨著P值的增大和顏色的變紅,所代表的富集程度也增加,因此,需要對前30位進行篩選并繪制氣泡圖(見圖5)。涉及的信號通路中,癌癥的通路(Pathways in cancer)、化學致癌受體激活(Chemical carcinogenesis-receptor activation)、PI3K-AKT信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)等均與HCC相關,并且四氫姜黃素可能對前列腺癌(Prostate cancer)、乙型肝炎(Hepatitis B)、結直腸癌(Colorectal cancer)、乳腺癌(Breastcancer)等具有治療作用。

圖5 四氫姜黃素與肝細胞癌核心靶點KEGG富集分析氣泡圖

2.5 分子對接 為了驗證藥物和篩選的16個核心靶點的結合活性,我們通過分子對接技術對中藥成分和蛋白靶點進行對接驗證。將經過篩選的16個核心靶點與THC進行分子對接,以Total Score≥5的打分函數為閾值,結合自由能越小,配體與受體的結合越穩(wěn)定,Total Score值越大,表明活性成分與靶點蛋白的結合效果較好,Total Score>7則表明結合活性極強[30]。表2中呈現了分子對接的結果。根據實驗結果,四氫姜黃素成功地與16個核心靶點實現了精準對接。四氫姜黃素與PIK3CA、KDR、EGFR、MMP9、HSP90AA1、STAT3、PPARG、MTOR、AR均有強烈的結合活性,并且與AKT1、TP53、CASP3、MDM2、ESR1、HIF1A結合活性較好,與SRC的結合活性一般。PIK3CA靶點蛋白與四氫姜黃素的對接反應評分最高。分子對接示意圖見圖6。THC通過9個氫鍵嵌入在PIK3CA的TYR836、VAL851、SER854、ASP810等氨基酸殘基所形成的疏水性口袋中,結合活性強。

表2 四氫姜黃素與核心靶點分子對接評分

圖6 四氫姜黃素與PIK3CA分子對接示意圖

3 討論

20世紀90年代以來,中藥抗癌藥物逐漸成為抗腫瘤藥物研發(fā)的新方向[31]。2022年,Chen[32]等通過研究姜黃素治療HCC,證實了藥物通過AMPK/ULK1自噬通路對肝癌細胞產生影響。肝臟是體內能量代謝的主要場所,AMPK是能量代謝的主要傳感器。糖酵解是肝腫瘤細胞產生能量的基本過程。AMPK可以通過抑制糖酵解來治療HCC。實驗結果表明,姜黃素可以通過p53途徑促進細胞凋亡,并通過AMPK/ULK 1途徑促進自噬,從而降低肝癌細胞HepG 2的存活率,達到治療肝癌的目的[32]。研究表明,姜黃素口服生物利用度低,經歷廣泛的代謝后,血液中姜黃素濃度低,但其仍然具有抗癌作用,表明可能是姜黃素代謝物在體內仍有藥理作用[33-34]。四氫姜黃素作為體內主要的姜黃素代謝產物,具有較好的化學穩(wěn)定性和生物利用度以及與姜黃素的高度結構相似性。盡管四氫姜黃素缺乏α,β-不飽和羰基部分,但是其以不同的酮-烯醇形式和其他類似物方式存在[35],這些類似物可能是四氫姜黃素具有不同于姜黃素的功能和作用機制的原因之一。

本研究通過小分子結構相似性進行靶點預測,并結合文獻進行相關藥物靶點補充,找到16個四氫姜黃素治療肝細胞癌的潛在核心作用靶點,包括AKT1、CASP3、MDM2、KDR、PIK3CA、STAT3、TP53、EGFR等。經過GO富集分析和KEGG信號通路富集分析,結果表明,這些靶點主要分布于轉錄調節(jié)復合物、膜閥、內吞囊泡等部位,并且具有與轉錄因子結合、蛋白質結構域特異性結合、蛋白激酶結合等功能,參與細胞對化學壓力的反應、細胞對有機氮化合物的反應及細胞對氧含量降低的反應等多種生理過程,參與調控PI3K-AKT信號通路,參與在癌癥中PD-L1的表達以及PD-1檢查點信號通路、HIF-1等信號通路,這些均表明,THC可作用于多個靶點和通路,以達到抑制HCC的效果。THC與多個核心靶點蛋白的分子對接結果呈現出較高的結合力和結合活性,驗證了此結論。血管內皮生長因子是介導腫瘤血管生成的主要物質[36],KDR所編碼的蛋白是血管內皮生長因子受體-2(Vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2)[37]。研究表明,在植入肝癌細胞系HepG2異種移植瘤的BALB/c-裸鼠中,每天口服3 000 mg/kg四氫姜黃素,可顯著降低腫瘤組織內的毛細血管密度[38]。在分子水平上,四氫姜黃素觸發(fā)線粒體依賴性級聯反應,p53上調并降低MDM2以誘導細胞凋亡[39]。分子對接結果也同樣顯示,四氫姜黃素能與KDR、TP53以及MDM2靶點蛋白穩(wěn)定結合。

本研究采用網絡藥理學方法,對四氫姜黃素進行了潛在的靶點預測和信號通路分析,從多角度探討其在預防和治療肝細胞癌方面的潛在作用機制。利用分子對接技術,驗證了藥物成分與各核心靶點的結合活性。目前,四氫姜黃素治療肝細胞癌的相關研究報道很少,本研究主要通過生物信息學分析方法對四氫姜黃素在肝細胞癌腫瘤細胞中表達情況及信號轉導途徑進行深入預測,為繼續(xù)研究四氫姜黃素抗肝細胞癌作用的潛在靶點提供了理論參考,同時為現代分子生物學技術驗證四氫姜黃素對抗肝細胞癌的作用及分子機制提供了依據,有助于深入了解四氫姜黃素抗肝細胞癌作用的分子機制,從而為臨床肝細胞癌治療提供參考。