曹 靜，劉海波，安 琪，韓 楓

連云港市東方醫(yī)院皮膚科，江蘇 連云港222042

放射性皮炎是放療最常見的副作用之一，在接受放療的患者中，多達95%患者可能會經(jīng)歷某種形式的放射性皮炎或放射線引起的皮膚損傷［1］。在放射性皮炎的各個階段，均可能出現(xiàn)不同程度的疼痛癥狀［2,3］。因其疼痛的發(fā)病機制復(fù)雜，放射性皮炎引起的病理性疼痛一直是治療的難點之一。目前臨床上以對癥治療為主，常用的藥物包括阿片類鎮(zhèn)痛藥、局麻藥、非甾體類抗炎藥等，但療效均不理想［4］。

二甲雙胍因其降糖效果良好且不良反應(yīng)少，已成為臨床上治療2型糖尿病最廣泛使用的降糖藥之一［5］。近年來，二甲雙胍降糖以外的作用逐漸被重視，二甲雙胍還具有多種藥理特性，包括抗炎、抗癌、抗氧化、鎮(zhèn)痛等作用［6-11］。在接受放療的小鼠脊髓組織中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥性細(xì)胞因子的表達增加［7］。同時有文獻報道，這些炎性細(xì)胞因子的釋放又可誘導(dǎo)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中p38MAPK的磷酸化［12］。p38MAPK的磷酸化可促使NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位及下游信號通路的激活，導(dǎo)致病理性疼痛的發(fā)生［10］。有研究表明，二甲雙胍通過抑制脊髓p38 MAPK磷酸化、降低促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達，增強嗎啡的鎮(zhèn)痛效果［13］。二甲雙胍亦可抑制脊髓組織中IL-1β、IL-6等炎癥因子的釋放緩解坐骨神經(jīng)結(jié)扎誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛［5］。然而，目前尚未見二甲雙胍對放射性皮炎引起的病理性疼痛作用效果的相關(guān)報道。二甲雙胍能否通過抑制p38 MAPK磷酸化，下調(diào)NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位，進而降低相關(guān)炎癥因子的表達而緩解放射性皮炎的病理性疼痛尚不明確。

本研究擬通過評價二甲雙胍對放射性皮炎小鼠病理性疼痛的治療作用，觀察其對脊髓L4～L6節(jié)段中p38MAPK、NF-κB p65 蛋白表達的影響，對脊髓L4～L6節(jié)段炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平的影響，探討二甲雙胍對放射性皮炎的鎮(zhèn)痛的作用及其可能的機制，為臨床研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器及試劑 照射儀器：瓦里安600C電子直線加速器（美國瓦里安），von Frey痛閾測試包（上海玉研科學(xué)儀器有限公司），輻射熱測試儀（IITC Life Science），BIO-RAD Powerpac HC 電泳儀（BIO-RAD），二甲雙胍（MCE），加巴噴丁（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20030662，規(guī)格：0.1 g），水合氯醛（北京雷根生物技術(shù)有限公司），SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL發(fā)光法試劑盒、封閉液、IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），兔單克隆抗體NF-κB p65、兔單克隆抗體p38MAPK、磷酸化兔單克隆抗體pp38MAPK、磷酸化兔單克隆抗體p-NF-κB p65、鼠單克隆抗體GAPDH、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠二抗（Abcam）。

1.1.2 實驗動物 6～8周齡健康雄性ICR小鼠，SPF級，32只，體質(zhì)量18～22 g，由南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實驗動物中心提供，動物許可證號：SYXK（蘇）2015-0015，動物合格證書編號：NYD-L-2019-029。動物飼養(yǎng)于室溫23±2 ℃、相對濕度（50±5）%，水、食自由攝取，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，整個實驗操作過程嚴(yán)格遵守《中華人民共和國實驗動物管理條例》和《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的相關(guān)規(guī)定，并經(jīng)連云港市東方醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號：2022-035-01）。

1.2 方法

1.2.1 分組處理及放射性皮炎模型的制備 將32只小鼠隨機分為正常對照組（Control組）、放射性皮炎模型組（Model組）及二甲雙胍干預(yù)組（Met組），陽性藥物加巴噴丁組（GBP組），8只/組。除Control組外，其余小鼠采用直線加速器照射的方式于右后足皮膚處建立放射性皮炎模型。放射前對小鼠進行麻醉，將小鼠俯臥位固定于小鼠固定板上，右后足輕輕伸展，并用醫(yī)用膠帶粘貼。除右后足外，其余小鼠身體用鉛盒覆蓋，鉛盒壁厚為2 cm，以保護全身免受輻射。采用直線加速器以6 mV X 射線，源皮距100 cm處照射大鼠右后足皮膚，射野為2.5 cm×20 cm的矩形野，單次劑量為30 Gy，建立急性放射性皮炎模型［12,13］。對Met組小鼠每天8:00進行腹腔內(nèi)注射二甲雙胍200 mg/(kg·d)［11］，連續(xù)給藥16 d。陽性藥物組每天8:00予以加巴噴丁100 mg/(kg·d)灌胃，連續(xù)灌胃16 d。對Control組及Mode組小鼠腹腔內(nèi)注射與二甲雙胍等體積生理鹽水，持續(xù)16 d。

1.2.2 小鼠放射性皮炎分級 參考人類急性放射反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)（RTOG/EORTC），將小鼠放射性皮炎分為0～5級：0級為無變化；1級為出現(xiàn)點、片狀紅斑和干性脫皮；2級為出現(xiàn)明顯面積紅斑、少量濕性脫皮、輕度水腫；3級為中度以上水腫，大面積的濕性脫皮；4級為大面積皮膚潰瘍、出血、壞死；5級為因放射性皮炎死亡。末次給藥后，觀察并記錄小鼠的一般情況及皮膚改變情況。

1.2.3 疼痛行為學(xué)測定 分別于建模前1 d（0 d）及建模后第1、4、8、12、16天，每天15:00進行疼痛行為學(xué)檢測，環(huán)境安靜舒適，室溫保持23±2 ℃，通風(fēng)良好。檢測前先將小鼠放置在檢測室內(nèi)適應(yīng)30 min，依次測定MWT及TWL，間隔時間為1 h。所有檢測由同一檢測人員完成。

采用Von Frey法測定MWT:在上述環(huán)境中將小鼠單獨放置于帶金屬網(wǎng)底的透明玻璃罩內(nèi)，待小鼠安靜30 min 后用不同標(biāo)號的Von Frey 絲垂直刺激右后足底。記錄產(chǎn)生快速縮足、抬足、抖動或舔舐反應(yīng)時所對應(yīng)的Von Frey絲標(biāo)號。每種標(biāo)號的Von Frey絲均被測定至少出現(xiàn)3次陽性反應(yīng)或3次無反應(yīng)，每次刺激均間隔至少15 s。逐漸增加或降低刺激強度至同一標(biāo)號Von Frey絲出現(xiàn)至少3次陽性反應(yīng)，記錄此時所用的Von Frey絲的標(biāo)號作為MWT［5,14］。

TWL的測定：在上述環(huán)境中將小鼠單獨放置于透明有機玻璃籠內(nèi)，待小鼠適應(yīng)30 min后用輻射熱測試儀照射小鼠右后足足底，當(dāng)產(chǎn)生快速縮足、揚足或舔足反應(yīng)時立即停止照射，并記錄下此時照射的持續(xù)時間，自動切斷時間為30 s。重復(fù)測量5次，每次間隔5 min，將5次的持續(xù)照射時間取平均值作為TWL［5,14］。

1.2.4 法檢測L4～L6脊髓組織蛋白質(zhì)表達 末次行為學(xué)檢測結(jié)束后，深度麻醉小鼠，分離并取出小鼠L4～L6脊髓組織，加入預(yù)冷的蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑，冰上剪碎脊髓后，超聲進一步打碎，冰上靜置30 min 后，4 ℃15 000 r/min 離心20 min后取其上清。樣品的蛋白質(zhì)濃度用BCA蛋白分析試劑盒進行檢測。加入loading buffer，100 ℃煮樣5 min。用SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)樣品，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，封閉液室溫封閉2 h。加入p38MAPK、NF-κB p65、pp38MAPK、p-NF-κB p65一抗（濃度均為1∶1000）4 ℃孵育過夜。一抗孵育之后，TBST緩沖液洗膜3 次，每次15 min，加入二抗（兔抗，濃度1∶2000）室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，15 min/次。GAPDH作為內(nèi)參對照。目的蛋白與內(nèi)參灰度值之比表示目的蛋白的表達水平。ECL化學(xué)發(fā)光試劑對蛋白質(zhì)進行可視化處理，Image J軟件分析蛋白條帶，測定灰度值。

1.2.5 ELISA檢測小鼠L4～L6脊髓組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量 末次行為學(xué)檢測結(jié)束后，給予過量水合氯醛深度麻醉小鼠，分離并取出小鼠L4～L6脊髓組織，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS；0.01 mol/L，pH=7.4）沖洗L4～L6脊髓組織，冰上剪碎后，超聲進一步打碎，在4 ℃條件下2500 r/min離心15 min，取上清。采用酶聯(lián)免疫法，使用ELISA 試劑盒檢測脊髓組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。行為學(xué)數(shù)據(jù)資料、免疫印跡數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析，等級資料進行秩和檢驗，進一步用秩變換分析方法進行組間比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠放射性皮炎分級比較

Control 組小鼠右后足皮膚及毛發(fā)未見異常。Model組及GBP組小鼠右后足大面積皮膚潰瘍，滲出明顯，部分足趾末端壞死脫落，皮膚反應(yīng)在3～4級，以4級反應(yīng)為主；Met組小鼠右后足皮膚出現(xiàn)片狀紅斑，部分出現(xiàn)輕度水腫，皮膚反應(yīng)在1～3級，以1級為主（圖1）。各組小鼠放射性皮炎的總體分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=44.00,P<0.001）；組間比較顯示，Control 組與Model 組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），GBP 組與Model組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），Met與Model組及GBP組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，表1）。

表1 各組小鼠放射性皮炎分級（例）Tab.1 Grading of radiation dermatitis in mice of each group(sample,n=8)

2.2 各組小鼠右后足MWT和TWL比較

實驗過程中，Control組每個時間檢時間點的MWT和TWL均無顯著變化。放射性皮炎模型制備成功后，Model組、Met組及GBP組小鼠的MWT和TWL均明顯低于Control組（P<0.05）。Met組在建模后1 d與Model組比較MWT無明顯差異（P>0.05），TWL有明顯差異（P<0.01）。在治療后4～16 d，Met組小鼠右后足MWT和TWL 均明顯高于Model 組（P<0.01），Met 組及GBP 組相比，MWT和TWL差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖2）。

圖2 各組小鼠右后足MWT和TWL比較Fig.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold(MWT)and thermal withdrawal threshold(TWL)of the right hind foot in each group(Mean±SE,n=8).*P<0.05,**P<0.01 vs Control group;##P<0.01 vs Model group.

2.3 各組小鼠L4～L6段脊髓組織中p-p38MAPK 和p-NF-κB p65蛋白表達的比較

Western blot 結(jié)果顯示，與Control組比較，Model組小鼠L4～L6段脊髓組織中p-p38MAPK 及p-NF-κB p65蛋白表達明顯增高（P<0.01）；經(jīng)Met治療16 d后，Met組小鼠L4～L6段脊髓組織中p-p38MAPK及p-NFκB p65 蛋白表達明顯低于Model組（P<0.01）；GBP組與Met組相比，p-NF-κB p65蛋白表達增高（P<0.05），pp38MAPK蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖3）。

圖3 各組小鼠L4～L6段脊髓組中p-p38MAPK、p-NF-κB p65蛋白表達情況Fig.3 Expression of p-p38MAPK and p-NF-κB p65 protein in L4-L6 spinal cord in each group(Mean±SD,n=4).A:Western blots of p-p38MAPK and p38MAPK.B:Relative expression level of p-p38MAPK.C:Western blots of p-NF-κB p65 and NF-κB p65.D: Relative expression level of p-NF-κB p65.**P<0.01 vs Control group;##P<0.01 vs Model group;◆P<0.05 vs Met group.

2.4 各組小鼠L4～L6段脊髓組織中IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平比較

與Control 組相比，Model 組小鼠L4～L6段脊髓組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α的表達水平明顯升高（P<0.01）；經(jīng)二甲雙胍治療16 d后，IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平均明顯低于Model組（P<0.01)；GBP組與Met組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，圖4）。

圖4 各組小鼠L4～L6段脊髓組織中IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平比較Fig.4 IL-1β(A),IL-6(B)and TNF-α(C)expression levels in the L4-L6 spinal cord in each group(Mean±SD,n=4).**P<0.01 vs Control group;##P<0.01 vs Model group;◆◆P<0.01 vs Met group.

3 討論

現(xiàn)代放療中使用的高能X射線會產(chǎn)生直接和間接電離事件，在殺傷癌細(xì)胞同時也會損傷正常組織，放射性皮炎是放射治療最常見的副作用之一［15］。研究發(fā)現(xiàn)，在放射治療期間，會產(chǎn)生一些炎癥性細(xì)胞因子的表達增加，這些細(xì)胞因子包括IL-1β、IL-6、TNF-α等［16］。這些炎性細(xì)胞因子可引起神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中p38 MAPK的磷酸化，并促進神經(jīng)性和炎性疼痛的發(fā)生［17］。本實驗結(jié)果表明，放射性皮炎模型組小鼠L4～L6脊髓組織中IL-1β、、IL-6和TNF-α水平顯著高于正常對照組，模型組的p38MAPK磷酸化水平明顯升高。同時，模型組小鼠MWT和TWL均明顯降低，疼痛癥狀加重。結(jié)合上述研究提示，放射性皮炎引起的病理性疼痛可能與放射引起的IL-1β、IL-6和TNF-α表達增加及p38MAPK的磷酸化相關(guān)。

絲裂酶原活化蛋白激酶(MAPKs)級聯(lián)反應(yīng)通路是重要的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，p38MAPK 是MAPK 家族的成員之一,參與多種生理過程的調(diào)節(jié)，近年來研究發(fā)現(xiàn)，與神經(jīng)病理性疼痛有關(guān)的多條信號通路匯集于p38MAPK，其在痛覺信號傳導(dǎo)方面發(fā)揮重要作用［18］。p38MAPK可被一系列刺激因子激活,如炎癥細(xì)胞因子和生長因子等［19,20］。磷酸化激活的p38 MAPK又可進一步導(dǎo)致促炎因子如IL-1β、TNF-α等的產(chǎn)生［21］。有研究報道，在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠中，p38 MAPK信號通路的激活以及炎癥因子的釋放增多可加劇疼痛癥狀［21,22］。鞘內(nèi)注射p38抑制劑SB203580可減輕神經(jīng)痛模型中的疼痛癥狀［17］。既往研究發(fā)現(xiàn),p38 MAPK可以調(diào)節(jié)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。p38MAPK的激活導(dǎo)致NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位和下游信號通路的激活，導(dǎo)致疼痛的發(fā)生［23］。NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，由p50和p65兩種不同的亞單位構(gòu)成，平時存在于神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，處于非活性狀態(tài)，受多種因素刺激活化后，NF-κB p65可發(fā)生磷酸化，轉(zhuǎn)位入核，參與調(diào)節(jié)多種靶基因，激活其下游的炎癥因子信號通路，參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生與維持。研究顯示CCI模型中背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)的NF-κB表達增加，而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的NF-κB 的表達，則可減輕坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷導(dǎo)致的疼痛［23］。鞘內(nèi)注射NF-κB抑制劑脯氨酸二硫氨甲酸酯能夠顯著緩解脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛［24］。NF-κB活化后，增強了TNF-α和IL-1β的轉(zhuǎn)錄，TNF-α和IL-1β釋放增多，進而再次激活NF-κB，NF-κB活化后又可使IL-6合成和釋放增多，產(chǎn)生惡性循環(huán)，加劇痛覺敏化［25］。促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α與神經(jīng)病理性疼痛關(guān)系密切，是與疼痛敏化最為密切的炎癥因子。有研究表明，神經(jīng)損傷后，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-1β、IL-6和TNF-α等，誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生［26］。本實驗結(jié)果顯示，放射后16 d模型組小鼠L4～L6脊髓組織中p-p38MAPK和p-NF-κB p65蛋白水平升高，伴隨著造模小鼠右后足疼痛癥狀加重，結(jié)合上述報道，提示本研究中放射性皮炎所引起的病理性疼痛可能與p38 MAPK/NF-κB信號通路的活化密切相關(guān)。且促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放增多參與了疼痛的產(chǎn)生及維持。

二甲雙胍是臨床中廣泛應(yīng)用的口服雙胍類降糖藥物，具有良好的降糖效果。有研究報道，二甲雙胍還具有神經(jīng)保護和抗炎作用，可減輕神經(jīng)性病理性疼痛和痛覺過敏［27］。二甲雙胍可抑制脊髓p38 MAPK磷酸化上調(diào)、NF-κB核轉(zhuǎn)位和促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達，增強嗎啡的鎮(zhèn)痛效果［28］。本研究中，經(jīng)放射的小鼠給予二甲雙胍治療后，治療組小鼠L4～L6脊髓組織中p-p38MAPK和p-NF-κB p65蛋白表達水平均顯著低于放射性皮炎模型組，IL-1β、IL-6和TNF-α促炎細(xì)胞因子水平亦明顯低于模型組，同時MWT和TWL均明顯降低，疼痛癥狀減輕。提示二甲雙胍發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，可能是通過抑制p38 MAPK/NF-κB信號通路活化及減少IL-1β、IL-6和TNF-α的表達實現(xiàn)的。

綜上所述，二甲雙胍可緩解小鼠放射性皮炎引起的病理性疼痛，且該作用可能是通過抑制p38 MAPK/NF-κB信號通路活化，降低促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平實現(xiàn)的。這為臨床治療放射性皮炎引起的病理性疼痛提供了新思路。