周海深，楊利博，謝 詩(shī)，楊家明，張家慶

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院胸外科，廣東 廣州510280

冠心病是導(dǎo)致人類死亡的首要病因［1］，我國(guó)患者冠心病的發(fā)病率也越來(lái)越高［2,3］。20%～50%的大隱靜脈（SV）橋血管在術(shù)后30 d～2年內(nèi)出現(xiàn)狹窄或完全堵塞，晚期，約有40%的SV 橋會(huì)在10 年時(shí)完全堵塞，剩余未完全堵塞的血管尚有30%出現(xiàn)了不同程度的狹窄，供血受影響［4,5］。冠狀動(dòng)脈旁路移植手術(shù)的靜脈橋血管再狹窄機(jī)制涉及眾多的因素［1,6,7］。移植靜脈血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的增殖是再狹窄發(fā)生的病理改變之一［7］。但是冠狀動(dòng)脈旁路移植手術(shù)（CABG）后的橋血管無(wú)論通暢情況如何，均不會(huì)再取出。只有在患者死亡后器官捐獻(xiàn)或心臟疾病進(jìn)入終末期，行心臟移植手術(shù)后才能獲得靜脈橋血管的標(biāo)本。由于時(shí)效性的因素，尸檢標(biāo)本的核酸降解嚴(yán)重，難以進(jìn)行基因檢測(cè)。所以關(guān)于靜脈橋血管基因方面的研究較少，較多的研究集中于終末期的心臟疾?。?,9］或心肌病方面的研究［10］。建立模擬冠脈旁路移植橋血管的動(dòng)物模型是探索靜脈橋血管增殖基因的途徑之一［11-13］。莊建、張曉慎［12］教授使用豬的乳內(nèi)靜脈作為搭橋血管移植至冠脈上，構(gòu)建了冠脈旁路移植手術(shù)模型，觀察到了靜脈橋血管的增殖。藍(lán)斌教授［14］將兔的勁動(dòng)脈吻合至頸靜脈上，然后結(jié)扎雙側(cè)頸靜脈，發(fā)現(xiàn)靜脈血管有增殖改變。但上述動(dòng)物模型的研究中未進(jìn)一步進(jìn)行基因水平的研究。

本團(tuán)隊(duì)前期構(gòu)建了兔的腹主動(dòng)脈置換手術(shù)的動(dòng)脈模型［15,16］，證明了：利用兔的腹主動(dòng)脈置換可以模擬冠脈旁路移植手術(shù)橋血管的血流動(dòng)力學(xué)改變，血流量與冠脈旁路移植手術(shù)后橋血管的血流量相當(dāng)，研究的關(guān)注點(diǎn)是等離子體磺酸化絲素蛋白膜復(fù)合小口徑血管的通暢率，沒(méi)有進(jìn)行小口徑自體血管再狹窄方面的基因研究。另外本團(tuán)隊(duì)在研究中發(fā)現(xiàn)［15,16］：模型構(gòu)建中腹腔操作部分損傷較大，容易出現(xiàn)術(shù)后兔死亡。本研究將兔的左側(cè)頸外靜脈移植至左頸動(dòng)脈上，構(gòu)建了冠脈旁路移植手術(shù)橋血管的動(dòng)物模型，成功模擬出橋血管增殖的病理改變。由于增殖的靜脈橋血管難以獲得，動(dòng)物模型構(gòu)建的技術(shù)難度較高，目前關(guān)于冠狀動(dòng)脈旁路移植手術(shù)靜脈橋血管再狹窄相關(guān)基因的研究較少［17］，模型常選擇鼠，但血流參數(shù)與人CABG差別較大。本團(tuán)隊(duì)［15,16］前期的研究中使用兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物構(gòu)建了小口徑血管的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，發(fā)現(xiàn)：兔的腹主動(dòng)脈或頸動(dòng)脈直徑與人冠狀動(dòng)脈直徑相當(dāng)，血流量，波動(dòng)指數(shù)相近，使用兔實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行的研究有更大的可能在人類中重復(fù)。為了明確本動(dòng)物模型能否在病理層面模擬SV橋血管再狹窄的改變，本團(tuán)隊(duì)利用連續(xù)縫合的方法將兔頸外靜脈移植至頸動(dòng)脈上，模擬出了靜脈橋血管的增殖改變，如血管平滑肌細(xì)胞增生，類型由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?，?xì)胞外基質(zhì)分泌增加。篩查出引起靜脈橋血管再狹窄的相關(guān)基因，為進(jìn)一步研究靜脈橋血管增殖提供研究方向。

1 材料和方法

1.1 兔頸外靜脈-頸動(dòng)脈血管移植模型構(gòu)建

選取40只清潔SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)用新西蘭兔，采購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量為2.0～2.5 kg，雌性。實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究委員會(huì)審批（LAEC-2021-165）。隨機(jī)數(shù)法將40只實(shí)驗(yàn)用新西蘭兔分為實(shí)驗(yàn)組（A組）、對(duì)照組（B組），A、B兩組再分別分為2周組和4周組，每組各10只。使用3%戊巴比妥鈉（上海新亞藥業(yè)有限公司）經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉，劑量為30 mg/kg，頸部皮膚剃毛，消毒，于左側(cè)頸部氣管旁切開(kāi)皮膚約5 cm，顯露左側(cè)頸外靜脈，長(zhǎng)度約4 cm，結(jié)扎分支，千分尺測(cè)量血管直徑。剪取頸外靜脈血管約3 cm，置于鹽酸罌粟堿溶液（山東北大高科華泰制藥有限公司）中備用。分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，長(zhǎng)度約3 cm，中部橫斷，取出備好的頸外靜脈血管，使用6-0不可吸收尼龍縫合線進(jìn)行連續(xù)端端縫合。吻合完畢后使用千分尺測(cè)量移植血管外徑，測(cè)量3次取平均值。最后間斷縫合兔頸部肌肉及皮膚。術(shù)后予青霉素注射液（30 U/kg）（太極西南藥業(yè)股份有限公司）肌肉注射預(yù)防感染。

實(shí)驗(yàn)組（A組）及對(duì)照組（B組）于術(shù)后第2周、第4周取出靜脈橋血管，使用HE 的組織病理學(xué)染色方法，低倍顯微鏡下觀察靜脈橋血管組織切片，測(cè)量?jī)?nèi)膜及中膜厚度。

1.2 組織標(biāo)本RNA-seq分析

取術(shù)后4周兔靜脈橋血管標(biāo)本及對(duì)照組血管標(biāo)本各10只，進(jìn)行RNA-seq分析（廣州基迪奧生物科技有限公司），從而獲取實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異基因，再對(duì)差異基因進(jìn)行富集分析。根據(jù)各個(gè)樣本表達(dá)量的水平，使用PCA分析，評(píng)估樣本間重復(fù)情況并對(duì)差異較大樣本進(jìn)行排除。差異表達(dá)分析的結(jié)果是基因表達(dá)水平檢測(cè)中得到的reads count值，使用DESeq2軟件分析。之后進(jìn)行互作網(wǎng)絡(luò)分析：應(yīng)用STRING蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)（http://string-db.org)對(duì)差異基因蛋白進(jìn)行相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。選定物種為兔，再導(dǎo)入分析后的差異基因，最后使用cytoscape構(gòu)建互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行分析。其中計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式來(lái)表示。各個(gè)標(biāo)本組間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，配對(duì)樣本使用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較應(yīng)用方差分析處理結(jié)果。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⑶闆r：對(duì)40只實(shí)驗(yàn)用新西蘭兔進(jìn)行頸外靜脈-頸動(dòng)脈血管搭橋手術(shù)，模型建立成功28只，12只失敗。其中3只實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后10 d內(nèi)死亡，進(jìn)行尸體解剖后考慮感染。8只術(shù)后取材時(shí)發(fā)現(xiàn)橋血管阻塞不通。1只行超聲檢查操作后死亡，考慮實(shí)驗(yàn)兔受到驚嚇?biāo)?。其余?shí)驗(yàn)兔模型均建立成功，至取材前術(shù)區(qū)無(wú)明顯感染跡象，取材時(shí)血管通暢。后續(xù)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)新西蘭兔12只，再次建立頸外靜脈-頸動(dòng)脈血管搭橋模型，并定期予以抗生素抗感染，模型建立成功（圖1）。

圖1 血管搭橋動(dòng)物模型Fig.1 Animal model of vessel bypass.A:Left carotid artery of a rabbit.B:Left external jugular vein of a rabbit.C:External jugular vein-carotid anastomosis.

2.2 實(shí)驗(yàn)兔移植頸外靜脈術(shù)前術(shù)后直徑對(duì)比

手術(shù)前后測(cè)定頸外靜脈血管直徑變化，術(shù)前兔頸外靜脈直徑4.29±0.58 mm，術(shù)后即時(shí)測(cè)量的血管直徑增大至5.32±0.65 mm，直徑增加長(zhǎng)度為1.04 mm，程度增加約24.2%。兩組數(shù)據(jù)對(duì)比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 組織學(xué)觀察結(jié)果

對(duì)照組頸外靜脈血管管壁較薄，內(nèi)膜完整、管腔通暢，未見(jiàn)增厚。術(shù)后2周組，可見(jiàn)移植后橋靜脈血管內(nèi)膜增生明顯，內(nèi)皮細(xì)胞損傷修復(fù)、排列紊亂、部分平滑肌細(xì)胞；中膜可見(jiàn)大量平滑肌細(xì)胞增殖。術(shù)后4周組可見(jiàn)血管壁不均勻增厚，內(nèi)膜損傷及修復(fù)明顯，中膜明顯增厚，平滑肌細(xì)胞遷移至內(nèi)膜層。術(shù)后2周靜脈橋血管明顯增厚，術(shù)后4周靜脈橋血管增厚更加明顯（圖2）。各組數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1，P<0.05）。

表1 正常靜脈及術(shù)后橋血管管壁厚度Tab.1 Vascular wall thickness in normal jugular vein and venous grafts(Mean±SD)

圖2 靜脈血管內(nèi)膜Fig.2 Intima-media thickness of the engrafted vein(Original magnification:×100).A:Control group.B,C:Engrafted vein at 2 and 4 weeks after the operation,respectively.

2.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）結(jié)果

2.4.1 組間差異基因整體統(tǒng)計(jì)結(jié)果 將對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行差異對(duì)比分析，以豐度超過(guò)2倍為準(zhǔn)，共2191個(gè)，其中上調(diào)基因共1583個(gè)，下調(diào)基因608個(gè)。

2.4.2 差異比較火山圖 根據(jù)各比較組的顯著差異基因，我們進(jìn)行火山圖分析。越靠近兩端的基因，差異程度越大（圖3）。橫坐標(biāo)表示兩個(gè)分組間的差異倍數(shù)對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)表示兩個(gè)分組差異的FDR的負(fù)Log10值，紅色（表達(dá)量上調(diào)）和藍(lán)色（表達(dá)量下調(diào)）的點(diǎn)表示基因的表達(dá)量有差異，黑色表示沒(méi)有差異。

圖3 差異比較火山圖Fig.3 Volcano map of the differentially expressed genes between the two groups.

2.4.3 相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 根據(jù)顯著性P值對(duì)富集后差異基因進(jìn)行排序，選出實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差基因差異最大的前500個(gè)基因通過(guò)String基因庫(kù)進(jìn)行相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，由于基因總數(shù)過(guò)多，故在String系統(tǒng)中設(shè)置可信度為高（High confidence 0.700），得到相互作用網(wǎng)絡(luò)分析圖如下，其中處于中心位置且與其他基因間相互作用較廣泛的前20 個(gè)基因分別為：CD4、CD2、TLR2、CTSS、

PTPRC、IL2RG、SKY、LAT、ITK、PK3CD、BTK、CD28、ZAP70、CD19、MYH3、MYL2、ACTC1、PTPN8、PTPN22、CD86（圖4）。然后進(jìn)一步提高置信度為最高（Highest confidence 0.900），進(jìn)一步篩選出仍處于中心位置的10 個(gè)Hub 基因，為CD4、ZAP70、SYK、CD28、PIK3CD、CXCR4、CCR5、ITK、CCL5、BTK（圖5）。

圖4 互作網(wǎng)絡(luò)分析圖Fig.4 Interaction network analysis diagram.

圖5 互作網(wǎng)絡(luò)分析圖（前10基因）Fig.5 Interaction network analysis of the top 10 genes.

3 討論

目前自體靜脈移植動(dòng)物模型中，最常用的動(dòng)物為小鼠、大鼠及兔［11,14,15,18］等，大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物價(jià)格昂貴，飼養(yǎng)及手術(shù)所需條件高。常選擇小鼠、大鼠和兔作為實(shí)驗(yàn)建模對(duì)象，且這幾種動(dòng)物的基因組與人類均有較高的同源性，兔體型相對(duì)較大，在靜脈移植手術(shù)過(guò)程中血管吻合難度稍低，故本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型選用兔。我們將兔頸外靜脈移植至同側(cè)頸總動(dòng)脈，吻合方式選擇端端吻合。本團(tuán)隊(duì)前期研究證明了［15,16］：兔腹主動(dòng)脈的血流量和直徑和冠脈旁路移植手術(shù)的橋血管的流量相當(dāng)，但模型構(gòu)建的成功率低，故將動(dòng)物模型進(jìn)一步改進(jìn)，將兔的頸外靜脈移植至頸動(dòng)脈上。在血管移植手術(shù)前后我們對(duì)移植靜脈血管直徑進(jìn)行測(cè)量，發(fā)現(xiàn)移植后靜脈血管在動(dòng)脈血壓下作用下，直徑拉伸延長(zhǎng)20%～30%。在模型中發(fā)現(xiàn)：血管平滑肌細(xì)胞可由本身較穩(wěn)定的收縮型，轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚停铣尚推交〖?xì)胞的增殖遷移能力較強(qiáng)，同時(shí)分泌細(xì)胞外基質(zhì)，造成血管內(nèi)膜增厚。術(shù)后2周及4周時(shí)，我們分別取出移植靜脈橋血管，HE染色后進(jìn)行病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)術(shù)后2周時(shí)實(shí)驗(yàn)兔移植頸外靜脈血管內(nèi)膜發(fā)生增厚，術(shù)后第4周取材后觀察，可見(jiàn)移植靜脈橋血管內(nèi)膜明顯較對(duì)照組增厚，表明在術(shù)后2～4周，移植靜脈橋血管內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞逐步增殖，引起血管內(nèi)膜增厚。

移植靜脈血管發(fā)生狹窄的機(jī)制復(fù)雜［19］，但疾病的發(fā)生和發(fā)展，均與遺傳物質(zhì)的表達(dá)相關(guān)，本研究通過(guò)GO及KEEG對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行富集分析，進(jìn)一步獲取疾病相關(guān)基因的具體信息及相關(guān)通路等［9,20,21］。我們對(duì)實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后28 d的移植靜脈橋血管與對(duì)照組正常頸外靜脈血管進(jìn)行高通量測(cè)序分析，并對(duì)獲取的遺傳物質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選排除，發(fā)現(xiàn)兩組間具有差異的基因共計(jì)2191個(gè)，其中上調(diào)基因1583個(gè)，下調(diào)基因608個(gè)。其中可能存在眾多基因的表達(dá)與移植靜脈橋血管內(nèi)膜的增生有關(guān)。我們經(jīng)過(guò)GO及KEEG對(duì)所有差異基因進(jìn)行富集分析，最終發(fā)現(xiàn)富集前20的term中存在部分已知與血管內(nèi)膜增殖有明確關(guān)系，如趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞黏附分子相關(guān)通路、血小板激活、鈣離子結(jié)合、GTPpase調(diào)節(jié)活性等。

我們將篩選出的前20個(gè)核心基因再進(jìn)行高置信度篩選，尋找出仍處于核心位置的10個(gè)基因。這些基因有較大的可能是引起橋血管再狹窄的核心基因。對(duì)篩選的基因進(jìn)一步分析，我們發(fā)現(xiàn)：其中的2個(gè)基因，脾相關(guān)酪氨酸激酶（SYK）和ZAP70（Zeta鏈的T細(xì)胞受體相關(guān)蛋白激酶70）兩個(gè)基因處于核心位置的前列。SYK基因可介導(dǎo)多種跨膜受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，比如B細(xì)胞受體，并且可對(duì)破骨細(xì)胞的成熟、細(xì)胞黏附、血小板的激活以及血管發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié)［22,23］。它還可參與有纖維蛋白原介導(dǎo)激活的血小板黏附過(guò)程等［24］。在靜脈橋血管內(nèi)膜增生的進(jìn)程中，SYK可能通過(guò)炎癥、細(xì)胞黏附、血小板聚集等影響橋血管再狹窄這一病理過(guò)程。ZAP70 作為SYK 基因的重要旁系基因［25,26］，經(jīng)過(guò)GeneCards進(jìn)行檢索后發(fā)現(xiàn)，該基因的主要功能是調(diào)節(jié)成熟后T細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和黏附［27,28］、細(xì)胞因子的表達(dá)以及胸腺細(xì)胞的發(fā)育，另外對(duì)初級(jí)B細(xì)胞的發(fā)育和激活有一定促進(jìn)作用［29,30］。炎癥反應(yīng)開(kāi)始于靜脈橋血管移植后，ZAP70可能通過(guò)激活或促進(jìn)炎癥細(xì)胞的粘附，促進(jìn)靜脈移植血管內(nèi)膜增殖。

將兔頸外靜脈血管移植至頸動(dòng)脈上，靜脈血管直徑增寬約20%，移植后血管平滑肌細(xì)胞增殖，血管內(nèi)膜及中膜增后，可模擬冠脈旁路移植手術(shù)后靜脈橋血管再狹窄的病理改變。進(jìn)一步基因篩查發(fā)現(xiàn)：CD4、ZAP70、SYK、CD28、PIK3CD、CXCR4、CCR5、ITK、CCL5、BTK可能是引起橋血管增殖的相關(guān)基因。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能為CABG術(shù)后靜脈橋血管再狹窄的治療提供更廣泛的視角及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但由于實(shí)驗(yàn)樣本量等客觀因素限制，仍需進(jìn)一步的深入研究來(lái)證實(shí)。

致謝：感謝廣州基迪奧生物科技有限公司在兔靜脈橋血管檢測(cè)中提供的幫助，感謝南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院心血管外科的張雪花醫(yī)生、吳陽(yáng)醫(yī)生在兔頸部血管彩超檢查中給予的無(wú)私幫助。