張競(jìng)文，何 靜，米曉娟，許賢瑞，田 英，燕 茹

寧夏醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院//國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)代謝性心血管疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2總醫(yī)院，寧夏 銀川750004

高同型半胱氨酸血癥（HHcy）是人類最常見的代謝異常之一［1-3］，損害老年人、攜帶者和神經(jīng)退行性疾病患者的認(rèn)知和神經(jīng)功能［1,4,5］，是癡呆的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素［4,6,7］。除此之外，HHcy也與高血壓、糖尿病等心血管和代謝性疾病有關(guān)［1,4,6］，HHcy也是2型糖尿病患者發(fā)生微血管病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［6,8］。了解HHcy所致?lián)p傷及其分子機(jī)制，將有助于HHcy所致疾病的預(yù)防和治療［6,8］。

HHcy導(dǎo)致認(rèn)知功能和神經(jīng)功能損傷的機(jī)制尚不清楚［9,10］。研究提示［10-12］，HHcy具有興奮性神經(jīng)毒性作用，通過激活NMDA 受體或減少突觸前膜對(duì)谷氨酸再攝取，引發(fā)谷氨酸的興奮性毒性，導(dǎo)致腦損害的發(fā)生［13,14］。HHcy導(dǎo)致DNA甲基化異常［15,16］，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［17,18］。Hes（hes）基因家族包括Hes1～Hes7七個(gè)同源基因，可分為激活型、抑制型兩大類［19］。Hes1、Hes5屬于抑制型基因，具有特征性的堿性螺旋-環(huán)-螺旋［20］，Notch 信號(hào)通路調(diào)節(jié)Hes1、Hes5 的表達(dá)［20,21］。Hes1、Hes3和Hes5調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化［19,21］。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究可見，HHcy可降低嗅球和大腦神經(jīng)元HES1 和HES5 的 表達(dá)［18,22］。但是，HHcy 是否通 過Notch1/Hes1信號(hào)通路參與自噬和凋亡調(diào)節(jié)尚不清楚。

根據(jù)microRNA基因芯片測(cè)序分析可見，Notch信號(hào)通路為差異miRNA富集的候選通路之一，同型半胱氨酸可作用于細(xì)胞凋亡、自噬、生長(zhǎng)等［5,11,13］。本研究將以HT22小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系作為研究對(duì)象，采用同型半胱氨酸進(jìn)行共培養(yǎng)，制備高同型半胱氨酸血癥體外模型。通過細(xì)胞學(xué)、電子顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot、Real-time PCR等技術(shù)，檢測(cè)Hes1、Hes5、Jagged1、Notch1、Bcl-2、Bax、P62、LC3I、LC3II 的表達(dá)，探討HHcy對(duì)神經(jīng)細(xì)胞自噬和凋亡的影響及其Notch1/Hes1信號(hào)通路的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

全蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE 凝膠試劑盒、BCA試劑盒、5×電泳上樣緩沖液、蛋白marker 等（凱基生物）。兔抗Hes1、兔抗Hes5、兔抗Jagged1、兔抗Notch1、兔抗bax、兔抗bcl2（Abcam），多克隆抗P62（Cell signal）、Beclin-1（Proteintech）、LC3（Proteintech），βactin、CCK8等（康為世紀(jì)生物）。HT22細(xì)胞（Procell）由寧夏顱腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地饋贈(zèng)。同型半胱氨酸（Hcy）、葉酸（Folic acid）、維生素B12（Sigma）等（國(guó)藥集團(tuán)）。

應(yīng)用Primer8.3 軟件設(shè)計(jì)針對(duì)Hes1等mRNA的引物探針。Primer3 網(wǎng)址：http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/Primer3，BLAST 網(wǎng)址：http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。引物順序?yàn)?5'-3',3'-5')。GAPDH:CCTCGTCCCGTAGACAAAATG,TGAGG TCAATGAAGGGGTCGT;Hes1: CACGACACCGG ACAAACCA,GAGGTGCTTCACAGTCATTTCCA;Hes5: TACCTGAAACACAGCAAAGCCT,GGCCGC TGGAAGTGGTAAA;Notch1: CTTCGTGCTCCTG TTCTTTGTG,TCTTCGTCTCCCCACTCGTTCT;Jagged1: TCTACATAGCCTGTGAGCCTTCC,TCAC CAAGCAACAGACCCAAG;P62: GACAAGAGTAA CACTCAGCCAAGCA,TCCATCTGTTCCTCTGGC TGTC;LC3: ATCATCGAGCGCTACAAGGG,AGCC GAAGGTTTCTTGGGAG;beclin 1: GAGATTGGAC CAGGAGGAAGCT,GTGCCAAACTGTCCGCTGT G;Bcl2:TGACTTCTCTCGTCGCTACCGT,CCTGA AGAGTTCCTCCACCACC;Bax: GCCTTTTTGCTA CAGGGTTTCAT,TATTGCTGTCCAGTTCATCTCC A;β-actin:GCTGTCCCTDTATGCCTCTG,TTTGATG TCACGCACGATTT。引物由上海生工生物公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)貼壁生長(zhǎng)，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液隔24 h更換。長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，制備細(xì)胞懸液傳代培養(yǎng)。選擇3～4代的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用CCK8試劑盒，檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.2.2 Hcy作用濃度篩選 Hcy濃度設(shè)定為0、20、50、100、200、500 μmol/L。根據(jù)CCK8檢測(cè)結(jié)果，Hcy 100 μmol/L為最適濃度，培養(yǎng)48 h為最適時(shí)間。依此，本實(shí)驗(yàn)分組為：空白對(duì)照組（簡(jiǎn)稱0組），高同型半胱氨酸組（簡(jiǎn)稱100組），Hcy 100 μmol/L；高同型半胱氨酸維生素B干預(yù)組（簡(jiǎn)稱100+fv組），Hcy 100 μmol/L+葉酸+維生素B12；空白對(duì)照+葉酸+維生素B12組（簡(jiǎn)稱0+fv組）。

1.2.3 篩選Hes1 siRNA 將Hes1 siRNA干擾序列轉(zhuǎn)染HT22細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，western blot檢測(cè)Hes1蛋白表達(dá)，qPCR 檢測(cè)Hes1 mRNA 水平。所用3 條片段：si-Hes1-373、si-Hes1-1227、si-Hes1-1292。根據(jù)Western blot、qPCR檢測(cè)的結(jié)果，篩選出最優(yōu)的Hes1 siRNA片段為si-Hes1-1292。其序列為：sense GAAUUUGGG AGCUGUUUAUTG，antisense AUAAACAGCUCCC AAAUUCTG。

1.2.4 Hes1重組質(zhì)粒構(gòu)建 以小鼠cDNA為模板，PCR擴(kuò)增Hesl 基因，上下游引物分別為5'-GCCGATAT CGCCACCATGCCAGCTGATATAATGGA-3'和5'-TA ACTCGAGGC TCTCAGTTCCGCCACGGTCT-3'，目的片段約861 bp。將穿梭載體pAd-Track用EcoR V和XhoI雙酶切后獲得的骨架片段與Hes1基因片段連接，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，獲得攜帶Hes1 的質(zhì)粒。限制性內(nèi)切酶EcoR I和XhoI雙酶切，酶切片段為3720 bp和6182 bp，5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.5 Real-time PCR 采用Trizol 試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA 合成，逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系總體積25 μL，42 ℃1 h，70 ℃5 min，已合成的cDNA放入-20 ℃冰箱保存。檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；PCR 反應(yīng)液置于FTC-3000 實(shí)時(shí)定量熒光Real-time PCR 儀上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。

計(jì)算機(jī)系統(tǒng)自動(dòng)記錄熒光信號(hào)，用ΔΔCt法統(tǒng)計(jì)：

A=ΔCt=Ct（待測(cè)樣本目的基因）-Ct（待測(cè)樣本內(nèi)參基因）；B=Ct（對(duì)照樣本目的基因）-Ct（對(duì)照樣本內(nèi)標(biāo)基因）；K=ΔΔCt=A-B；表達(dá)倍數(shù)變化=2-K

1.2.6 Hes1 siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞 轉(zhuǎn)染細(xì)胞按說明書操作。取對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞，按照每孔8×105/孔平鋪在6孔板，穩(wěn)定培養(yǎng)24 h；Lipofectamine 2000 分別與對(duì)應(yīng)siRNA 預(yù)混配置成工作液，100 nmol/L，室溫孵育25 min；待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度約50%時(shí)，更換siRNA預(yù)混工作液，繼續(xù)37 ℃孵育1 d后更換含血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1～2 d；收集細(xì)胞，Western blot檢測(cè)各組Hes1蛋白表達(dá)，篩選出最優(yōu)的Hes1干擾片段。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 20.0 軟件分析。Student's檢驗(yàn)和SNK檢驗(yàn)，進(jìn)行不同分組之間的兩兩比較，以P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)情況

培養(yǎng)48 h可見，各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況接近，細(xì)胞比較豐富（圖1）?？瞻讓?duì)照組（0組）胞體豐滿、不規(guī)則形，片狀生長(zhǎng)，細(xì)胞可見突起（圖1A）。高同型半胱氨酸組（100組）中死亡細(xì)胞明顯增加（圖1B），高同型半胱氨酸維生素B干預(yù)組（100+fv組，圖1C）和維生素B組（0+fv組）可見少量死亡細(xì)胞（圖1D）。

圖1 HT22細(xì)胞生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of HT22 cells in different groups.A:Scattered dead cells in blank control group.B:Increased dead cells in 100 μmol/L Hcy-treated cells.C:Scattered dead cells in 100+fv group.D:Scattered dead cells in 0+fv group.Scale bar=50 μm.

2.2 細(xì)胞凋亡

培養(yǎng)48 h后，Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果可見（圖2），分別與0組（圖2A）、100+fv組（圖2C）和0+fv組（圖2D）比較，高同型半胱氨酸組（圖2B）凋亡細(xì)胞的比例均明顯升高（圖2E）；與高同型半胱氨酸組比較，100+fv組和0+fv組凋亡細(xì)胞比例明顯降低（圖2E）。

圖2 HT22細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Flow cytometry for detecting cell apoptosis in different groups.A: 0 group,B: 100 group.C:100+fv group.D: 0+fv group.E: Histogram of apoptotic proportion,*P<0.05 vs 0 group;#P<0.05 vs 100 group,n=3.

2.3 超微結(jié)構(gòu)變化

透射電子顯微鏡觀察可見，培養(yǎng)48 h，對(duì)照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器形態(tài)正常（圖3A）；在Hcy 100 μmol/L 組，細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，細(xì)胞質(zhì)明顯水腫淡染，線粒體腫脹、空泡化，可見多個(gè)自噬體（圖3B）；在100+fv組，也可見線粒體腫脹、空泡化、自噬體，但程度輕于Hcy 100 μmol/L組（圖3C）；在100+fv組，偶見自噬體（圖3D）。

圖3 HT22細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.3 Ultrastructure of HT22 cells in different groups.A:Normal mitochondria(M)in 0 group.B:Mitochondrial swelling,vacuolation(V),and increased autophagosome(AS)in 100 group.C:Autophagosomes(AS)in 100+fv group.D:Autophagosomes(AS)in 0+fv group.Scale bar=1 μm.

2.4 Western blot結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示（圖4），在Hcy 100 μmol/L組，Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)降低，Bax/Bcl-2比值明顯高于0組和100+fv組（P<0.05）；P62相對(duì)值在Hcy 100 μmol/L組明顯低于對(duì)照組（圖4，P<0.05），LC3II/LC3I比值在Hcy 100 μmol/L 組高于0 組和100+fv 組（P<0.05）；Beclin1在Hcy 100 μmol/L組未見明顯變化(圖4)。

圖4 凋亡和自噬相關(guān)蛋白Western blot結(jié)果Fig.4 Western blotting of the proteins related with apoptosis and autophagy in different groups.A:Western blots of the proteins.B:Bar graph of Bax/Bcl-2 and LC3II/LC3I ratios.C:Bar graph of relative values of P62 and Beclin1.*P<0.05 vs 0 group;#P<0.05 vs 100 group;n=3.

HES1、HES5、Notch1 和Jagged1 蛋 白Western blot 結(jié)果可見（圖5），在Hcy100 μmol/L 組，HES1、HES5、Notch1和Jagged1蛋白表達(dá)比值明顯低于對(duì)照組（P<0.05），100+fv 組明顯高于Hcy 100 μmol/L 組（圖5，P<0.05）。

圖5 HES1、HES5、Notch1和Jagged1 western blot結(jié)果Fig.5 Western blotting of HES1,HES5,Notch1 and Jagged1 proteins in different groups.A:Western blots of the proteins.BE: Histograms of relative expressions of HES1,HES5,Notch1 and Jagged1,respectively.*P<0.05 vs 0 group;#P<0.05 vs 100 group;n=3.

2.5 Real-time PCR 檢測(cè)結(jié)果

從P62、LC3、Beclin1的mRNA擴(kuò)增結(jié)果可見（圖6），Hcy 100 μmol/L 組LC3、Beclin1 的mRNA 明顯高于0組和0+fv組，P62明顯低于100+fv組（P<0.05），LC3和Beclin1的mRNA在高同型半胱氨酸組與100+fv組之間無顯著性差異（圖6D）。

HT22細(xì)胞Real-time PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)48 h，高同型半胱氨酸組Hes1和Hes5 mRNA明顯減少（圖7），與0組、100+fv組和0+fv組比較，差異均有顯著性意義（圖7E，P<0.05）；高同型半胱氨酸組Jagged1無明顯變化，100+fv組Hes1 mRNA明顯高于高同型半胱氨酸組（圖7E，P<0.05）。

圖7 Hes1、Hes5、Notch1和及Jagged1 Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Real-time PCR of Hes1,Hes5,Notch1 and Jagged1 in different groups.A: Hes1 mRNA amplification curve;B: Hes5 mRNA amplification curve;C: Notch1 mRNA amplification curve;D:Jagged1 amplification curve;E: Histogram of mRNA amplification;*P<0.05 vs 0 group;#P<0.05 vs 100 group.

2.6 Hcy對(duì)過表達(dá)和干擾Hes1后的影響

Western blot 檢測(cè)可見，加入Hes1 干擾和過表達(dá)后，目標(biāo)蛋白均有一定的變化（圖8A）。Hcy組、Hes1 siRNA組和Hcy+Hes1siRNA組Hes1表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，且Hcy+Hes1siRNA 組又明顯低于Hcy 組和Hes1 siRNA組（圖8B）；而Notch1表達(dá)量無顯著性差異；Jagged1表達(dá)量在Hcy組和Hcy+Hes1siRNA組明顯降低，而Hes1 siRNA組高于Hcy組和Hcy+Hes1siRNA組（圖8B）。

圖8 Hcy對(duì)過表達(dá)和干擾Hes1后的影響Fig.8 Effect of Hcy on Hes1,Notch1 and Jagged1 expressions in HT22 cells with Hes1 overexpression and knockdown.A:Western blots of the proteins.B:Histogram of relative expression levels of the proteins.*P<0.05 vs con and si-NC groups,respectively;#P<0.05 vs Hcy group;n=3.

3 討論

高同型半胱氨酸血癥（HHcy）與神經(jīng)和精神健康的改變有關(guān)，如認(rèn)知障礙、抑郁癥、中風(fēng)和神經(jīng)退行性疾病［3,19,24］。實(shí)驗(yàn)研究提示，HHcy能夠?qū)е履X組織損傷和神經(jīng)細(xì)胞凋亡［18,22］、神經(jīng)細(xì)胞自噬［22,23］。本研究顯示，在HT22細(xì)胞，同型半胱氨酸100 μmol/L培養(yǎng)48h后，凋亡細(xì)胞的比例明顯升高，細(xì)胞水腫、線粒體腫脹空泡化、自噬體增加；采用葉酸和維生素B12干預(yù)后細(xì)胞凋亡比例和細(xì)胞自噬明顯降低。結(jié)果提示，高同型半胱氨酸能夠誘導(dǎo)HT22細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷、自噬上調(diào)及細(xì)胞凋亡。該結(jié)果與前期ApoE-/-高同型半胱氨酸小鼠體內(nèi)研究基本一致［18,22,25］。

研究表明，HHcy在體內(nèi)外均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12,22］。然而，其中的作用機(jī)制尚不清楚。在本研究中，通過Western blot和real-time PCR 檢測(cè)可見，同型半胱氨酸100 μmol/L培養(yǎng)48 h后，Bax基因表達(dá)明顯增加，而Bcl-2基因表達(dá)則明顯抑制。結(jié)果提示高同型半胱氨酸可通過bax/bcl-2途徑引起細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，HHcy誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡［22,25］。在衰老和神經(jīng)退行性變過程中，可見神經(jīng)元凋亡和自噬增加［23,26］。細(xì)胞凋亡增加、儲(chǔ)備細(xì)胞減少可能是許多疾病共同的致病基礎(chǔ)［1,22,27］。

HHcy能夠誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)元自噬和細(xì)胞凋亡，從而加重神經(jīng)元損傷［23,28］。作為自噬促進(jìn)劑，HHcy可誘導(dǎo)大鼠腦缺血再灌注后LC3b/Beclin-1表達(dá)上調(diào)，自噬體積累，加重神經(jīng)元損傷［22,28］。本研究結(jié)果顯示，在同型半胱氨酸100 μmol/L 組，P62 相對(duì)值明顯低于對(duì)照組，LC3II/LC3I比值明顯高于對(duì)照組和干預(yù)組，這些變化與線粒體腫脹、空泡化、自噬體增加相一致。P62蛋白與蛋白質(zhì)的運(yùn)輸和降解有關(guān)，表達(dá)下調(diào)時(shí)，自噬被激活［23,28］。關(guān)于HHcy引起神經(jīng)細(xì)胞自噬增加的途徑和機(jī)制尚不清楚［15,16］。HHcy 可抑制S-腺苷甲硫氨酸的生物合成，導(dǎo)致DNA低甲基化，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)［1,15,28］。

由HHcy引起的多種毒性作用可能與神經(jīng)元再生耗竭有關(guān)［13,25,31］。本研究顯示，同型半胱氨酸100 μmol/L處理的HT22細(xì)胞，HES1、HES5、Notch1和Jagged1蛋白表達(dá)降低。提示高同型半胱氨酸可下調(diào)Hes1、Hes5、Notch1和Jagged1的表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，在HHcy 所致神經(jīng)元損傷和認(rèn)知障礙中，存在HES1 和HES5表達(dá)降低［18,22,25］。

在HHcy狀態(tài)下，對(duì)于Notch/Hes/Rbpj信號(hào)通路以及Hes1、Hes5、Notch1和Jagged1神經(jīng)元表達(dá)下調(diào)的意義和機(jī)制知之甚少，將需要更多的研究進(jìn)行證明。Hes1andHes5基因是Hes基因家族的主要成員，作為轉(zhuǎn)錄激活因子參與神經(jīng)元分化［20,21］。研究提示［27,29,30］，Wnt/β-catenin和Notch信號(hào)通路與神經(jīng)元干細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的調(diào)節(jié)密切相關(guān)；在神經(jīng)干細(xì)胞中，Wnt和Notch信號(hào)通路參與了hNPCs 的調(diào)節(jié)［21,27］。在Notch/Rbpj 信號(hào)傳導(dǎo)通路中起主導(dǎo)作用的Hes1和Hes5，在HHcy 小鼠的額葉皮層神經(jīng)元和大腦中表達(dá)下調(diào)，可能抑制了Notch/Hes/Rbpj信號(hào)通路的作用［22,25,32］。