郭志華，王志鵬，曾琳玲，紀雪霞

南方醫(yī)科大學附屬廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學科學院）麻醉科，廣東 廣州510080

靜脈麻醉藥物丙泊酚對發(fā)育期大腦的神經(jīng)毒性作用一直是麻醉學和神經(jīng)發(fā)育學領域的研究熱點。已有研究證實，丙泊酚在突觸發(fā)育的關鍵時期可誘導嚙齒類動物神經(jīng)元的凋亡及干擾突觸的形成，引起發(fā)育中大腦的神經(jīng)病變，導致隨后認知功能改變［1-4］。但胚胎期暴露于丙泊酚是否產(chǎn)生神經(jīng)功能損害的研究較少。有研究顯示，斑馬魚胚胎暴露于丙泊酚不僅引起胚胎孵化率降低，幼魚畸形率增加，還導致3 d幼魚鞘磷脂蛋白（MBP）生產(chǎn)減少［5］；有研究進一步證實MBP減少可能與OL凋亡增多及轉(zhuǎn)錄因子olig1、olig2 和sox10 受到抑制相關［6］。而丙泊酚對MBP抑制效應是否具有持續(xù)性及相關分子機制尚待探索。本研究旨在探討胚胎期丙泊酚暴露對斑馬魚發(fā)育不同時期MBP表達的影響及相關分子機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

丙泊酚原液（sigma），兔抗斑馬魚MBP多克隆抗體（genetex），兔抗GAPDH 多克隆抗體（genetex），兔抗GFP抗體（abcam），TUNEL試劑盒（Roche），qPCR引物由上海生工股份有限公司合成、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒量（TaKaRa），RNA提取試劑盒（TaKaRa），RT-PCR試劑盒（TaKaRa），PCR儀（LightCycle480，Roche），熒光電動顯微鏡（Olympus corporation）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 采用wild-type AB strain斑馬魚和轉(zhuǎn)基因品系Tg(mbp：EGFP），魚齡6～9月。采集受精后30 min 內(nèi)產(chǎn)下的受精卵，置于加入亞甲基藍溶液（0.2‰）的新鮮養(yǎng)魚水中，于恒溫孵箱中28.5 ℃孵育。將孵育至6 hpf的斑馬魚胚胎轉(zhuǎn)移至6孔板中，30個卵/孔。吸凈孔中的孵化水后迅速加入含30μg/mL丙泊酚（丙泊酚組）、二甲基亞砜（DMSO組）和空白孵化水（對照組），8 mL/孔。受精24 h時，各組受試液更換一半相同濃度的液體，48 h時全部更換為新鮮的孵化水。及時取出死亡的胚胎，以卵凝結(jié)和心臟停止跳動作為死亡的終點。

1.2.2 qRT-PCR檢測mbp、caspase-8、caspase-9和caspase-3mRNA轉(zhuǎn)錄水平 收集發(fā)育不同時期斑馬魚幼魚，60條/組，采用Trizol法提取腦組織總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。按照TaKaRa操作說明書加樣擴增反應體系，反應條件為：預變性95 ℃30 s；循環(huán)反應95 ℃5 s，60 ℃30 s，40個循環(huán)；冷卻至50 ℃。PCR引物序列如下：mbp上游引物5'-AATCAGCAGGTTCTTCGGA GGAGA-3'，下游引物5'-AAGAAATGCACGACAGG GTTGACG-3'；caspase-8上游引物：5'-ATGCTGGAGA AACATGCCATGCAG-3'，下游引物：5'-AGGGTGTTT ACTTGGGCCTGA-3'；caspase-9上游引物：5'-GTGA CCATGCCAGCATTTC-3'，下游引物：5'-TGGTTCTC CACTTTTTTC ACCTT-3'；內(nèi)參efla上游引物5'-TAC TTCTCAGGCTGACTGTG-3'，下游引物5'-ATCTTCT TGATGTATGCGCT-3'。結(jié)果采用2-ΔΔCt評價目的基因的相對表達量。

1.2.3 Western blot測定MBP、caspase蛋白表達 提取3 d幼魚總蛋白，60條/組，BCA法測定蛋白濃度。采用15%SDS-PAGE分離膠，每孔上樣量50 μg，恒壓電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入兔抗斑馬魚一抗MBP多克隆抗體（1∶1000稀釋）、兔抗GAPDH 多克隆抗體（1∶1000稀釋），4℃孵育過夜。次日洗膜后加入二抗羊抗兔HRP抗體（1∶10 000稀釋）室溫孵育。浸泡于ECL發(fā)光液，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，所采集圖像用ImageJ軟件分析目標條帶的灰度值。Caspase 家族蛋白一抗分別為：兔抗斑馬魚caspase-3一抗稀釋液（1∶1000），caspase-8一抗稀釋液（1∶1000），caspase-9一抗稀釋液（1∶1000）。

1.2.4 TUNEL染色 收集3 d Tg（mbp：GFP）轉(zhuǎn)基因幼魚，6條/組，經(jīng)過4%多聚甲醛固定后20%、30%蔗糖脫水，制備冰凍切片。然后進行枸櫞酸抗原熱修復，加入2%山羊血清封閉、通透后，再加入兔抗-GFP 抗體（1∶200），4℃過夜；最后加入二抗山羊抗兔（1∶500），室溫避光1 h。按操作說明書配置TUNEL混合液，于37℃避光孵育1 h。DAPI核染后加入抗熒光淬滅劑封片，于熒光顯微鏡下拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚對發(fā)育不同時期幼魚mbp mRNA 轉(zhuǎn)錄的影響

與對照組相比，在受精后3、4、5、6、7 d，丙泊酚組幼魚mbp mRNA 轉(zhuǎn)錄水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖1）。DMSO組與對照組的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。出生后10d，3組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.2 丙泊酚對發(fā)育不同時期幼魚MBP合成的影響

與對照組相比，在受精后3 d和7 d，丙泊酚組幼魚MBP合成水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖2）。DMSO組與對照組的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。出生后10 d，3組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖2 丙泊酚對發(fā)育不同時期幼魚MBP蛋白的影響Fig.2 Effect of propofol on expression of MBP in zebrafish at different developmental stages.*P<0.05 vs control group.

2.3 丙泊酚對3 d幼魚細胞凋亡的影響

與對照組相比，3 d幼魚OL細胞凋亡數(shù)量增多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖3）。DMSO組與對照組的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖3 丙泊酚對3 d幼魚OL凋亡的影響Fig.3 Effect of propofol on oligodendrocyte apoptosis in zebrafish at 3 d post-fertilization.*P<0.05 vs control group.Green fluorescence represents oligodendrocytes,red fluorescence represents apoptotic cells,and the merged images show apoptotic oligodendrocytes.

2.4 丙泊酚對凋亡相關因子轉(zhuǎn)錄水平的影響

與對照組相比，丙泊酚組3 d 幼魚caspase-3、caspase-8和caspase-9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖4）。DMSO組與對照組的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖4 丙泊酚對3 d 幼魚caspase-3、caspase-8 和caspase-9 mRNA的影響Fig.4 Effect of propofol on expressions of caspase-3,caspase-8 and caspase-9 mRNA in zebrafish at 3 d post-fertilization.*P<0.05 vs control group.

2.5 丙泊酚對凋亡相關因子蛋白合成的影響

與對照組相比，丙泊酚組3 d 幼魚caspase-3、caspase-8和caspase-9 蛋白合成水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖5）。DMSO組與對照組的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖5 丙泊酚對3 d幼魚caspase-3、caspase-8和caspase-9蛋白合成的影響Fig.5 Effect of propofol on the expression of caspase-3,caspase-8 and caspase-9 protein in zebrafish at 3 d post-fertilization.*P<0.05 vs control group.

3 討論

丙泊酚對發(fā)育中大腦的毒性作用是近年來臨床工作者和患兒家屬高度關注的問題。臨床研究表明，在4歲前或2歲前經(jīng)歷過多次麻醉史的患兒隨后出現(xiàn)學習、記憶能力下降的風險增加［7-9］。嚙齒類動物實驗也證實，丙泊酚可影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，出現(xiàn)學習、記憶等功能障礙［10,11］，其機制可能和促進細胞凋亡和抑制細胞增殖有關。研究還發(fā)現(xiàn)，與嚙齒類動物結(jié)果一致，斑馬魚胚胎暴露于丙泊酚不僅引起胚胎孵化率降低，幼魚畸形率增加，還抑制MBP表達［5］。MBP是成熟少突膠質(zhì)細胞OL特異性表達蛋白［12］，其包繞神經(jīng)元的軸突形成髓鞘，是保證神經(jīng)信號快速、準確傳導的重要結(jié)構［13］。OL的發(fā)育異常、MBP合成減少均會引起髓鞘結(jié)構異常甚至缺失，導致相關的神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?4］。胚胎期丙泊酚暴露對MBP的抑制作用是否具有持續(xù)性及相關分子機制值得探討。本研究分析了胚胎期丙泊酚暴露后對斑馬魚發(fā)育不同時期MBP表達的影響及相關分子機制，結(jié)果顯示，胚胎期丙泊酚暴露可引起發(fā)育后3～7 d幼魚MBP mRNA和蛋白水平降低，而10 d幼魚無明顯變化，這提示丙泊酚對MBP的抑制作用具有短期持續(xù)性；本研究進一步檢測了3 d幼魚OL凋亡及凋亡相關因子變化情況，發(fā)現(xiàn)3 d幼魚OL凋亡數(shù)量增加，并伴隨caspase家族caspase-3、caspase-8、caspase-9 mRNA 和蛋白水平升高，提示OL凋亡可能是MBP表達下降的機制之一。

受精后3 d是斑馬魚發(fā)育過程中重要時期，不僅是胚胎蛻膜孵化成幼魚的關鍵時期，也是少突膠質(zhì)細胞表達MBP形成髓鞘結(jié)構的初始時期［15］。已有研究證實［5］，胚胎期丙泊酚暴露可抑制mbp mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白合成水平。本實驗也得出一致結(jié)論，丙泊酚引起3 d幼魚MBP mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白合成下降；而這種抑制作用是否持續(xù)，尚無相關報道。本研究進一步檢測幼魚發(fā)育不同時期發(fā)現(xiàn)，經(jīng)丙泊酚暴露后，4、5、6、7 d幼魚MBP mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白合成均受到抑制，差異有統(tǒng)計學意義；而受精后10 d幼魚的MBP mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白合成水平與對照組的差異無統(tǒng)計學意義，這表明胚胎期丙泊酚暴露對MBP的抑制作用具有短期持續(xù)性，可引起發(fā)育3～7 d幼魚MBP 表達下降。在發(fā)育第10天，此抑制現(xiàn)象消失，MBP表達恢復正常。在幼兒的生長發(fā)育過程中，髓鞘化過程是必不可少的重要環(huán)節(jié)。MBP的表達異?？捎绊懰枨市纬蛇^程，導致髓鞘異常、甚至缺失，從而引起神經(jīng)信號傳導異常［16］，可表現(xiàn)為認知功能障礙、語言、視力減弱、震顫、肌痙攣等［17］。探討丙泊酚抑制MBP表達的分子機制將為丙泊酚對發(fā)育中大腦的毒性作用研究提供重要的理論數(shù)據(jù)，意義重大。

細胞凋亡是內(nèi)外環(huán)境的變化或在死亡信號的觸發(fā)下，在基因調(diào)控下所發(fā)生的一系列細胞主動死亡的過程。異常因素引起神經(jīng)細胞凋亡程序紊亂，會導致胎兒大腦發(fā)育異常。目前認為觸發(fā)細胞凋亡的信號傳導通路主要包括內(nèi)源性途徑（線粒體凋亡途徑）和外源性途徑（細胞膜受體凋亡途徑）。細胞色素C、caspase-3、caspase-8、caspase-9是在此兩條通路中發(fā)揮重要作用的關鍵要素［18］。已有研究證實，丙泊酚引起的學習、記憶能力下降與神經(jīng)元凋亡增多相關［19,20］；丙泊酚可明顯上調(diào)細胞色素C、caspase-3、caspase-8、caspase-9，提示丙泊酚通過激活細胞膜受體介導和線粒體介導的信號傳導通路誘導胚胎期神經(jīng)干細胞的凋亡［21］。那么，丙泊酚是否通過激活此信號傳導通路誘導OL細胞凋亡增多，值得探索。

MBP蛋白表達于OL細胞及髓鞘漿膜面，轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（mbp∶GFP）是將mbp基因的啟動子與GFP基因重組，因此GFP陽性細胞即為MBP蛋白表達陽性的成熟OL。本研究采用轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（mbp：EGFP）與免疫熒光技術，檢測了3 d幼魚OL凋亡，結(jié)果顯示丙泊酚組幼魚OL凋亡數(shù)量增多，這提示OL凋亡增多，導致成熟OL數(shù)量減少，可能是MBP表達下降的機制之一，這與既往研究［22］結(jié)論一致，該研究也發(fā)現(xiàn)當孕期獼猴單次或持續(xù)接受丙泊酚腹腔注射后，丙泊酚不僅可誘導胎兒及新生獼猴腦部神經(jīng)元凋亡，在MBP表達初期，誘導OL的凋亡。本研究還檢測了啟動細胞內(nèi)和細胞外凋亡程序的caspase-3、caspase-8、caspase-9，結(jié)果與凋亡數(shù)量增加一致。丙泊酚暴露組caspase-8、caspase-9 和caspase-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白合成水平均升高，這提示內(nèi)源性和外源性細胞凋亡信號通路的激活介導了丙泊酚所致的OL凋亡，是丙泊酚誘導細胞凋亡的機制之一。

綜上所述，本實驗證實胚胎期丙泊酚暴露可引起發(fā)育3～7 d幼魚MBP表達下降，其機制可能與OL凋亡相關。然而，3～7 d幼魚MBP表達下降是否引起髓鞘結(jié)構的異常，從而導致神經(jīng)信號傳導異常，引起神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，還需在后續(xù)研究中進一步探索。