賴麗清，范曉慧，黃鷺強(qiáng)，李達(dá)諒*

（1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117；2.建甌市東游鎮(zhèn)人民政府，福建 南平 353000）

鉻（Cr）是人體生長發(fā)育所必需的微量元素之一，但過高水平的鉻（Ⅲ）離子會(huì)影響機(jī)體內(nèi)的酶活性，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致氧化還原失衡，影響體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的平衡，損害皮膚、肝、腸、呼吸系統(tǒng)等，導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)紅斑、潰瘍、水腫等癥狀，引起鼻黏膜腫脹、頭痛、呼吸氣短、嗅覺減退、鼻出血等危害[1-3]。有研究表明，若長期大量攝入鉻（Ⅲ），人體患高血壓、肺癌、食管癌、糖尿病等疾病的可能性增加[4-6]。近十幾年來，隨著現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，特別是工業(yè)生活三廢的過量排放、含金屬農(nóng)藥肥料的隨意濫用和含金屬常見日用品的不當(dāng)處理，導(dǎo)致了重金屬被大量排放到土壤和地表水中，嚴(yán)重污染環(huán)境[7,8]。環(huán)境中的重金屬很容易以離子形式通過生物鏈在水產(chǎn)品、農(nóng)作物等食品中積累，通過食物鏈被人體吸收，在生物體內(nèi)積累，威脅著人們的身體健康[9,10]。因此，便捷、快速、高效、準(zhǔn)確地對(duì)重金屬鉻離子實(shí)施監(jiān)測對(duì)提高食品安全和保障人體健康具有重大意義。

目前，已有多種檢測技術(shù)用于鉻的檢測，如電感耦合等離子體質(zhì)譜法[11]、石墨爐原子吸收光譜法[12,13]、伏安法[14,15]、高效液相色譜法[16]等，但這些方法大多存在儀器成本高、操作復(fù)雜、檢測時(shí)間較長等問題，限制其實(shí)現(xiàn)快速、實(shí)時(shí)檢測[17,18]。近年來，小分子熒光探針法因操作簡單、靈敏度高、檢出限低、選擇性好、響應(yīng)時(shí)間快、不需參考溶液、便捷的可視化等優(yōu)點(diǎn)而引起人們的廣泛關(guān)注[19]。其主要原理是基于探針分子選擇性識(shí)別目標(biāo)分子后與其結(jié)合，并在一定的波長范圍內(nèi)引起熒光光譜發(fā)生變化，而這種變化常常伴隨著濃度依賴性。利用這一特性，可達(dá)到定性與定量檢測目標(biāo)分子的目的。目前越來越多可特異性識(shí)別目標(biāo)分子的熒光探針被設(shè)計(jì)開發(fā)出來，并廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)[20,21]。

羅丹明螺內(nèi)酰胺或螺內(nèi)酯衍生物是非熒光且無色，而相應(yīng)螺內(nèi)酰胺/內(nèi)酯的開環(huán)產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光發(fā)射和顏色變化，是制備熒光增強(qiáng)型探針的良好選擇，也是目前為止研究最多的一類熒光探針[22,23]，但較少數(shù)探針可特異性識(shí)別Cr3+。因此，本研究基于羅丹明B結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合成了一種新型選擇性識(shí)別鉻（Ⅲ）離子的熒光探針（FS-Cr），并通過結(jié)構(gòu)表征和光譜特性表征對(duì)探針的傳感性質(zhì)展開了研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

羅丹明B，購于安耐吉化學(xué)試劑公司；噻吩-2,5-二甲醛，購于畢得化學(xué)試劑公司；85%水合聯(lián)氨、無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氘代氯仿、二甲亞砜、乙腈、六水合三氯化鉻、四水合氯化亞鐵、氯化鈷、氯化鉛、氯化鋅、氯化鋁、氯化鈣、硫酸鎘、碳酸銫、五水合硫酸銅、氯化汞、氯化鉀、氫氧化鋰一水化合物、氯化鎂、氯化錳、氯化鈉、氯化銨、氯化鎳、氟化鈉、溴化鈉、碘化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、硫酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、69%的硝酸、30%過氧化氫，均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；紫菜、海苔，市售實(shí)際樣品。

核磁共振波譜儀，美國布魯克公司；LCQ-FLEET質(zhì)譜儀，美國賽默飛世爾科技公司；UV-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；FS5熒光分光光譜儀，愛丁堡儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 探針FS-Cr的合成

在25 mL 的圓底燒瓶中依次加入羅丹明B（888.48 mg，2.00 mmol）、水合聯(lián)氨（640.80 mg，20 mmol）、無水乙醇（200 mL）中，將混合物置于90 ℃下加熱回流攪拌過夜。薄層層析（TLC）檢測反應(yīng)進(jìn)程，展開劑為石油醚∶乙酸乙酯=2∶1（體積比）。反應(yīng)結(jié)束后，減壓旋蒸去除溶劑，化合物1粗產(chǎn)物由硅膠柱層析色譜分離純化，洗脫劑為石油醚∶乙酸乙酯= 2∶1（體積比），得到灰色化合物1，產(chǎn)量為415.88 mg，產(chǎn)率為45.60%。

在25 mL的圓底燒瓶中依次加入化合物1（228 mg,0.50 mmol）、噻吩-2,5-二甲醛（70 mg,0.50 mmol）、無水乙醇（10 mL），將混合物置于90 ℃下加熱回流攪拌過夜。薄層層析（TLC）檢測反應(yīng)進(jìn)程，展開劑為石油醚∶乙酸乙酯=2∶1（體積比）。反應(yīng)結(jié)束后，減壓旋蒸去除溶劑，探針粗產(chǎn)物由硅膠柱層析色譜分離純化，洗脫劑為石油醚∶乙酸乙酯=7∶1（體積比），得到黃色化合物即為探針，產(chǎn)量為333 mg，產(chǎn)率為57.5%。合成路線見圖1。

圖1 探針的合成路線

1H NMR(400 MHz,Chloroform-d)δ9.81(s,1H),9.24(s,1H),7.97(s,1H),7.53(d,J=33.8 Hz,3H),7.20-7.07(m,2H),6.70-6.09(m,6H),3.33(s,8H),1.15(s,12H)；13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ 183.26,165.03,149.03,143.79,141.42,136.19,133.76,129.01,128.65,128.02, 124.36,123.50,107.84,106.04,98.06,44.42,12.71.MS(EI)，m/z:C34H34N4O3S 計(jì)算值578.24，實(shí)測值578。

1.2.2 溶液的制備

⑴ 探針工作液的制備

精確稱取一定量的探針粉末，溶于二甲亞砜溶液中，配置成濃度為10 mmol/L的探針工作液。

⑵ 不同分析物溶液的制備

精確稱取一定量的不同分析物六水合三氯化鉻、四水合氯化亞鐵、氯化鈷、氯化鉛、氯化鋅、氯化鋁、氯化鈣、硫酸鎘、碳酸銫、五水合硫酸銅、氯化汞、氯化鉀、氫氧化鋰一水合物、氯化鎂、氯化錳、氯化鈉、氯化銨、氯化鎳、氟化鈉、溴化鈉、碘化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、硫酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，溶于去離子水中，配制成濃度為100 mmol/L的分析物溶液。⑶ 樣品前處理

紫菜樣品編號(hào)為1，海苔樣品編號(hào)為2。使用去離子水仔細(xì)清洗樣品，在干凈燒杯中，分別準(zhǔn)確稱取0.1 g樣品，依次加入5 mL 69%的硝酸溶液，2 mL 30%的過氧化氫溶液，超聲20 min，直到樣品消解完全。將消解液轉(zhuǎn)至50 mL容量瓶中，用去離子水定容，制成樣品檢測液備用。

1.3 探針傳感特性研究

1.3.1 選擇性分析

依次向比色皿中加入3 mL乙腈溶液、3 μL探針工作液（10 mmol/L）、6 μL不同分析物溶液（100 mmol/L），充分混勻。用熒光分光光度計(jì)掃描，獲得熒光光譜，記錄熒光強(qiáng)度，熒光分光光度計(jì)的激發(fā)波長555 nm，狹縫寬度為2 nm。

1.3.2 反應(yīng)時(shí)間分析

依次向比色皿中加入3 mL乙腈溶液、3 μL探針工作液（10 mmol/L，充分混合，間隔2 min，采用1.3.1條件獲得熒光光譜，記錄熒光強(qiáng)度。

依次向比色皿中加入3 mL乙腈溶液、3 μL探針工作液（10 mmol/L）、6 μL六水合三氯化鉻溶液（100 mmol/L），充分混合，間隔2 min，采用1.3.1條件獲得熒光光譜，記錄熒光強(qiáng)度。

1.3.3 反應(yīng)濃度響應(yīng)分析

依次向比色皿中加入3 mL乙腈溶液、3 μL探針工作液（10 mmol/L）、不同濃度的六水合三氯化鉻溶液（0～200 μmol/L），充分混勻。采用1.3.1條件獲得熒光光譜，記錄熒光強(qiáng)度。

1.4 實(shí)際樣品檢測及加標(biāo)回收

1.4.1 實(shí)際樣品檢測

依次向比色皿中加入3 mL乙腈溶液、3 μL探針工作液（10 mmol/L）、2 μL探樣品檢測液，充分混勻。采用1.3.1條件獲得熒光光譜，記錄熒光強(qiáng)度。

1.4.2 加標(biāo)回收

在1.4.1基礎(chǔ)上，再加入不同濃度的六水合三氯化鉻溶液（2、4 μmol/L），充分混勻，再次掃描獲得熒光光譜，記錄熒光強(qiáng)度，平行實(shí)驗(yàn)3次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

以Cr3+濃度為橫坐標(biāo)，以紫外吸收值和熒光強(qiáng)度分別為縱坐標(biāo)分析其線性關(guān)系，計(jì)算檢測限。根據(jù)國際理論化學(xué)和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)盟（IU-PAC）的規(guī)定[18]，檢測限公式為 LOD=3b/k，其中信噪比為3，b為25次平行測得的空白溶液的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為熒光強(qiáng)度變化曲線的斜率。采用Chem Draw 2020軟件繪制相應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)。采用Origin 2021軟件記錄、分析、處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并繪制相關(guān)圖像。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針傳感特性研究

2.1.1 選擇性分析

通過測定探針對(duì)不同分析物（Cr3+，Zn2+，F(xiàn)e2+，Pb2+，Cd2+，Hg2+，Co2+，Ca2+，Mg2+，Cu2+，Mn2+，Cs2+，K+，Na+，Li+，NH4+，Ni+，Al3+，F(xiàn)－，Br－，I－，HCO3－，CO32－，SO42－，HPO42－，H2PO4－）的熒光響應(yīng)，探究其傳感特性。結(jié)果如圖2，在含有探針的乙腈溶液中只有在加入Cr3+后體系顏色從無色變?yōu)榱练凵?，探針開啟強(qiáng)熒光，在555 nm激發(fā)波長下，熒光強(qiáng)度變化最大，在584 nm發(fā)射波長處熒光強(qiáng)度顯著增大了81904.30倍，而其他離子的加入，體系的熒光光譜變化非常小。所以，探針對(duì)Cr3+表現(xiàn)出非常高的選擇性熒光響應(yīng)。

圖2 探針加入不同離子后的熒光光譜

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間響應(yīng)

本研究還考察了響應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光探針的影響，結(jié)果如圖3，探針在乙腈溶液中隨著時(shí)間的遞增，在584 nm處的熒光強(qiáng)度沒有發(fā)生明顯變化，這表明探針能在乙腈溶液中穩(wěn)定存在。而繼續(xù)加入Cr3+（200 mmol/L）離子后，在0～4 min內(nèi)體系的熒光強(qiáng)度迅速減弱，之后基本沒有發(fā)生變化，這表明探針與Cr3+反應(yīng)時(shí)間為6 min?；诖?，展開后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)探針識(shí)別 Cr3+ 的影響

2.1.3 反應(yīng)濃度響應(yīng)

靈敏度是熒光探針的另一重要指標(biāo)，所以通過測定探針對(duì)不同濃度的Cr3+的熒光響應(yīng)，探究其濃度響應(yīng)特性。結(jié)果如圖4，隨著Cr3+濃度的增加，體系的熒光強(qiáng)度逐漸增大。由圖可知，在555 nm激發(fā)波長下，584 nm發(fā)射波長處的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)出濃度依賴性。在3～15 μmol/L范圍內(nèi)584 nm處的熒光強(qiáng)度與Cr3+濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，回歸方程為，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.995，通過計(jì)算檢測限（LOD）為0.059 μmol/L。探針對(duì)Cr3+的濃度響應(yīng)在熒光光譜響應(yīng)中表現(xiàn)良好，具有優(yōu)異的應(yīng)用前景。

圖4 探針在乙腈溶液中隨著Cr3+ 濃度增加熒光強(qiáng)度變化

圖5 探針在乙腈溶液中檢測樣品的熒光光譜

2.2 實(shí)際樣品檢測及加標(biāo)回收

為探究探針實(shí)際應(yīng)用情況，隨機(jī)購買市售2份水產(chǎn)制品（藻類）進(jìn)行了測定。探針工作液加入樣品1后體系在584 nm發(fā)射波長處測得的熒光強(qiáng)度為22929.78。加入樣品2后體系在584 nm處測得的熒光強(qiáng)度為38469.70。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，樣品1中Cr3+濃度為222.15 μg/kg，樣品2中Cr3+濃度為359.18 μg/kg。采用加標(biāo)回收的方法進(jìn)一步探究熒光探針法準(zhǔn)確性，結(jié)果如表1所示。方法回收率在101.32%～118.5%。表現(xiàn)良好，滿足分析要求。

3 結(jié)論

本研究基于羅丹明結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合成了一種新型可選擇性識(shí)別Cr3+的開啟型熒光探針。探針在乙腈溶液中只有識(shí)別Cr3+時(shí)，引起體系溶液由無色變?yōu)榱练凵㈤_啟強(qiáng)烈熒光。通過研究探針的傳感特性成功構(gòu)建了一種高效靈敏可檢測食品中Cr3+含量的熒光檢測方法。該方法線性范圍寬、檢測限低、檢測速度快，在實(shí)際樣品檢測中也表現(xiàn)良好，有望應(yīng)用于市場監(jiān)測。

樣品種類Cr3+加標(biāo)量（μmol/L）樣品1樣品2 024024實(shí)際Cr3+含量（μmol/L）8.41±0.0094 10.63±0.0190 12.45±0.0014 8.44±0.0022 10.81±0.0118 12.53±0.0502加標(biāo)回收率－111.21%101.32%－118.50%102.25%