趙華 劉瑞芳 姚水洪 左彭湘

學(xué)齡前期和學(xué)齡期是兒童語言發(fā)育和認(rèn)知發(fā)展的關(guān)鍵時期,而閱讀能力是此期兒童必須具備的能力。兒童發(fā)展性閱讀障礙(developmental dyslexia,DD)是一種先天性神經(jīng)發(fā)育障礙,這類兒童具有正常的智力和完好的感知力,享有均等的教育機(jī)會和相同的社會文化背景,同時在聽覺、視覺和神經(jīng)系統(tǒng)方面無明顯的器質(zhì)損傷,但閱讀成績明顯落后于同齡兒童水平,處于困難狀態(tài)[1]。不同的語系和人群背景,DD的陽性篩查率并不一致,從3.0%到20.0%不等[2,3]。閱讀能力喪失會直接影響兒童對知識的獲取,嚴(yán)重影響其自尊心、同伴關(guān)系和師生關(guān)系。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為DD是一種病因復(fù)雜的多基因遺傳性疾病,遺傳因素是導(dǎo)致DD的重要因素,大量研究[4-6]指出位于6號染色體上的KIAA0319是DD的候選基因,但不同的研究結(jié)果差異較大。鑒于此,本研究聚焦基因KIAA0319中被反復(fù)提及的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(single-nucleotide polymorphisms,SNPs),以浙江省衢州市的漢語DD兒童為研究對象,明確KIAA0319基因多態(tài)性和兒童DD的關(guān)聯(lián)性,為高風(fēng)險兒童的基因篩查和干預(yù)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象及分組 采用整群抽樣的方法,抽取浙江省衢州市2～6年級學(xué)生3 061名進(jìn)行調(diào)查,其中男生1 565名(51.13%),女生1 496名(48.87%)。所有參與調(diào)查的兒童均有監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書,本研究得到學(xué)校倫理委員會審批。DD兒童的納入標(biāo)準(zhǔn)為:①《兒童學(xué)習(xí)障礙篩查量表》[7]總分低于65分;②學(xué)習(xí)成績排在班級后10%;③《兒童漢語閱讀障礙量表》[8]得分高于平均分2個標(biāo)準(zhǔn)差以上;④《中國韋氏兒童智力量表》[9]智力測驗(yàn)得分≥80分;⑤無視覺、聽覺、知覺障礙和神經(jīng)系統(tǒng)病變。本研究共篩選出DD兒童168名,陽性率為5.49%(168/3 061)。其中男102例,女66例,年齡8～12歲,平均9.54±1.36歲。從研究群體中選取168名無閱讀障礙的兒童作為對照組,DD組和對照組兒童在性別、年級、年齡、智商等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 兩組兒童臨床資料

1.2研究方法

1.2.1SNPs選擇 基于本課題組前期進(jìn)行的Meta分析及在其他群體中的相關(guān)研究[5,10-12],本研究共納入基因KIAA0319的4個SNPs位點(diǎn):rs4504469、rs3212236、rs6935076、rs3756821。在HapMap中的基因變異資料,4個位點(diǎn)在漢族群體中最小等位基因頻率MAF≥0.05,r2≥0.8(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.2.2樣本采集 獲得兒童及其監(jiān)護(hù)人的知情同意,用一次性口腔黏膜拭子采集口腔黏膜脫落細(xì)胞:①采集前清水漱口1次;②用采樣拭子在兒童口腔兩側(cè)的頰黏膜處輕刮2～3次;③將采集到脫落細(xì)胞的拭子頭端浸入到盛有保存液的EP管中;④分門別類保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3DNA提取 從脫落細(xì)胞中提取基因組DNA:①在PCR管中加入300 μL的細(xì)胞裂解液,并將口腔黏膜拭子一并加入PCR管中;②水浴65℃,30 min后,加入蛋白酶,混勻后繼續(xù)水浴55℃,3 h;③加入蛋白沉淀劑渦旋振蕩20 s,繼續(xù)-20℃下冰浴5 min;④多次高速離心后,棄掉上清液,加入100 μL DNA水解酶,室溫下輕微震蕩12 h,短暫離心后轉(zhuǎn)移至儲存管。并用紫外分光光度計檢測DNA的純度和濃度[5]。

1.2.4基因分型 本試驗(yàn)按前期研究中[5]方法采用多重SNP 分型試劑盒進(jìn)行SNP分型,根據(jù)選擇的4個SNP合成特異引物并優(yōu)化連接反應(yīng)體系后組裝而成。為控制質(zhì)量,對隨機(jī)選擇的4% DNA質(zhì)量高的樣本進(jìn)行重復(fù)分析,每個SNP的存活率均在98%以上。

2 結(jié)果

2.1SNPs基本信息 基因KIAA0319的4個SNPs位點(diǎn)的基本信息見表2(https://regulome.stanford.edu/regulome-search),位點(diǎn)rs4504469和rs3212236的Regulome DB得分為5分,位點(diǎn)rs6935076和rs3756821的Regulome DB得分為4分,具有較高的研究價值。所有位點(diǎn)的基因型在對照組兒童中的分布均符合HWE(P>0.05),說明該研究選取樣本具有群體代表性。

表2 KIAA0319基因SNPs基本信息

2.2單個位點(diǎn)的等位基因頻率與閱讀障礙發(fā)生風(fēng)險分析 對納入研究的4個SNPs位點(diǎn)進(jìn)行等位基因頻率分析,顯示位點(diǎn)rs6935076(OR=1.660,95%CI:1.174～2.348,P=0.004)、位點(diǎn)rs3756821(OR=0.590,95%CI:0.426～0.817,P=0.001)、位點(diǎn)rs3212236(OR=1.468,95%CI:1.077～2.000,P=0.015)在病例組和對照組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對4個SNPs位點(diǎn)的等位基因頻率進(jìn)行Bonferroni校正檢驗(yàn),顯示位點(diǎn)rs6935076(P=0.023)和位點(diǎn)rs3756821(P=0.015)與閱讀障礙仍有顯著關(guān)聯(lián)(表3)。

表3 單個位點(diǎn)等位基因頻率與閱讀障礙的關(guān)聯(lián)性分析

2.3單個位點(diǎn)的基因型頻率與閱讀障礙發(fā)生風(fēng)險分析 對納入研究的4個SNPs位點(diǎn)進(jìn)行基因型頻率分析,結(jié)果顯示與位點(diǎn)rs6935076的基因型TT相比,此位點(diǎn)的基因型CC可顯著增加閱讀障礙的發(fā)病風(fēng)險(OR=1.941,95%CI:1.232～3.057,P=0.004);與位點(diǎn)rs3756821的基因型TT相比,此位點(diǎn)的基因型CC可顯著降低閱讀障礙的發(fā)病風(fēng)險(OR=0.321,95%CI:0.147～0.705,P=0.005);與位點(diǎn)rs3212236的基因型CC相比,rs3212236的基因型TT可顯著提升閱讀障礙的發(fā)病風(fēng)險(OR=2.065,95%CI:1.106～3.858,P=0.023)。對4個SNPs位點(diǎn)進(jìn)行Bonferroni校正檢驗(yàn),顯示rs3756821與閱讀障礙仍有顯著關(guān)聯(lián)(P=0.010)(表4)。

2.4單倍體關(guān)聯(lián)性分析 對基因KIAA0319的rs4504469、rs6935076、rs3756821、rs3212236四個位點(diǎn)進(jìn)行LD分析,結(jié)果顯示四個位點(diǎn)的|D′|均≥0.7(表5)。使用Haploview軟件進(jìn)行基因單倍型分析,四個位點(diǎn)形成1個單倍域,即Block1(Three-SNPs Haplotype:rs6935076-rs3756821-rs3212236),共有4種單倍體,頻率均大于0.05,其中單倍體CCC在所有單倍體中頻率最高,占全部樣本的40.6%,見圖1。用χ2檢驗(yàn)進(jìn)一步分析各單倍體與閱讀障礙的關(guān)聯(lián)性,顯示單倍體CCC和TTT在兩組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表6。

圖1 KIAA0319基因SNPs連鎖不平衡的單倍域圖|D′|值

表5 KIAA0319基因SNPs的連鎖不平衡分析結(jié)果

表6 KIAA0319基因SNPs組成的單倍體與DD的關(guān)系

3 討論

Cope等[13]對6號染色體進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)了rs4504469與DD的相關(guān)性,證實(shí)了KIAA0319是DD的易感候選基因。此后相關(guān)研究層出不窮,但主要是集中在歐洲等英語語系的研究[14,15],有學(xué)者[8,10,11,16]專注漢語DD的研究,有學(xué)者[1,5,12]在新疆維吾爾族兒童中也進(jìn)行維語語系的相關(guān)研究。大量研究均證實(shí)DD是遺傳因素、環(huán)境因素和其他相關(guān)因素共同作用的結(jié)果,并且遺傳因素占據(jù)主導(dǎo)作用[17]。但由于研究樣本大小不一致、研究語系的差異、研究方法的區(qū)別,關(guān)于DD候選基因KIAA0319的多態(tài)性研究結(jié)論并不一致,在維語語系和英語語系的研究結(jié)論并不一定適用于漢語語系。

本研究納入的KIAA0319基因的4個SNPs位點(diǎn)選擇主要依據(jù)Meta分析及在其他群體中的相關(guān)研究。Zou等[10]對歐洲人群的5項獨(dú)立研究實(shí)施Meta分析,發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)rs4504469與DD的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。Shao等[11]納入10項研究,進(jìn)行候選基因KIAA0319與DD關(guān)聯(lián)性分層Meta分析,揭示位點(diǎn)rs4504469在歐洲群體和亞洲群體中的作用正好相反。此外, Deng等[12]納入11項研究進(jìn)行系統(tǒng)評價,指出rs4504469、rs6935076、rs32122363個位點(diǎn)與閱讀障礙相關(guān)。而rs3756821在位置上與rs6935076、rs32122363位點(diǎn)接近,有研究[5]證實(shí)rs3756821是中國維吾爾族兒童DD障礙的易感位點(diǎn),且與上述兩個位點(diǎn)構(gòu)成的單倍域也與DD的發(fā)生密切相關(guān)。

本研究對KIAA0319基因的4個SNPs位點(diǎn)進(jìn)行遺傳多態(tài)性研究,發(fā)現(xiàn)KIAA0319基因rs6935076、rs3756821、rs3212236位點(diǎn)與DD存在相關(guān)性。rs3212236位點(diǎn)位于基因KIAA0319 5＇末端上游區(qū)域,Harold等[18]對英國牛津的264個家系樣本進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)rs3212236與閱讀障礙中的表型正字法的選擇存在高度相關(guān)性,后續(xù)研究[19]證實(shí)rs3212236的突變基因可以改變基因的表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致閱讀障礙。rs6935076位點(diǎn)位于基因KIAA0319的內(nèi)含子1上,研究者[20]推斷rs6935076可以調(diào)節(jié)基因的表達(dá),編碼的異常蛋白會導(dǎo)致左側(cè)大腦顳頂區(qū)域的白質(zhì)合成減少,降低兒童的閱讀能力。rs3756821位點(diǎn)位于基因KIAA0319的5′非翻譯區(qū),不直接改變基因的表達(dá),但對基因表達(dá)的調(diào)控作用會影響腦皮質(zhì)發(fā)育過程中神經(jīng)元的遷移及軸突的生長,導(dǎo)致不同腦區(qū)之間的錯誤連接[16]。

本研究使用Haploview軟件進(jìn)行基因單倍型分析,顯示四個位點(diǎn)的|D′|均≥0.7,為連鎖不平衡。且rs6935076、rs3756821、rs3212236三個位點(diǎn)形成1個單倍域,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)單倍體CCC和TTT與閱讀障礙的發(fā)生密切相關(guān)。LD是衡量等位基因在不同位點(diǎn)間相關(guān)性的指標(biāo),是多位點(diǎn)關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)的媒介,一般認(rèn)為,同一基因內(nèi)的多個位點(diǎn)聯(lián)合分析比單一位點(diǎn)分析結(jié)果更精確;但也有研究[21]指出如果構(gòu)成單倍域的位點(diǎn)突變過多,會產(chǎn)生錯誤的遺傳效應(yīng)。實(shí)際上,構(gòu)成單倍域的位點(diǎn)組合有多種形式,而攜帶風(fēng)險位點(diǎn)更多的單倍體更容易導(dǎo)致閱讀障礙。

通過發(fā)現(xiàn)風(fēng)險位點(diǎn)和單倍體,本研究證實(shí)KIAA0319是漢族兒童閱讀障礙的遺傳易感基因,揭示了DD的分子機(jī)制,為兒童DD早期預(yù)測、早期識別提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為其他類似多基因遺傳性疾病的研究提供思路。但本研究只限于若干有爭議的位點(diǎn),具有相對局限性,后續(xù)會進(jìn)一步擴(kuò)大基因和位點(diǎn)的選擇,爭取為閱讀障礙的研究提供更強(qiáng)有力證據(jù)。此外,本研究團(tuán)隊會繼續(xù)探討基因和基因的交互作用,以及基因和環(huán)境之間的交互作用與DD的關(guān)聯(lián)性,并且會在機(jī)制研究的基礎(chǔ)上,實(shí)施DD的干預(yù)和治療分析。