喻鳳香 陳 煦 林繼華 劉羽平 陳祖武 曾思景

（1. 湖南生物機電職業(yè)技術學院， 長沙 410127； 2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學院， 長沙 410125； 3. 隆回縣市場監(jiān)督管理檢驗檢測中心， 湖南 邵陽 422299）

食品在腌制過程中容易產(chǎn)生亞硝酸鹽， 亞硝酸鹽在人體內酸性環(huán)境下容易使亞鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白， 從而失去攜帶氧的功能， 導致人體組織缺氧， 引發(fā)急性中毒。 對成人而言， 攝入0.3～0.5 g 亞硝酸鹽即可引起中毒[1]。 且亞硝酸鹽能與胺類結合生成致癌的N-亞硝基化合物。 GB 2762-2022 《食品安全國家標準 食品中污染物限量》 規(guī)定了蔬菜及其制品中亞硝酸鹽限量為20 mg/kg （以亞硝酸鈉計）。 聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會 （Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives，JECFA） 建議亞硝酸鹽的每日允許攝入量（Acceptable daily intake， ADI 值） 為0.07 mg/kg bw[2]， 即體重為50 kg 的成年人， 每日攝入亞硝酸鹽的量不宜超過3.5 mg。

我國蔬菜生產(chǎn)量巨大， 蔬菜腌制品是其主要的加工產(chǎn)品， 但蔬菜腌制品的安全問題阻礙了其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。 各地加工工藝不盡相同， 缺乏系統(tǒng)的標準， 部分酸菜生產(chǎn)者質量安全意識淡薄， 導致腌制品安全品質得不到保障。 研究安全可靠的腌制品加工技術， 可為產(chǎn)品安全提供保障。 現(xiàn)有工藝技術主要通過添加有機酸、 利用亞硝酸鹽還原酶、 添加香辛料等物質、 接種乳酸菌、 優(yōu)選原料及調整發(fā)酵條件等方法來控制發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽。 但腌制發(fā)酵過程的生產(chǎn)環(huán)境復雜， 影響亞硝酸鹽含量的因素眾多， 實際生產(chǎn)中還應結合具體原料等進行控制[3]。我國居民以谷物為主食， 稻谷富含谷維素、 谷甾醇、 生育酚等活性成分。 其中，γ-谷維素具有清除自由基、 抗氧化、 降血脂、 降血糖、 抑制癌細胞生長、 調節(jié)中樞及心臟自主神經(jīng)等功能。 目前未見利用稻谷天然活性物質谷維素清除亞硝酸鹽類化合物的報道。 紫蘇是湖南省等地民間傳統(tǒng)腌制品制作過程中的養(yǎng)壇配料， 對其促進腌制品安全的機理研究較少。 本研究擬探究谷維素、 紫蘇對亞硝酸鈉化合物的消除能力情況， 以期為蔬菜腌制加工及居民膳食選擇提供重要參考。

一、 材料與方法

（一） 材料與試劑材料： 泡菜和酸菜材料為市售的新鮮豆角、 蘿卜， 烹飪蔬菜、 外婆菜原料為市售的新鮮空心菜、 白菜苔、 雪里蕻。

試劑： 亞鐵氰化鉀溶液 （106 g/L）、 乙酸鋅溶液 （220 g/L）、 飽和硼砂溶液 （50 g/L）、 氨緩沖溶液 （pH 9.6-9.7）、 鹽酸 （20%）、 對氨基苯磺酸溶液 （4 g/L）、 鹽酸萘乙二胺溶液 （2 g/L）、 食用酒精（95%）、 醋酸、 粉狀活性炭、 甲醇 （色譜純）、亞硝酸鈉標準使用液（5 μg/mL）。 亞硝酸納標準溶液（200 μg/mL）： CAS7632-00-0， 壇墨質檢科技股份有限公司。 谷維素： 純度≥99.9%， CAS11042-64-1， 瑞威爾生物科技有限公司。 模擬胃液： pH 1.5±0.1， 廣州臻萃質檢技術服務有限公司。

（二） 主要儀器UV1800PC 紫外可見分光光度計， 翱藝儀器（上海） 有限公司。

（三） 試驗方法

1. 亞硝酸鈉的檢測方法。 參考GB 5009.33《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》 格里斯試劑法， 具體操作為取樣品于料理機中打碎， 蘿卜可直接磨成勻漿， 豆角加入2 倍的水攪成勻漿， 稱樣量折算成原料質量。 平行取勻漿3份于燒杯中， 用70℃熱水少量多次沖洗燒杯中的樣品， 將其全部轉移到250 mL 的容量瓶中， 于80～100℃水浴中加熱15 min， 超聲儀超聲處理10 min， 保溫70℃， 搖床振蕩30 min。 加入5 mL 乙酸鋅和5 mL 亞鐵氰化鉀， 定容， 靜置30 min 使蛋白質沉淀。 移入250 mL 燒杯中， 加入2 g 粉狀活性炭， 充分攪拌除去色素， 過濾， 棄去初濾液20～30 mL， 其余濾液備用。 取濾液20 mL， 加入對氨基苯磺酸2 mL， 混勻， 靜置3～5 min 后， 加入鹽酸萘乙二胺1 mL， 加蒸餾水至刻度線， 混勻，靜置15 min。 538 nm 處測定吸光度。 標準曲線：取25 mL 比色管9 支， 分別加入5 μg/mL 的亞硝酸鈉標準使用液0、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.5、2.0、 2.5 mL， 其余同濾液處理。

2. 回收率設計。 另稱取勻漿5.00 g， 加入5 mL 5 μg/mL 的亞硝酸鈉標準使用液， 其余同樣品測定。 回收率＝100%× （C1-C0） /2。 式中，C1為加標回收試樣取20 mL 測得的亞硝酸鈉含量（μg）；C0為測定3 份試樣的平均值（μg）； 2 為20 mL 濾液中相當于加入的標準亞硝酸鈉量（μg）。

3. 谷維素、 紫蘇對蔬菜腌制品亞硝酸鈉的清除能力試驗。 按醬腌制品衛(wèi)生規(guī)范加工泡菜、 酸菜。 泡菜對照組每1 kg 原料， 加入2 kg 6%的鹽水、 400 mL 食用玉米酒精， 入壇發(fā)酵。 谷維素泡菜試驗組每1 kg 原料， 取10 g 谷維素， 用400 mL食用玉米酒精加熱溶解， 緩慢傾入2 kg 煮沸的鹽水（食鹽濃度6%）， 攪拌均勻， 冷卻后為泡菜液。紫蘇泡菜試驗組在裝料到一半時加入300 g 新鮮紫蘇。 酸菜對照組每2 kg 原料， 加入200 g 食鹽， 拌勻入壇發(fā)酵， 谷維素酸菜試驗組在食鹽中拌入10 g谷維素后入壇。 因紫蘇粉得率約為20%， 新鮮紫蘇加入量按10%， 紫蘇酸菜試驗組在對照組配比基礎上加入紫蘇粉40 g。 每隔24 h 監(jiān)測亞硝酸鈉含量。

4.外婆菜制作工藝。 采用自然晾曬失水的方式對蔬菜原料進行初步干燥， 晾曬程度以切碎后手捏成團為標準， 擠壓無可見流動水， 此時得率約為30%左右， 加入3%食鹽 （按鮮重） 腌制， 監(jiān)測其亞硝酸鈉含量變化情況。

5. 數(shù)據(jù)處理。 實驗數(shù)據(jù)結果分析使用Matlab 2014、 SPSS 17.0、 Excel 2010。

二、 結果與分析

（一） 亞硝酸鈉檢測的準確度和精密度樣品前處理采用水浴、 超聲、 振蕩結合的方法， 同時使用活性炭去除蔬菜中的色素影響， 不斷調整取樣量和定容體積， 使樣品吸光度的點落在標準曲線中間， 最終回收率為97.2%， 標準曲線相關系數(shù)達0.999 以上（見圖1）。 方法準確度和精密度均滿足后續(xù)食品檢測需求。

圖1 亞硝酸鈉測定標準曲線

（二） 蔬菜及其腌制品亞硝酸鈉含量監(jiān)測結果

1.蔬菜腌制品的亞硝酸鈉含量變化情況。 以湖南省當?shù)禺敿臼a(chǎn)的蔬菜為原料， 分別選取豆角、蘿卜制作成發(fā)酵性腌制品（泡菜） 和非發(fā)酵性腌制品 （干腌酸菜）， 并對其中的亞硝酸鈉含量進行監(jiān)測。 結果發(fā)現(xiàn)， 各類產(chǎn)品亞硝酸鈉含量變化均呈現(xiàn)一定的規(guī)律， 都有高峰值 （見圖2）， 其中泡菜豆角、 蘿卜中亞硝酸鈉含量高峰期及高峰值分別為第4 天7.94 mg/kg、 第1 天4.30 mg/kg， 干腌豆角、蘿卜中亞硝酸鈉含量高峰期及高峰值分別為第7 天1.27 mg/kg、 第3 天14.7 mg/kg， 均未超過GB 2762-2022 標準規(guī)定的20 mg/kg 限量。 同時研究發(fā)現(xiàn)， 干腌蔬菜制作過程中食鹽用量與成品亞硝酸鈉含量有一定關系， 當食鹽用量達到15%時， 亞硝酸鈉含量大都為1.5 mg/kg 以下， 而食鹽用量為10%時， 亞硝酸鈉含量接近15 mg/kg。 由此可見，按衛(wèi)生規(guī)范加工的腌制品其亞硝酸鈉含量均在國家標準允許的范圍內， 各品種蔬菜腌制品亞硝酸鈉含量高峰期和高峰值不盡相同， 且還受溫度制作參數(shù)等影響。 一般而言， 腌制品放置15 d 以后再食用更為安全。

圖2 豆角（A）和蘿卜（B）腌制過程亞硝酸鈉含量變化情況

2.自然存放蔬菜的亞硝酸鈉含量變化情況。 每隔24 h 監(jiān)測自然存放蔬菜的亞硝酸鈉含量， 結果表明， 新鮮蔬菜亞硝酸鈉含量較低， 存放過程中有所增加， 第1 天增加明顯， 之后較為平穩(wěn)， 在存放第6 天， 空心菜、 白菜苔、 雪里蕻中亞硝酸鈉含量分別為1.12、 1.26、 1.23 mg/kg （見表1）。 總體來看， 蔬菜存放過程亞硝酸鈉含量會上升， 但依然較低， 表明該指標是安全可控的。 按《中國居民膳食指南》， 成年人每日膳食蔬菜建議攝入量為400～500 g， 在此量下計算蔬菜存放多日攝入的亞硝酸鹽量遠遠沒有達到3.5 mg 的限量。 但存放過程還會引起萎蔫、 組織潰敗、 變色、 維生素等營養(yǎng)物質損失等， 故應盡早食用或加工。

表1 自然存放蔬菜亞硝酸鈉含量監(jiān)測結果（mg/kg）

3. 烹飪蔬菜的亞硝酸鈉含量變化情況。 烹飪蔬菜中亞硝酸鹽含量與新鮮蔬菜硝酸鹽含量高低有直接的關系。 有關鮮食蔬菜中硝酸鹽對人體健康安全的風險是一個有爭議的話題。 1973 年， 聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織制定了食品中硝酸鹽的限量標準，將蔬菜中硝酸鹽積累程度劃分為4 個等級， 最低為四級， 最高為一級， 具體如下： 四級， 硝酸鹽含量≥3100 mg/kg， 禁止食用； 三級， 硝酸鹽含量≤1440 mg/kg， 僅能熟食； 二級， 硝酸鹽含量≤785 mg/kg， 建議熟食或鹽漬； 一級， 硝酸鹽含量≤432 mg/kg， 允許生食。 無公害蔬菜的標準， 便是要達到一級甚至更高[4]。 湖南省根據(jù)蔬菜生產(chǎn)實際情況， 曾在DB43/T 152-2001 《蔬菜亞硝酸鹽限量衛(wèi)生標準》 中設定瓜果、 豆類蔬菜硝酸鹽含量不超過785 mg/kg 為合格， 葉菜、 根莖類蔬菜硝酸鹽含量不超過1440 mg/kg 為合格。 本研究測定的蔬菜原料硝酸鹽含量為3.0 mg/kg 左右。

在人們膳食當中， 80%以上的硝酸鹽來自蔬菜[5]， 生食蔬菜硝酸鹽具有轉換成亞硝酸鹽的風險。 但生食保留了較多的維生素C， 目前許多學者認為鮮食蔬菜富含的維生素C不僅可以抵消硝酸鹽的可能有害作用， 而且能顯著抑制亞硝酸鹽轉化為亞硝胺[6]。 烹制后的炒菜在冷藏的保存環(huán)境下， 亞硝酸鹽會自然生成[7]， 且損失維生素C。 但烹飪尤其是汆水過程會消耗掉部分的硝酸鹽。

本研究檢測了蔬菜烹飪前后及存放過程中亞硝酸鈉含量的變化， 以及食物被正常食用（污染） 后亞硝酸鈉含量的變化情況。 結果顯示， 空心菜、 白菜苔、 雪里蕻在烹飪后亞硝酸鈉含量無顯著變化（見表2）， 烹飪后未被食用的蔬菜在4℃冷藏24、48 h 后亞硝酸鈉含量有少量增加， 烹飪后被食用（污染） 的蔬菜放置24、 48 h 后其亞硝酸鈉含量稍有增加， 但均處于較低水平。 結果表明， 隔夜菜亞硝酸鹽超標風險極低， 但營養(yǎng)成分、 風味物質均會減少， 使用品質和營養(yǎng)品質均下降， 應盡快食用；污染后的烹飪蔬菜其亞硝酸鹽含量高于未污染烹飪蔬菜， 因此提倡使用公筷， 有效防止蔬菜被口腔細菌污染。

4.外婆菜制作過程亞硝酸鈉含量變化情況。 外婆菜制作過程一般有前期失水和后期發(fā)酵階段， 發(fā)酵階段會生成亞硝酸鹽。 晾曬過程失水嚴重， 若研究亞硝酸鈉含量的變化情況， 可折算到鮮重。 折算具體操作方法為取空心菜、 白菜苔、 雪里蕻各兩份， 每份約1 kg， 其中1 份用于計算蔬菜的失水率， 稱為失水組， 另1 份用于測定亞硝酸鈉， 稱為測定組。 兩組相同條件室溫存放， 測定組得到的亞硝酸鈉結果 （mg/kg） 乘以干燥率 （測定時失水組的質量/ 新鮮蔬菜質量）， 可轉換折算成鮮菜中亞硝酸鈉總量。 晾曬過程蔬菜的亞硝酸鈉含量變化情況見表3。 之后腌制過程亞硝酸鈉含量監(jiān)測結果顯示， 空心菜在腌制7 d 時亞硝酸鈉含量達到最大值4.0 mg/kg， 白菜苔在腌制9 d 時亞硝酸鈉含量達到最大值6.5 mg/kg， 雪里蕻在腌制15 d 時亞硝酸鈉含量達到最大值8.9 mg/kg， 之后迅速下降并趨于平穩(wěn)。 為了研究加工條件對亞硝酸鈉的影響， 另取1 組未清洗的雪里蕻作為對照， 結果發(fā)現(xiàn)亞硝酸鈉含量急劇增加。 未清洗雪里蕻樣品在腌制的第1、2、 3、 4、 5 天其亞硝酸鈉含量分別達到10.2、15.0、 18.6、 24.0、 81.0 mg/kg， 且第3 天后出現(xiàn)明顯異味和腐敗， 失去食用價值。 結果表明， 外婆菜在正常腌制過程中其亞硝酸鈉含量有所增加， 但均符合國家標準， 15 d 后食用更為安全； 衛(wèi)生條件不達標的情況下腌制， 亞硝酸鹽含量顯著增加， 有超標、 危害健康風險， 應嚴格遵守衛(wèi)生操作規(guī)范，注意場地、 用具、 操作人員、 原料、 配輔料等衛(wèi)生控制。

表3 晾曬過程蔬菜的亞硝酸鈉含量變化情況

（三） 谷維素對蔬菜腌制品中亞硝酸鈉的清除能力將谷維素加入泡菜液制作泡菜， 監(jiān)測其發(fā)酵過程亞硝酸鈉含量變化情況。 監(jiān)測結果顯示， 泡豆角對照組和試驗組均出現(xiàn)亞硝酸鈉含量峰值（見圖3A）， 分別為7.94 mg/kg （第4 天）、 1.75 mg/kg（第2 天）， 之后逐漸下降趨于平穩(wěn)， 偶有起伏， 但變化不大； 平穩(wěn)期亞硝酸鈉含量均處于1 mg/kg 以下， 整個發(fā)酵期亞硝酸鈉含量低于國家標準20 mg/kg 限量要求； 添加谷維素的試驗組的亞硝酸鈉含量小于對照組， 其中前5 d 由于對照組亞硝酸鈉含量高， 兩者差距明顯， 之后略低于對照組。 干法腌制豆角， 對照組與試驗組均在第7 天出現(xiàn)亞硝酸鈉含量峰值（見圖3B）， 分別為1.27 mg/kg 和1.24 mg/kg， 之后均下降， 并趨于平穩(wěn)。 添加谷維素的試驗組的亞硝酸鈉含量略低于對照組， 由于此條件下亞硝酸鈉本身含量低， 兩者差距并不明顯。 以蘿卜為原料制作泡菜， 對照組與添加谷維素的試驗組均在第1 天出現(xiàn)亞硝酸鈉含量峰值（見圖4A）， 對照組為4.30 mg/kg， 試驗組為3.30 mg/kg， 之后回落， 并趨于平穩(wěn)， 監(jiān)測期內谷維素試驗組的亞硝酸鈉含量略低于對照組。 以蘿卜為原料制作干腌酸菜， 對照組與試驗組均在第3 天出現(xiàn)亞硝酸鈉含量峰值 （見圖4B）， 對照組為14.7 mg/kg， 試驗組為13.5 mg/kg， 之后下降明顯， 第5 天降至0.5 mg/kg以下， 之后偶有小幅度變化， 但整體趨于平穩(wěn)， 谷維素試驗組的亞硝酸鈉含量均低于對照組， 說明谷維素對蔬菜腌制品中的亞硝酸鈉具有清除能力。

圖3 添加谷維素的泡豆角 （A） 和干腌豆角 （B） 試驗組與對照組的亞硝酸鈉含量變化情況

圖4 添加谷維素的泡蘿卜 （A） 和干腌蘿卜 （B） 試驗組與對照組的亞硝酸鈉含量變化情況

（四） 紫蘇對蔬菜腌制品中亞硝酸鈉的清除能力將新鮮紫蘇加入泡菜液制作泡菜， 監(jiān)測其發(fā)酵過程亞硝酸鈉含量變化情況。 結果顯示， 泡豆角對照組和試驗組均在第4 天出現(xiàn)亞硝酸鈉含量高峰（見圖5A）， 對照組為7.94 mg/kg， 試驗組為6.53 mg/kg， 之后逐漸下降， 第6 天后趨于平穩(wěn)， 偶有起伏， 但變化不大； 平穩(wěn)期亞硝酸鈉含量均處于1 mg/kg 以下， 整個發(fā)酵期低于國家標準20 mg/kg 的限量規(guī)定； 添加紫蘇的試驗組的亞硝酸鈉含量小于對照組， 其中第2 天、 第4 天由于對照組亞硝酸鈉含量高， 兩者差距明顯。 干法腌制豆角， 將紫蘇粉拌入食鹽中。 對照組與試驗組均在第7 天出現(xiàn)亞硝酸鈉含量峰值 （見圖5B）， 分別為1.27 mg/kg 和0.7 mg/kg， 之后均下降， 趨于平穩(wěn)。 添加紫蘇的試驗組亞硝酸鈉含量略低于對照組， 由于此條件下亞硝酸鈉本身含量低， 兩者差距并不顯著。 以蘿卜為原料制作泡菜， 對照組與添加紫蘇的試驗組均在第1 天出現(xiàn)亞硝酸鈉含量峰值 （見圖6A）， 對照組為4.30 mg/kg， 試驗組為3.30 mg/kg， 之后回落并趨于平穩(wěn)， 監(jiān)測期內紫蘇對照組的亞硝酸鈉含量均略低于對照組。 以蘿卜為原料的干腌酸菜， 用鹽量為10%， 其亞硝酸鈉含量監(jiān)測結果見圖6B。 對照組與試驗組均在第3 天出現(xiàn)亞硝酸鈉含量峰值， 對照組為14.7 mg/kg， 試驗組為3 mg/kg， 顯著低于對照組， 之后兩組均下降明顯， 整體趨于平穩(wěn)， 紫蘇試驗組的亞硝酸鈉含量均低于對照組。 上述結果說明紫蘇對蔬菜腌制品中的亞硝酸鈉具有清除能力。

圖5 添加紫蘇的泡豆角 （A） 和干腌豆角 （B） 試驗組與對照組的亞硝酸鈉含量變化情況

圖6 添加紫蘇的泡蘿卜 （A） 和干腌蘿卜 （B） 試驗組與對照組的亞硝酸鈉含量變化情況

三、 結論

本研究結果表明， 新鮮蔬菜中亞硝酸鈉含量極低， 自然條件存放有所增加， 但仍然較低。 蔬菜烹飪前后亞硝酸鈉含量無顯著變化， 烹飪后存放過程略有上升， 被口腔細菌污染（已食用） 的烹飪蔬菜比未食用的烹飪蔬菜在冷藏存放1 d 和2 d 后亞硝酸鈉含量略高， 但均在安全食用范圍內， 說明日常飲食使用公筷可減少剩余食物的亞硝酸鈉含量， 提高食用安全性。 濕腌泡菜、 干腌酸菜、 外婆菜在制作過程均會出現(xiàn)亞硝酸鈉含量高峰， 各品種高峰期和高峰值不同， 且受加工條件影響， 正常生產(chǎn)過程中產(chǎn)品的亞硝酸鈉含量均在國家標準限量值 （20 mg/kg） 以下， 但衛(wèi)生不達標的加工處理會導致亞硝酸鈉含量急劇增加。 此外， 本研究得出主食中谷維素、 配料紫蘇對亞硝酸鈉具有清除效果。