譚椰子 李 濤 王 玉 張紅妮 胡 鵬

（平?jīng)鍪惺称窓z驗檢測中心， 甘肅 平?jīng)?744000）

紅富士蘋果作為我國蘋果的主要品種[1]， 其產(chǎn)量占全國蘋果總產(chǎn)量的70%左右[2]。 然而， 近年來一些不法商家為牟取暴利， 在蘋果流通過程中摻雜摻假、 以次充好， 冒充國家地理標志保護產(chǎn)品， 這種行為不僅使生產(chǎn)者和消費者遭受經(jīng)濟損失， 還嚴重擾亂市場秩序， 而且增加了農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān)管難度[3～4]。 因此， 亟需開展紅富士蘋果產(chǎn)地溯源的相關(guān)研究， 為蘋果地理標志產(chǎn)品的品牌保護提供技術(shù)支撐， 保護生產(chǎn)者和消費者的合法權(quán)益， 促進蘋果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

目前， 國內(nèi)外學者對農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源的研究主要是利用同位素和無機礦質(zhì)元素在不同產(chǎn)地農(nóng)產(chǎn)品中的差異性進行產(chǎn)地判別， 基于品質(zhì)成分等進行相關(guān)研究較少。 而學者對于品質(zhì)成分的研究主要是基于蘋果中有機酸[5～8]、 酚類物質(zhì)[9～12]和抗壞血酸[13～16]等進行果品品質(zhì)分析， 對于蘋果中有機成分在不同產(chǎn)地間的差異性研究較少。 研究表明， 利用有機成分可以對農(nóng)產(chǎn)品進行產(chǎn)地溯源[17]。 蘋果中有機酸、 多酚和維生素C 等品質(zhì)成分的組成和含量在不同產(chǎn)地間會表現(xiàn)出一定差異特征[17]， 通過分析差異性可以在一定程度上達到蘋果產(chǎn)地溯源的目的。 本研究以甘肅省靜寧縣蘋果、 山東省煙臺市蘋果和陜西省洛川縣蘋果為研究對象， 采用高效液相色譜方法（High performance liquid chromatography，HPLC）， 對紅富士蘋果的品質(zhì)成分（有機酸、 多酚和抗壞血酸） 的含量進行檢測， 利用單因素方差分析、 主成分分析 （Principal component analysis，PCA）、 偏最小二乘法判別分析（Partial least squares discriminant analysis， PLS-DA） 和線性判別分析法研究3 個產(chǎn)地紅富士蘋果品質(zhì)成分的差異特性，探討利用品質(zhì)成分對紅富士蘋果產(chǎn)地溯源的可行性， 以期為蘋果產(chǎn)地溯源和蘋果品質(zhì)控制提供參考依據(jù)。

一、 材料與方法

（一） 材料與試劑本研究所用95 份蘋果樣品采自甘肅靜寧、 山東煙臺和陜西洛川紅富士果園，其中甘肅靜寧蘋果樣品32 份、 山東煙臺蘋果樣品36 份、 陜西洛川蘋果樣品27 份。

草酸、 琥珀酸、 酒石酸、 檸檬酸、 蘋果酸、 乙酸、 乳酸、 富馬酸、 異檸檬酸、 甘油酸、 乙醛酸、草酰乙酸和奎寧酸標準物質(zhì) （純度99%， 天津阿爾塔科技有限公司）； 兒茶素、 根皮苷、 綠原酸、蘆丁、 表兒茶素、 槲皮素、 沒食子酸、 表兒茶酸、對香豆酸、 二氫查耳酮和抗壞血酸標準物質(zhì)（純度99%， 壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）。

（二） 儀器與設(shè)備TLE 千分之一電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］； T25 高速勻漿機、 KS4000 艾卡可控溫振蕩搖床、 RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、 Vortex-Genie 2 旋渦混合器（艾卡廣州儀器設(shè)備有限公司）； SPE-12A 固相萃取裝置（北京成萌偉業(yè)科技有限公司）； CTH2050R 臺式高速冷凍離心機 （湖南赫西儀器裝備有限公司）；LC-20AT 高效液相色譜儀（島津中國有限公司）。

（三） 實驗方法有機酸的檢測參照GB 5009.157-2016 《食品安全國家標準 食品中有機酸的測定》； 草酸含量的檢測根據(jù)郭燕等[18]的方法改動前處理部分， 改為均質(zhì)、 超聲、 離心、 殘渣再超聲、 離心、 合并上清液至100 mL 容量瓶中， 過0.45 μm 水膜， 上機； 多酚的檢測參照NY/T 2795-2015 《蘋果中主要酚類物質(zhì)的測定 高效液相色譜法》； 抗壞血酸的檢測參照GB 5009.86-2016 《食品安全國家標準 食品中抗壞血酸的測定》 第一法。

（四） 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法運用Excel 對數(shù)據(jù)進行整理， 采用SPSS 26 軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析， 利用SIMCA-P 14.1 軟件做PCA 和PLS-DA， 將特征指標錄入SPSS 26 軟件進行判別分析。

二、 結(jié)果與討論

（一） 紅富士蘋果中有機酸、 多酚和抗壞血酸含量及差異性分析對甘肅靜寧、 山東煙臺和陜西洛川共95 份紅富士蘋果樣本中兒茶素、 表兒茶素、根皮苷、 槲皮素、 綠原酸、 蘆丁、 對香豆酸、 沒食子酸、 表兒茶酸、 二氫查耳酮、 抗壞血酸、 草酸、琥珀酸、 酒石酸、 檸檬酸、 蘋果酸、 乙酸、 乳酸、富馬酸、 異檸檬酸、 甘油酸、 乙醛酸、 草酰乙酸和奎寧酸共24 種品質(zhì)成分進行檢測。 在大多數(shù)蘋果樣本中， 有機酸中異檸檬酸、 甘油酸、 乙醛酸、 草酰乙酸和奎寧酸未檢出， 多酚物質(zhì)中沒食子酸、 表兒茶酸和二氫查耳酮均未檢出， 檢出成分含量（用平均值±標準差表示） 見表1。

表1 不同產(chǎn)地紅富士蘋果中品質(zhì)成分含量比較分析

由表1 可知， 檢出指標中蘋果酸含量最高， 平均含量在2997.71～3375.05 mg/kg 之間， 是紅富士蘋果中有機酸的主要種類之一， 其次是綠原酸（86.25～135.42 mg/kg） 和琥珀酸 （53.52～128.20 mg/kg）。 對香豆酸和富馬酸在所有品質(zhì)成分中含量相對較低， 并且這兩種成分在3 地蘋果中均表現(xiàn)出較大程度離散， 這可能是因為蘋果個體差異較大，也可能是因為其在蘋果中的狀態(tài)和分布具有一定差異。 蘋果中品質(zhì)成分差異性分析表明， 兒茶素、 根皮苷、 槲皮素、 綠原酸、 蘆丁、 抗壞血酸、 草酸、琥珀酸、 酒石酸、 檸檬酸、 蘋果酸、 乙酸、 乳酸等13 種品質(zhì)成分的含量在不同產(chǎn)地紅富士蘋果間具有差異性（p＜0.05）， 這可能與蘋果產(chǎn)地的氣候[19～20]、土壤環(huán)境及果園管理[21～22]等因素有關(guān)， 而這些影響因素在一定區(qū)域內(nèi)基本趨同， 因此這些差異性指標攜帶了一定的產(chǎn)地信息， 可以利用其對蘋果進行產(chǎn)地溯源。

（二） 紅富士蘋果差異性品質(zhì)成分PCA為了驗證差異性品質(zhì)成分用于紅富士蘋果產(chǎn)地判別的可行性， 對95 份蘋果樣本的13 種差異性指標進行PCA。 根據(jù)方差累積解釋率＞80%原則， 選取可以包含較多產(chǎn)地信息的前7 個主成分 （見表2）。 載荷系數(shù)絕對值大于0.4 的表示該指標對該主成分貢獻力較大， 其中第1 主成分包含了30.177%的分組信息， 兒茶素、 槲皮素、 綠原酸、 蘆丁、 抗壞血酸、 草酸、 琥珀酸、 酒石酸、 乙酸和乳酸對第1 主成分的貢獻力最強； 第2 主成分方差解釋率為12.368%， 主要包含了酒石酸、 檸檬酸和蘋果酸的分組特征信息； 第3 主成分主要代表了根皮苷、 草酸和蘋果酸指標； 第4 主成分代表了草酸和乳酸；第5 主成分代表了槲皮素； 第6 主成分代表了乳酸。 前2 個主成分中涵蓋了所有品質(zhì)成分指標。 為方便可視化， 利用前2 個主成分得分做散點圖（見圖1）。 從圖1 看， 3 個產(chǎn)地蘋果樣本雖然在一定程度上實現(xiàn)了分組， 但是分離度較差， 邊際重疊， 尤其是靜寧蘋果有一部分距離聚類中心較遠。 因此，利用這13 種品質(zhì)成分對紅富士蘋果進行產(chǎn)地判別具有一定的可行性， 但是數(shù)據(jù)冗余復雜， 干擾較多， 分類效果不理想， 需進一步優(yōu)化分析。

圖1 紅富士蘋果品質(zhì)成分PCA 得分圖

表2 主成分載荷系數(shù)

（三） 紅富士蘋果差異性品質(zhì)成分PLS-DA不同于PCA， PLS-DA 是一種有監(jiān)督變量的分析方法， 可以有效篩除部分重疊信息， 并且可以根據(jù)變量在主成分的重要性投影篩選出分組貢獻力強的特征指標， 利用這些指標進行分析可以降低干擾和分析維度[23]。 對95 份蘋果樣品中差異性顯著 （p＜0.05） 的13 種品質(zhì)成分進行PLS-DA，X軸累積解釋率R2X＝0.673，Y軸累積解釋率R2Y＝0.732，模型累積預測率Q2＝0.689， 均大于0.6， 說明有效降低了干擾和分析維度。 樣本在二維得分散點圖（見圖2） 分組效果明顯優(yōu)于PCA， 樣本離散度變小， 3 個產(chǎn)地的蘋果樣品基本分布在不同區(qū)域。 以變量重要性投影（Variable importance in projection，VIP） 值＞1 為條件[24]， 共篩選出7 種分組能力較強的品質(zhì)成分 （見圖3）， VIP 值由大到小依次為酒石酸、 蘆丁、 根皮苷、 綠原酸、 琥珀酸、 抗壞血酸和乙酸。 但這7 種特征指標對紅富士蘋果樣品的產(chǎn)品判別效果無法量化， 仍需進一步驗證。

圖2 紅富士蘋果品質(zhì)成分PLS-DA 得分圖

圖3 紅富士蘋果品質(zhì)成分PLS-DA 的VIP 值

（四） 紅富士蘋果品質(zhì)成分線性判別分析線性判別是將標記有分類組別的若干數(shù)量特征投影到一條直線， 根據(jù)該直線上樣本投影值達到類別間的距離來確定線性判別函數(shù)的系數(shù)， 從而建立線性判別函數(shù)[25]。 為了進一步分析酒石酸、 蘆丁、 根皮苷、 綠原酸、 琥珀酸、 抗壞血酸和乙酸這7 種品質(zhì)成分的產(chǎn)地判別效果， 對95 份樣本的這7 種指標做線性判別分析。

以全部樣本建立判別函數(shù)， 采用“留一法” 進行交叉驗證， 結(jié)果見表3， 所建模型判別率為98.9%， 交叉驗證的準確率達96.8%。 訓練集中，有1 個陜西洛川蘋果誤分到了山東煙臺分組， 驗證集中， 2 個陜西洛川蘋果樣品分別被誤判到山東煙臺和甘肅靜寧分組， 1 個甘肅靜寧蘋果樣品誤判到陜西洛川分組。 造成誤判可能與樣本個體差異有關(guān)， 表現(xiàn)為樣本的部分指標所表達的產(chǎn)地信息與實際不符， 其所表達的產(chǎn)地信息可能受到樹種、 施肥和氣候等因素的影響。 有研究表明， 同地區(qū)不同品種的蘋果中品質(zhì)成分也存在一定差異[26]， 而本研究為考慮覆蓋范圍， 涉及宮崎短枝、 煙富3 號、 長富2號等多個紅富士品種。 全部樣本建立的判別函數(shù)為：

表3 判別分析分類結(jié)果a，b

式中，Y甘肅靜寧、Y山東煙臺、Y陜西洛川分別為甘肅靜寧、 山東煙臺和陜西洛川產(chǎn)地的紅富士蘋果的判別函數(shù)值；X根皮苷、X綠原酸、X蘆丁、X抗壞血酸、X琥珀酸、X酒石酸、X乙酸分別為蘋果中根皮苷、 綠原酸、 蘆丁、抗壞血酸、 琥珀酸、 酒石酸和乙酸含量（mg/kg）。

同時隨機選取70%樣本作為訓練集建立判別函數(shù)， 30%樣本數(shù)據(jù)檢驗函數(shù)準確性， 結(jié)果見表4。 模型驗證測試集的準確率均為100%， 訓練集的準確率均大于88%， 其中2 個陜西洛川的蘋果樣品分別被誤判為甘肅靜寧和山東煙臺產(chǎn)地。 相較于全部樣本進行訓練， 模型的判別率和驗證率均有改變， 說明樣本量的變化會對模型穩(wěn)定性產(chǎn)生影響， 而訓練集樣本量的降低減小了模型適應范圍，導致預測準確率下降。

表4 70%樣本訓練分組及預測結(jié)果

綜合兩種方法所建模型可以看出， 兩個模型對3 個產(chǎn)地紅富士蘋果的產(chǎn)地判別和驗證正確率均超過88%， 說明基于酒石酸、 蘆丁、 根皮苷、 綠原酸、 琥珀酸、 抗壞血酸和乙酸這7 種品質(zhì)成分對3個產(chǎn)地紅富士蘋果進行產(chǎn)地判別較為穩(wěn)定可靠， 在一定程度上能夠判別紅富士蘋果的產(chǎn)地。

三、 結(jié)論

本研究以甘肅靜寧、 山東煙臺和陜西洛川3 個產(chǎn)地的紅富士蘋果為研究對象， 利用高效液相色譜儀測定有機酸、 多酚和抗壞血酸共24 種品質(zhì)成分的含量， 結(jié)合多元統(tǒng)計分析構(gòu)建紅富士蘋果產(chǎn)地判別模型， 探討基于品質(zhì)成分含量差異的蘋果原產(chǎn)地判別的可行性。 結(jié)果表明， 基于差異性成分指標對不同產(chǎn)地的蘋果進行產(chǎn)地分類具有一定的可行性，利用PLS-DA 篩選出的酒石酸、 蘆丁、 根皮苷、綠原酸、 琥珀酸、 抗壞血酸和乙酸7 種品質(zhì)成分可對3 個產(chǎn)地蘋果進行一定程度的產(chǎn)地區(qū)分， 所建判別函數(shù)的判別和驗證正確率均超過88%。

本研究在前人研究的基礎(chǔ)上， 將PCA、 PLSDA 與線性判別分析相結(jié)合， 利用品質(zhì)成分對蘋果進行產(chǎn)地溯源分析， 研究結(jié)論可為紅富士蘋果的產(chǎn)地判別提供理論依據(jù)， 也可為蘋果品質(zhì)控制提供技術(shù)支撐。 但基于品質(zhì)成分在蘋果生長和流通過程中穩(wěn)定性不強的特征， 進行蘋果產(chǎn)地溯源模型的研究時， 要綜合考慮蘋果成熟度、 貯藏條件和周期等因素， 同時需要與礦質(zhì)元素、 同位素和香氣成分等其他指標相結(jié)合， 來進一步提升產(chǎn)地判別模型的準確度和適應性。