何 歡，汪緒珍，陳紹依，劉鴻安，周鴻翔*

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州茅臺（集團）生態(tài)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，貴州貴陽 550025）

藍莓(Vaccinium uliginosumL.)，杜鵑花科越橘屬植物，外觀呈藍紫色，果實小，常有一層白色果粉包裹。藍莓果實均重0.5～2.5 g，酸甜可口，不僅可以鮮食，也可以加工成果汁、果酒等其他產(chǎn)品[1]。藍莓果實除含有豐富的糖、氨基酸、有機酸、維生素和礦物質(zhì)外，還富含多種功能性成分，抗氧化能力比一般的水果強，具有較高的營養(yǎng)和藥用價值，是人類五大健康食品之一，也是“世界第三代水果”[2-3]。藍莓種植面積逐年增加，產(chǎn)生了果汁、果酒等衍生加工產(chǎn)業(yè)[4]，企業(yè)加工時會產(chǎn)生大量果渣，如果能對果渣進行合理再利用，不僅可以節(jié)約資源，還可避免環(huán)境污染[5-6]。本研究以藍莓果渣為原料研究藍莓果渣白蘭地釀造工藝，內(nèi)容包括菌種的選擇、接種量、不同初始糖含量、發(fā)酵溫度，比較藍莓果渣白蘭地的理化指標(biāo)、感官評價，確定藍莓果渣白蘭地的最佳生產(chǎn)工藝，為藍莓果渣白蘭地的釀造提供可行性的生產(chǎn)技術(shù)方案，利用藍莓果渣生產(chǎn)白蘭地不僅是一種經(jīng)濟產(chǎn)品，還解決了藍莓果渣剩余問題，豐富了國內(nèi)白蘭地市場[7]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 原料與菌株

藍莓果渣、濃縮蘋果汁，貴州茅臺（集團）生態(tài)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司；安琪酵母、F33 酵母，市售；異常維克漢姆酵母K-008，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室鑒定保藏；漢遜德巴利酵母，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室鑒定保藏。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉，重慶川東化工有限公司；酒石酸鉀鈉，成都金山化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖，天津永大化學(xué)試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；結(jié)晶酚，成都金山化學(xué)試劑有限公司；亞硫酸氫鈉，成都金山化學(xué)試劑有限公司；硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液，廣州和為醫(yī)藥科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備BSA124S-CW 電子天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；1000 mL 全玻璃蒸餾器，杭州旌斐儀器科技有限公司；酒精計，杭州旌斐儀器科技有限公司；HH-21-6 電熱恒溫水浴鍋，上海助藍儀器科技有限公司；SW-CJ-1FD 超潔凈工作臺，海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SPX-250B-Z 生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；YXQ-75S11 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZQPL-200立式全溫震蕩培養(yǎng)箱，天津菜玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；500 mL、1000 mL數(shù)顯電熱套，杭州旌斐儀器科技有限公司；BCD-640WAGM冰箱，青島海爾股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 藍莓果渣白蘭地的加工工藝流程及操作要點

原料→調(diào)配(加糖、加水)→接種酵母→發(fā)酵→原料酒→蒸餾→原白蘭地

操作要點：

接種：異常威克漢姆酵母K-008、漢遜德巴利酵母活化，將裝有菌株的-80 ℃甘油管劃線于YPD固體平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h 后，將平板上的單菌落挑至100 mL 滅菌的麥芽汁培養(yǎng)基中，30 ℃下120 r/min 培養(yǎng)48 h，使培養(yǎng)基中細胞數(shù)達到1×108CFU/mL，備于接種。安琪酵母、F33 酵母活化，稱取適量的活性干酵母，加入含糖5 %的無菌溶液，混勻，于35 ℃水浴鍋中保溫20～30 min，直至產(chǎn)生大量泡沫[8]。

發(fā)酵：在藍莓果渣中添加濃縮蘋果汁和水進行發(fā)酵液調(diào)配，采用1 L 三角瓶作為發(fā)酵容器，水封閥密封，放入恒溫生化培養(yǎng)箱進行發(fā)酵[9]。

發(fā)酵液的蒸餾：使用1000 mL電熱套及1000 mL全玻璃蒸餾器進行蒸餾，蒸餾時的溫度控制在90 ℃±2 ℃，只收集45%vol以上的酒精[10-11]。

1.2.2 不同酵母菌株對藍莓果渣白蘭地的影響

取一定量的藍莓果渣，加水及濃縮蘋果汁，調(diào)整發(fā)酵液初始糖含量為216 mg/mL。分別按照0.3 g/L 接種量添加活化好的F33、安琪、K-008、漢遜德巴利酵母，搖勻，28 ℃恒溫主發(fā)酵，酒精發(fā)酵結(jié)束后，測定發(fā)酵液的各項理化指標(biāo)，使用全玻璃蒸餾器蒸餾出原白蘭地，綜合比較不同酵母釀造藍莓果渣白蘭地的出酒率、感官評分，確定釀造藍莓果渣白蘭地的最佳酵母。

1.2.3 藍莓果渣白蘭地釀造工藝優(yōu)化的單因素試驗

在篩選出最佳酵母的基礎(chǔ)上，設(shè)置酵母接種量（0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L），發(fā)酵溫度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃），初始加糖量（180 mg/mL、198 mg/mL、216 mg/mL、236 mg/mL、252 mg/mL），測定原白蘭地的出酒率并進行感官評分。以出酒率、感官評分為評價指標(biāo)考察初始含糖量、接種量、發(fā)酵溫度3因素對藍莓果渣白蘭地的影響。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化藍莓酒釀造工藝

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取顯著因素的最優(yōu)試驗范圍，以藍莓果渣白蘭地感官評分為優(yōu)化指標(biāo)，對初始加糖量、接種量、發(fā)酵溫度3 個影響因素利用Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計模型開展響應(yīng)面分析，獲取最適發(fā)酵工藝參數(shù)。響應(yīng)面模型因素與水平設(shè)計見表1。

表1 因素水平設(shè)計表

1.2.5 分析檢測

酒精度、總酸按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[25]中的方法進行測定；還原糖測定，3,5-二硝基水楊酸比色法[12]。

藍莓果渣白蘭地出酒率計算公式如下[13]：

原料出酒精率(mL/kg)=(初蒸餾液酒精度(%vol)×初蒸餾收集液體積(mL))/原料使用量(kg)

藍莓果渣白蘭地感官評價參照GB/T 11856—2008《白蘭地》[14]中的方法進行，男女各10名具有果酒品評經(jīng)驗的人員對藍莓果渣白蘭地的色澤、香氣、滋味、典型性進行評分，結(jié)果采用均值。感官評分表見表2。

表2 藍莓果渣白蘭地感官評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016、SPSS19.0 進行數(shù)據(jù)處理，采用Origin9.0 進行繪圖，使用Design Expert 8.0.6 軟件繪制回歸模型及響應(yīng)面分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母菌株對藍莓果渣白蘭地的影響

2.1.1 不同酵母的發(fā)酵性能

觀察并記錄4 種酵母發(fā)酵時的劇烈程度，發(fā)酵結(jié)束時測定藍莓果渣白蘭地原料酒的酒精度、殘?zhí)恰⒖偹?，結(jié)果見表3。

表3 不同酵母發(fā)酵性能比較

一般來說選擇起酵時間短、發(fā)酵平穩(wěn)、發(fā)酵結(jié)束時殘?zhí)堑?、產(chǎn)酒率高的酵母作為藍莓果渣白蘭地原料酒的發(fā)酵菌種[15]。在初始糖度一致的條件下，發(fā)酵結(jié)束時的殘?zhí)窃降停f明酵母菌轉(zhuǎn)化還原糖能力越強。比較發(fā)酵液殘?zhí)恰⒕凭龋? 種酵母存在顯著性差異（α=0.05），F(xiàn)33 發(fā)酵樣品的殘?zhí)亲畹颓揖凭茸罡?，顯著優(yōu)于其他3種酵母。

2.1.2 不同酵母對藍莓果渣白蘭地的影響

圖1 不同菌種對藍莓果渣白蘭地的影響

不同菌種發(fā)酵藍莓果渣白蘭地出酒率從高到低依次是F33、安琪、K-008、漢遜德巴利酵母，藍莓果渣白蘭地感官評分從高到低依次是F33、K-008、安琪、漢遜德巴利酵母。綜合發(fā)酵性能、產(chǎn)酒率、風(fēng)味影響，F(xiàn)33 最合適作為藍莓果渣白蘭地的發(fā)酵菌種。

2.2 初始加糖量對藍莓果渣白蘭地的影響

由圖2 可知，藍莓果渣白蘭地出酒率隨初始加糖量的增加逐漸升高，可能是隨著加糖量的增多，可用于發(fā)酵的糖的總量增加，發(fā)酵蒸餾后得到的白蘭地酒液也就越多[16]。感官評分隨初始加糖量的增加先升后降，初始加糖量為180 mg/mL和198 mg/mL 時發(fā)酵速度較快且發(fā)酵提前結(jié)束，糖大部分轉(zhuǎn)化為酒精，但發(fā)酵過程中產(chǎn)生香氣成分等物質(zhì)的基質(zhì)不足，造成酒體風(fēng)味寡淡；糖含量合適時，發(fā)酵液中酵母生長正常，代謝正常，使發(fā)酵過程平穩(wěn)進行；初始加糖量為236 mg/mL、252 mg/mL 時能得到較高的出酒率，但初始加糖量過高會使殘?zhí)窃黾樱l(fā)酵液的滲透壓增大，抑制酵母菌的生長繁殖，延長了酵母菌的生長適應(yīng)期，增加了雜菌污染的風(fēng)險，不利于香氣物質(zhì)積累[17]。從感官評價這一指標(biāo)看，初始糖含量為216 mg/mL 時的感官評分最高，初始加糖量太高意味著調(diào)整糖度時所添加的濃縮蘋果汁增多，藍莓果香、口感會受到影響。綜上，藍莓果渣白蘭地發(fā)酵的初始加糖量應(yīng)該選擇216 mg/mL。

圖2 不同初始加糖量對藍莓果渣白蘭地的影響

2.3 接種量對藍莓果渣白蘭地的影響

果酒發(fā)酵是在酵母作用下，經(jīng)EMP 途徑酵解生成丙酮酸，在無氧條件下經(jīng)脫羧酶脫羧轉(zhuǎn)化為乙醛，再由乙醛脫氫酶還原成乙醇的過程，酵母接種量影響發(fā)酵速度[18]。如圖3 所示，出酒率總體上隨著酵母接種量的增加緩慢上升，感官評分先升高后下降。接種量為0.1 g/L時無法保證酒精積累，發(fā)酵不完全并且殘?zhí)橇窟^高，發(fā)酵周期較長，雜菌污染的可能性增大[19]；隨著酵母菌含量增加，其生長繁殖速度加快，無氧呼吸產(chǎn)生的酒精增多，出酒率升高，消耗的糖也增多[20]；當(dāng)酵母接種量過多時，發(fā)酵液中的酵母菌濃度高，代謝副產(chǎn)物逐漸增多，酒香逐漸增加，但“酵母味”也相應(yīng)增加，藍莓原有的果香味逐漸被掩蓋。綜上，藍莓果渣白蘭地的最佳酵母接種量為0.3 g/L。

圖3 接種量對藍莓果渣白蘭地的影響

2.4 溫度對藍莓果渣白蘭地的影響

溫度通過影響酶的活性、細胞質(zhì)膜的流動性以及物質(zhì)的溶解度等影響酵母菌的正常生長[21]。由圖4 分析可知，出酒率先升后降，低溫時酵母菌代謝能力不強，糖分利用不完全，出酒率低；溫度升高至26 ℃、28 ℃時，酶活性增強，消耗糖分增多，出酒率升高；當(dāng)溫度升高到30 ℃時，溫度過高使得酵母過早的老化，代謝能力下降，導(dǎo)致出酒率降低[22]。隨發(fā)酵溫度的升高，感官評分呈現(xiàn)下降的趨勢；相同接種量條件下，溫度升高，酒精的發(fā)酵變強，發(fā)酵體系可能產(chǎn)生內(nèi)熱影響酵母的生長繁殖，不利于發(fā)酵過程中香氣物質(zhì)的積累，導(dǎo)致藍莓果香味不強，并伴隨少量的雜味[23-24]。因此，藍莓果渣白蘭地發(fā)酵溫度選擇28 ℃為宜。

圖4 不同溫度對藍莓果渣白蘭地的影響

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化藍莓果渣白蘭地發(fā)酵工藝

2.5.1 Box-Behnken響應(yīng)面實驗結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇酵母接種量（g/L）、初始加糖量（mg/mL）及發(fā)酵溫度（℃）3個因素進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，以藍莓果渣白蘭地感官品評得分為響應(yīng)指標(biāo)，采用Design Expert 8.0.6 設(shè)計三因素三水平的Box-Behnken 試驗。Box-Behnken 試驗設(shè)計與結(jié)果如表4所示。

表4 響應(yīng)面實驗設(shè)計結(jié)果

2.5.2 響應(yīng)面模型建立及方差分析

Design-Expert 8.0.6 分析軟件對表4 的實驗數(shù)據(jù)和結(jié)果進行了多元回歸擬合分析，得到了藍莓果渣白蘭地感官品評(Y)與編碼自變量酵母接種量(A)、初始加糖量(B)及發(fā)酵溫度(C)的二次多項回歸數(shù)學(xué)模型：

感官評分（Y）=+78.02+0.74A+0.49B-0.92C+1.90AB+2.68AC+1.83BC-5.38A2-6.73B2-5.01C2

由表5 可知，相關(guān)系數(shù)R2=0.9955、R2adj=0.9896，模型P 值＜0.01（模型極顯著），失擬項P 值為0.5098＞0.05（不顯著），證明該回歸模型方程擬合度較好，誤差小，可行性高，能用于本試驗的預(yù)測分析。一次項A、B、C 顯著（P＜0.05），交互項AC極顯著（P＜0.01）,AB、BC 顯著（P＜0.05），二次項A2、B2、C2極顯著（P＜0.01），由F 值可知，對感官評分影響的排序為：發(fā)酵溫度（C）＞酵母接種量（A）＞初始加糖量（B）。各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖5。由圖5 可知，發(fā)酵溫度、酵母接種量、初始加糖量之間的交互作用對藍莓果渣白蘭地感官評分影響的響應(yīng)面均呈現(xiàn)傘狀，有最高點，等高線均呈現(xiàn)橢圓形，說明各因素間交互作用對藍莓果渣白蘭地的感官評分影響顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖5 各因素交互作用對對藍莓果渣白蘭地感官評分影響的響應(yīng)曲面及等高線

表5 響應(yīng)面回歸模型方差分析

2.5.3 驗證試驗

經(jīng)Design-Expert 8.0.6 分析軟件得到的最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度28 ℃、初始糖度217 mg/mL，酵母菌接種量0.3 g/L。為驗證此工藝的準(zhǔn)確性，按其參數(shù)進行驗證試驗，得到的藍莓果渣白蘭地感官評分為77.63±0.25，與預(yù)測值78.02接近，誤差較小，證明響應(yīng)面模型擬合效果較好，可用于藍莓果渣白蘭地的實際生產(chǎn)。

3 結(jié)論

本試驗以藍莓果渣為原料，以F33 酵母作為發(fā)酵菌種，通過單因素試驗及響應(yīng)面試驗對藍莓果渣白蘭地的釀造工藝進行了優(yōu)化，得出藍莓果渣白蘭地的最優(yōu)釀造工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度28 ℃、初始糖度217 mg/mL，酵母菌接種量0.3 g/L，此條件下得到的藍莓果渣白蘭地感官評分為77.63 分±0.25 分，果香酒香濃郁，風(fēng)味典型。本方法具有良好的應(yīng)用前景，可為藍莓果渣進一步加工利用提供依據(jù)。