孫 寧，修福曉，李新鳴，張加鑫，郞文萱，徐 澍，俞 曦，周媛婷，榮勤雙，孟奕祥，范本旭，曲藝鳴，朱啟文

（1.中國刑事警察學院，沈陽，110048；2.沈陽醫(yī)學院遼寧省行為認知重點實驗室，沈陽，110034；3.安徽省銅陵市公安局，銅陵，244000；4.上海市公安局刑事偵查總隊警犬隊，上海，201799）

近幾年，松鼠（Sciurus vulgaris）成為新興異寵，因其溫馴可愛、小巧便攜和干凈衛(wèi)生，越來越受歡迎。但由于松鼠人工馴養(yǎng)時間較短，對其品種、飼養(yǎng)條件、行為、疾病防治和健康福利知之甚少［1］。松鼠的臨床癥狀不易被察覺，診斷難度大，患病松鼠來不及治療會出現(xiàn)急性死亡。d’Ovidio 等［2］調查統(tǒng)計，63% 松鼠會有健康問題，尤其是皮膚?。?2%）和腸道疾?。?4%）。本文報告1 例松鼠大腸埃希氏菌（Escherichia coli）和松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）混合感染的病原鑒定及診治過程，現(xiàn)將情況匯報如下。

1 臨床癥狀

2021 年12 月，沈陽某學院實驗動物中心6 只籠養(yǎng)用于搜索毒品訓練的松鼠，初期有1 只突發(fā)性死亡，其他松鼠陸續(xù)表現(xiàn)為腹瀉、食欲減退和精神沉郁等癥狀，由正常糞便狀態(tài)（灰黑色，顆粒狀或短條狀、兩端尖）變?yōu)檐洷悖ú怀尚危S色）至水樣便（水樣，深黃綠色或黑色，惡臭，伴有膿液）（圖1）。

圖1 發(fā)病與病死松鼠的臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of the sick and dead squirrel

2 病史調查

松鼠為魔王松鼠（Sciurus vulgaris，1758）［3］，購自黑龍江松鼠養(yǎng)殖基地（黑龍江省伊春）。6 只，2 歲，雄性，體質量390～550 g。松鼠在動物中心已人工飼養(yǎng)1年半，每只松鼠單獨飼養(yǎng)于78 cm×51 cm×132 cm的3 層大籠中，松鼠的飼料包括榛子、小油葵花子、松子、梨和蘋果等。松鼠每日進行搜索毒品訓練，每日食物量為85 枚小油葵花子及5 枚榛子或松子，約100 g。飲水潔凈。每周喂食紅狗營養(yǎng)膏（RedDog）5 g，用以提供21 種維生素和18 種氨基酸均衡營養(yǎng)。

3 剖檢結果

將發(fā)病死亡松鼠剖檢（圖2），肛周無殘留糞便，解剖后可見胃部脹大、胃內有大量脹氣；腸壁變薄，回腸段的腸黏膜充血，盲腸段有脹氣，盲腸段腸黏膜呈灰黃色，結腸段腸黏膜呈黑綠色，結腸、直腸內容物幾乎無固體糞便，只有大量蛋花狀水樣便，腸淋巴結腫大出血；肝淤血、腫大；膀胱充盈；其他器官未見明顯病變［4-5］。

圖2 病死松鼠的剖檢結果Fig.2 Autopsy results of the dead squirrel

4 細菌分離鑒定

無菌采集死亡松鼠的糞便、盲結腸內容物及其余5只松鼠的糞便，將標本分別接種5種選擇鑒別培養(yǎng)基：血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、沙氏瓊脂培養(yǎng)基及甘露醇高鹽培養(yǎng)基，對腸道菌進行初次分離培養(yǎng)、2 次分離培養(yǎng)以篩選出不同細菌，3 次分離培養(yǎng)以鑒別腸道菌，最后挑取部分菌落涂于載玻片進行革蘭氏染色。

觀察菌落特征（圖3），血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分離培養(yǎng)結果為2 種顏色、形態(tài)和大小不同的菌落，并經(jīng)過血平板2 次分離培養(yǎng)（圖4）；伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基初次分離培養(yǎng)結果為1 種菌落，菌落中心呈暗藍黑色，發(fā)金屬光澤，為大腸埃希氏菌；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基初次分離培養(yǎng)結果為1 種菌落，菌落呈粉紅色，不透明，為大腸埃希氏菌；沙氏瓊脂培養(yǎng)基初次分離培養(yǎng)結果為2 種顏色、形態(tài)和大小不同的菌落；甘露醇高鹽瓊脂3次分離培養(yǎng)結果為1種菌落，黃色，不透明，為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）或松鼠葡萄球菌（圖5）。

圖3 初次分離培養(yǎng)結果Fig.3 Results of the first bacterial isolation and culture

圖4 血平板2次分離培養(yǎng)結果Fig.4 Results of the second bacterial isolation and culture in the blood agar

圖5 甘露醇高鹽瓊脂3次分離培養(yǎng)結果Fig.5 Results of the third bacterial isolation and culture in the Mannitol salt agar

經(jīng)過細菌分離形態(tài)學鑒定，結合革蘭氏染色結果，初步判斷為大腸埃希氏菌（可能為致病性菌株）、金黃色葡萄球菌或松鼠葡萄球菌（圖6）。

圖6 革蘭氏染色結果（100×）Fig.6 Gram staining result（100×）

5 細菌16S rDNA基因檢測

取菌落培養(yǎng)的平板，按Ezup 柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒（SK8255）操作抽提DNA。細菌16S rDNA 通用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，預擴增片段長度約為1 500 bp。引物信息見表1。PCR 總反應體系為25.0 μL：正、反引物各1.0 μL，PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，模板1.0 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保溫。反應結束后，將PCR 擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，按照SanPrep 柱式DNAJ 膠回收試劑盒（SK8131）操作，將PCR 產(chǎn)物電泳條帶切割所需DNA 目的條帶回收，PCR 產(chǎn)物用PCR引物直接測序。

表1 PCR擴增引物信息Tab.1 Primer information

利用特異性引物分別對從糞便、腸道中分離培養(yǎng)的菌株進行PCR 擴增，細菌16S rDNA 基因擴增結果顯示得到大小為1 475～1 487 bp的特異性片段，長度與預期相符（圖7）。

圖7 分離菌16S rDNA基因序列PCR擴增結果Fig.7 Amplification of 16S rDNA of isolated bacteria by PCR

將測定的序列進行BLAST 比對分析，以此來鑒定細菌種屬。測序后比對結果顯示：分離菌株的基因序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中已上傳的LS483305.1等10 種松鼠葡萄球菌參考株相應序列同源性均為100%，與CP072688.1 等10 種大腸埃希氏菌參考株相應序列同源性均為99.93%。由此，綜合分離菌的形態(tài)學特征、革蘭氏染色及16S rDNA 基因測序分析，確定該分離菌為松鼠葡萄球菌和大腸埃希氏菌。

6 大腸埃希氏菌血清型測定

將分離純化的大腸埃希氏菌進行培養(yǎng)，濃縮菌液，115 ℃高壓制成菌體抗原。大腸埃希氏菌O抗原診斷血清購自天津生物芯片技術有限責任公司，按使用說明書進行抗原-抗體平板凝集試驗，鑒定本次分離到的大腸埃希氏菌血清型為O2型。

7 藥敏試驗

采用紙片擴散法進行藥敏試驗。挑取分離到的單個菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜。吸取一定量的菌液涂布于固體培養(yǎng)基，用無菌鑷子將14種藥敏紙片貼于固體培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察并測量抑菌圈直徑。判定標準：抑菌圈直徑（D）≥15 mm為敏感，10 mm≤D＜15 mm為中介，D＜10 mm為耐藥。

用于大腸埃希氏菌和松鼠葡萄球菌的藥敏紙片的種類包括氨芐西林、頭孢唑啉、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、磺胺嘧啶、紅霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、阿米卡星、恩諾沙星、氯霉素、克林霉素（氯潔霉素）和頭孢克肟，均購自杭州微生物試劑有限公司。

藥敏試驗結果顯示：大腸埃希氏菌對頭孢克肟、慶大霉素和卡那霉素等9 種抗生素敏感，對磺胺嘧啶耐藥；松鼠葡萄球菌對頭孢克肟、頭孢唑啉和氨芐西林等8 種抗生素敏感，對卡那霉素、諾氟沙星、克林霉素和紅霉素耐藥（表2）。

表2 分離菌株對14種抗菌藥物的藥敏試驗結果Tab.2 The results of drug susceptibility test of isolated strains to 14 antibiotics

8 診治措施及效果

8.1 藥物治療

如果松鼠糞便為水樣，口服頭孢克肟顆粒，每日50 mg，兌水，松鼠自行飲用。因頭孢克肟具輕微特異臭氣味［6］，松鼠嗅覺靈敏，有的松鼠排斥，可將頭孢克肟顆粒配合其喜歡的食物喂食，連用3～5 d。如果松鼠糞便為黃軟便樣，口服乳酸菌素顆粒，每次2 g，2 次/d，兌水或舔服。連用2 d，如果糞便還未成形，立即改為使用頭孢克肟顆粒。

8.2 外部消毒

籠子、飲食用具使用次氯酸鈉噴灑，消毒1次/d；徹底清理糞便，飲水換為涼白開或純凈水。

8.3 清理殘留貯存

在腹瀉期間，忌食用油性大的食物，如松子，會影響治療效果。松鼠有貯存食物習性，平日會將松子埋藏在籠子的角落，需要將松鼠的貯存徹底清理。

經(jīng)上述綜合防治措施，2 d 后未有新發(fā)病例，已發(fā)病松鼠糞便狀態(tài)逐漸恢復正常，5 d 后全部恢復正常。

9 討論

人們越來越意識到微生物群可以反映動物的健康狀況，也可以衡量圈養(yǎng)對野生物種生存的影響。細菌感染性疾病不僅與病原微生物有關，還源于微生物群落內常駐菌群的失調［7］。圈養(yǎng)會對野生物種的微生物菌群產(chǎn)生重大影響，減少其豐度并導致菌群失衡。Olah 等［8］研究表明，有30%圈養(yǎng)環(huán)境下長大的松鼠，在重置新環(huán)境后會發(fā)生不明原因死亡，野生和圈養(yǎng)兩種不同生活環(huán)境下，松鼠的微生物群總體相似，這種微小的差異有利于圈養(yǎng)松鼠。在圈養(yǎng)條件下，松鼠的日糧種類需要接近于野外生活條件的飲食以平衡菌群。野外環(huán)境中，松鼠主要取食針葉樹種子、榛子、橡子等。當食物資源缺乏時，松鼠也取食蘑菇及其他真菌類食物、鳥類的卵、昆蟲、植物的花和嫩芽等［9］。根據(jù)松鼠養(yǎng)殖的經(jīng)驗，松鼠在腹瀉康復期也可以多食用蘑菇等。

采用分子生物學手段對分離菌16S rDNA 序列進行鑒定很有必要。在細菌基因組中，16S rDNA 基因普遍存在，功能穩(wěn)定，高度保守，不易發(fā)生水平基因轉移，已成為細菌分類鑒定的重要分子標記［10］。本報告中松鼠的發(fā)病原因確認為大腸埃希氏菌和松鼠葡萄球菌混合感染，致病菌混合感染時所引起的臨床癥狀和病理特征既具有廣泛性，又具有復雜性，單憑臨床觀察、病理剖檢，甚至細菌培養(yǎng)形態(tài)鑒定也難以準確判斷致病原。在本試驗中，最初認為甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基是金黃色葡萄球菌的選擇性培養(yǎng)基［11］，但松鼠葡萄球菌的生化特征在10%NaCl 瓊脂上生長良好，對甘露醇發(fā)酵反應呈陽性［12］，可見金黃色葡萄球菌和松鼠葡萄球菌的生化特征都耐高鹽且能在甘露醇中發(fā)酵，因此本研究中分離菌種在甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)結果可能為葡萄球菌屬（Staphylococcussp.）中的金黃色葡萄球菌或松鼠葡萄球菌。再通過擴增細菌16S rDNA 基因測序進行鑒定，經(jīng)BLAST 比對，進一步確定該菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫中的松鼠葡萄球菌具有很高的相似性。因此，在傳統(tǒng)的細菌形態(tài)、生化實驗基礎上還需要通過16S rDNA 基因序列分析鑒定才能得到精準的鑒定結果。

關于松鼠葡萄球菌的報道不多，松鼠葡萄球菌是最古老的葡萄球菌之一，它一般存在于寵物、野生動物的皮膚和黏膜表面，最早是1976 年由Kloos等［13］報道，從東部灰松鼠（Sciurus carolinensis）、南方鼯鼠（Glaucomys volans）、負鼠（Didelphis virginiana）、浣熊（Procyon lotor）、犬（Canis familiarus）、綿羊（Ovis aries）和人類身上被分離出。Duff 等［14］報道了松鼠在傳染痘病毒（Poxviral）后，在眼睛和腸道上繼發(fā)了松鼠葡萄球菌感染。與金黃色葡萄球菌不同，松鼠葡萄球菌屬于凝固酶陰性葡萄球菌，對新生霉素天然耐藥，氧化酶反應陽性，這是松鼠葡萄球菌的主要生化特征。作為條件致病菌，在不利因素下，松鼠葡萄球菌可引起心內膜炎、膿毒血癥休克和尿路感染，最常見的為傷口感染［15］。

本研究中鑒定的大腸埃希氏菌血清型是O2型，為致病型大腸埃希氏菌。已在雞、豬、牛和中華竹鼠（Rhizomys sinensis）等多種動物中分離到該型大腸埃希氏菌［16-18］。在3 例松鼠致命性壞死性腸炎病例中發(fā)現(xiàn)了溶血型大腸埃希氏菌，同時檢測到腺病毒1 型［19］。從英國野外回收的松鼠尸體中鑒定出非溶血型大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌［20］。O2型大腸埃希氏菌臨床上引起上述動物的主要癥狀有腹瀉、腹疼、子宮內膜炎和體溫升高等，可引起心臟、腎臟和肝臟等多個器官的病變或損傷。

以往研究中，大腸埃希氏菌具有較高的耐藥性，尤其是醫(yī)院分離到的大腸埃希氏菌耐藥現(xiàn)象更普遍，主要機制包括超廣譜β-內酰胺酶（extended spectrum beta-lactamases，ESBLs）耐藥機制、CTX-M基因型耐藥機制和AmpC 酶耐藥機制［21-23］。本研究分離到的大腸埃希氏菌對頭孢克肟、慶大霉素和鏈霉素等9 種藥物具有較高的敏感性，僅對磺胺嘧啶耐藥，這與以往研究具有一定差異。這可能是因為松鼠馴化時間短，某些生物特性仍與野生動物具有較高的相似性，如郭定宗等［24］研究表明野生動物的大腸埃希氏菌具有較低的耐藥性。從發(fā)病雞體內分離得到的3 株松鼠葡萄球菌對多西環(huán)素、阿莫西林和環(huán)丙沙星等藥物敏感［25］。1 株奶牛源松鼠葡萄球菌的分離菌株對復方新諾明、氨芐西林等7種藥物敏感，對克林霉素、頭孢噻肟和頭孢呋辛中度敏感，對青霉素、紅霉素和林可霉素耐藥［12］。本研究分離到的松鼠葡萄球菌對頭孢克肟、頭孢唑啉和氨芐西林等敏感，對卡那霉素、諾氟沙星、克林霉素和紅霉素耐藥，與上述研究結果略有不同，可見，不同松鼠葡萄球菌菌株對藥物有不同程度的敏感性。試驗中分離到的大腸埃希氏菌和松鼠葡萄球菌均對頭孢克肟、鏈霉素、阿米卡星和恩諾沙星敏感，上述藥物可以作為首選臨床用藥。本病例中首選了松鼠養(yǎng)殖場的常用藥——頭孢克肟，其對革蘭氏陽性菌和陰性菌有廣譜抗菌作用［6］。

Olah等［8］在2022年首次報道了健康松鼠的正常菌群微生物群落，包括18 個種和8 個不同屬的62 個細菌菌株，無論是野生還是圈養(yǎng)條件下，松鼠發(fā)病率最高的都是松鼠葡萄球菌（60%），其次是大腸埃希氏菌（45%）和蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus，35%）?？梢姡竽c埃希氏菌和松鼠葡萄球菌是存在于松鼠等多種宿主體內的病原體。本研究中的病原也為大腸埃希氏菌和松鼠葡萄球菌，可能來源于被細菌污染或變質的食物。松鼠膽小敏感，好躲避人，發(fā)病時不易被察覺，且病程短，致死率高，所以在日常中應以預防為主，加強管理，保證食物干凈新鮮衛(wèi)生，嚴禁飼喂發(fā)霉變質飼料，同時對圈舍、飲食器具進行清潔和消毒，保持潔凈和干燥，提高松鼠的生活環(huán)境質量，預防疫病發(fā)生。