路愛梅 李洪崢 楊文文 彭煜暄 魏玥 龍霖梓 曲華 吳漢濤 付長庚

2019年全球疾病負擔研究結(jié)果表明,以缺血性心臟病和卒中為主的動脈粥樣硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease, ASCVD)是引起全球人口死亡的首要原因,占全球總死亡人數(shù)的三分之一[1],給人類健康帶來嚴重的危害。動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是ASCVD的病理基礎(chǔ),其成因復雜,其中脂質(zhì)代謝紊亂、免疫和炎癥貫穿AS病變始終[2-3]。自噬是在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下,利用溶酶體自我降解后再利用,維持細胞能量穩(wěn)態(tài)的過程[4],對AS的調(diào)控更具有雙向作用——在AS早期內(nèi)皮通過自噬調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減輕炎癥反應(yīng),從而抑制斑塊的形成,晚期隨著斑塊的進展而變得功能失調(diào)[5]。因此,維持自噬的動態(tài)平衡對抑制AS的惡性發(fā)展極為重要。

化栓通脈方是本課題組根據(jù)臨床治療AS患者總結(jié)而來的經(jīng)驗方,用于改善冠狀動脈、頸動脈粥樣硬化斑塊,臨床療效確切。但其在動物體內(nèi)研究中,是否具有抗AS效應(yīng)及其作用機制有待進一步研究。有鑒于此,本實驗從血清脂蛋白、炎癥因子、斑塊面積等方面,綜合評價化栓通脈方調(diào)節(jié)ApoE基因敲除(ApoE knockdown, ApoE-/-)小鼠主動脈粥樣硬化斑塊的效應(yīng),并初步探索其是否通過調(diào)控自噬而發(fā)揮抗AS作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗環(huán)境

8周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠10只,同品系A(chǔ)poE-/-小鼠43只,體質(zhì)量(22±2)g,購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[許可證號:SCXK(京)2019-0010]。小鼠飼養(yǎng)于北京了未元醫(yī)藥科技公司動物實驗中心[許可證號:SYXK(京)2022-0007],溫度(22±2)℃,濕度(50±10)%,明/暗周期(12/12)小時。動物自由進食、飲水。動物倫理審查批號:SYXK2022-0007。

高脂飼料(83.5%基礎(chǔ)飼料+15%豬油+1.5%膽固醇)和普通飼料均由北京華阜康生物科技有限公司[許可證號:SCXK(京)2019-0008]提供。

實驗過程中,動物灌胃致死3只,剔除各組離群值,各組統(tǒng)計數(shù)量均為7只。

1.2 實驗藥物

辛伐他汀片(杭州默沙東制藥有限公司,規(guī)格:20 mg/片,批號:U04517)?；ㄍ}方藥物組成及劑量:金銀花15 g、山楂15 g、雞血藤15 g、制何首烏15 g、生白芍7.5 g、生甘草4 g。中藥飲片皆購于九州通醫(yī)藥集團股份有限公司,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學吳嘉瑞教授鑒定,均符合2020版《中國藥典》要求。

辛伐他汀片用生理鹽水配置成混懸液,濃度為0.3 mg/mL?；ㄍ}方各藥物按組方比例,稱取715 g,用2000 mL蒸餾水煎煮2次,然后濃縮至715 mL的中藥混懸液,每毫升含生藥量1 g,濃度為1 g/mL,4℃保存,備用。

用藥劑量參考公式:高劑量給藥劑量=成人(70 kg)臨床常用量×12(按人—小鼠體表面積折算等效劑量系數(shù))。以成人(70 kg)每日金銀花15 g、山楂15 g、雞血藤15 g、制何首烏15 g、生白芍7.5 g、生甘草4 g,共71.5 g,生藥計算高劑量組小鼠每日等效劑量為12 g/kg,高、低劑量組給藥劑量按2∶1設(shè)置,低劑量組小鼠每日給藥劑量為6 g/kg。辛伐他汀片成人給藥劑量為每日20 mg,換算獲得辛伐他汀組小鼠每日灌胃劑量為3 mg/kg。

1.3 主要試劑與儀器

白細胞介素(interleukin,IL)-1β、γ干擾素(interferon gamma,IFN-γ)、IL-10、IL-4 ELISA試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號分別為EK201BHS-96、EK280/3-96、EK210/4-96、EK204HS-96);油紅O染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號G1016);蘇木素—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號G1120);Russell改良Movat五色染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號G3701);抗-SQSTM1/P62兔pAb、抗-LAMP2兔pAb、抗LC-3A/B兔pAb(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號分別為GB11239-1、GB11330、GB11124)。

臺式高速冷凍離心機(大龍,型號D3024R),酶標檢測儀(美國BioTeK公司,型號Epoch),全自動生化分析儀(深圳雷杜生命科技,型號分別為Chemray 240、420、800),熒光顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司,型號2204926),光學顯微鏡(DMi1,型號Leica),組織切片機(浙江省金華市科迪儀器公司,型號KD-ST5500)。

1.4 動物分組、給藥及取材

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,10只C57BL/6J小鼠作為對照組,全程采用普通維持飼料喂養(yǎng)。43只ApoE-/-小鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)8周后,隨機抽取3只取材,主動脈竇病理切片HE染色顯示:主動脈管腔狹窄,內(nèi)膜明顯增厚,有明顯斑塊形成,提示早期AS體內(nèi)模型建立成功。造模后的ApoE-/-小鼠隨機分為4組:模型組、辛伐他汀組(3 mg/kg)、化栓通脈方低劑量組(6 g/kg)、化栓通脈方高劑量組(12 g/kg),每組10只,繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng),用藥組同時予以相應(yīng)藥物灌胃,對照組和模型組予等體積生理鹽水灌胃以保證組間一致性,每日灌胃1次,連續(xù)6周。

最后一次灌胃后,禁食、不禁水12小時。用3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉,球后靜脈(眼眶靜脈叢)取血,室溫靜置2小時,4℃ 4 000r/min離心10分鐘,分離上層血清,-80℃下凍存。取血后打開小鼠胸腔及腹腔,經(jīng)PBS充分灌流,整體分離自主動脈根部至髂總動脈分叉處主動脈,并剝離周圍多余結(jié)締組織和脂肪組織,投入液氮或組織固定液中保存,用于后續(xù)相關(guān)實驗。

1.5 指標檢測

1.5.1 酶標法測定小鼠血脂水平 每組取7只小鼠,使用全自動生化分析儀測定各組小鼠血清中總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)的水平。

1.5.2 ELISA法檢測血清炎癥因子水平 每組取7只小鼠,根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作,檢測小鼠血清中IL-1β、IFN-γ、IL-10、IL-4的水平。

1.5.3 大體油紅O染色測定整體主動脈相對斑塊面積 每組取3只小鼠,在光學顯微鏡下將小鼠主動脈縱剖面固定,水洗,油紅O染色后將血管平鋪于黑色橡膠板,迅速拍照,利用Image J軟件分析以主動脈相對斑塊面積來評價主動脈斑塊嚴重程度。相對斑塊面積(%)=主動脈斑塊面積/血管內(nèi)膜總面積×100%。

1.5.4 HE染色評價主動脈竇病理形態(tài) 每組取3只小鼠,4%多聚甲醛固定主動脈于4℃冰箱24小時,梯度脫水后石蠟包埋,并連續(xù)切片(5 μm),HE常規(guī)染色后封片拍照,于光學顯微鏡下檢測AS小鼠主動脈竇病理形態(tài)的變化,測量并計算斑塊面積占血管內(nèi)膜面積百分比。相對斑塊面積(%)=斑塊面積/內(nèi)膜總面積×100%。

1.5.5 Russell-Movat染色評價主動脈竇斑塊成分 每組取3只小鼠,主動脈石蠟切片處理,切片厚度5 μm,連續(xù)切片至觀察到3個主動脈瓣完全融合開始留取10張切片,切片脫蠟至水,經(jīng)五色法染液進行染色,脫水封片,在光學顯微鏡下觀察主動脈竇斑塊各成分變化,染色后的細胞核和彈性纖維呈黑色,膠原纖維呈紅色,泡沫細胞呈淡紫色,蛋白聚糖呈藍色。測量并計算斑塊內(nèi)泡沫細胞及膠原纖維的占比。

1.5.6 免疫熒光法評價主動脈竇溶酶體關(guān)聯(lián)膜蛋白2(lysosomal associated membrane protein 2,LAMP2)、輕鏈蛋白3A/B(light chain 3A/B,LC3A/B)、P62蛋白的表達 每組取3只小鼠,主動脈竇石蠟切片,常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復后,血清室溫封閉30分鐘,滴加一抗4℃孵育過夜,PBS浸洗3次,次日滴加熒光二抗25℃避光孵育1小時,PBS浸洗3次,滴加DAPI避光孵育5分鐘復染細胞核,PBS浸洗4次,最后用含抗熒光的淬滅劑封片。使用熒光顯微鏡觀察主動脈竇的LAMP2、LC3A/B、P62蛋白熒光表達,并采集圖像,利用Image J分析處理數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 化栓通脈方對小鼠血脂水平的影響

相比于對照組,模型組小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平明顯升高,HDL-C水平明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);相比于模型組,辛伐他汀組和化栓通脈方低、高劑量組血清中TC、TG、LDL-C水平均顯著降低,HDL-C水平均顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組AS模型小鼠血脂水平比較

2.2 化栓通脈方對小鼠血清炎癥因子水平的影響

與對照組相比,模型組血清中IL-1β、IFN-γ含量顯著上升,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),IL-10、IL-4含量也有所升高,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與模型組相比,化栓通脈方高劑量組血清中IL-1β、IFN-γ含量顯著降低,IL-10、IL-4含量顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);化栓通脈方低劑量組較模型組IFN-γ含量降低,IL-4含量升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),IL-1β含量降低,IL-10含量升高,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組AS模型小鼠血清炎癥因子比較

2.3 化栓通脈方對小鼠整體主動脈斑塊面積的影響

主動脈大體油紅O染色顯示,對照組小鼠主動脈血管壁大體光滑、平整,呈半透明狀,見有少量點狀斑塊散在分布;高脂飼料喂養(yǎng)14周,模型組小鼠主動脈管腔病理性擴增,管壁存在大量的紅染的點片狀脂質(zhì)斑塊,且多分布在主動脈弓及血管分叉處。相比對照組,模型組主動脈竇部斑塊面積明顯增加(P<0.01);相比模型組,化栓通脈方低、高劑量組小鼠主動脈竇部斑塊面積均明顯減少(P<0.01)。見圖1及表3。

注:A 對照組;B 模型組;C 辛伐他汀組;D 化栓通脈方低劑量組;E 化栓通脈方高劑量組。

表3 各組小鼠AS模型小鼠斑塊面積占比(大體油紅O染色)

2.4 化栓通脈方對小鼠主動脈竇病理形態(tài)的影響

主動脈竇HE染色顯示,對照組小鼠主動脈內(nèi)膜光滑完整,內(nèi)膜下無明顯泡沫細胞和脂質(zhì)沉積形成,中層平滑肌細胞排列整齊;模型組小鼠主動脈內(nèi)膜增厚明顯,內(nèi)膜下可見大量泡沫細胞和脂質(zhì)沉積,中層平滑肌細胞增殖且排列紊亂;與模型組相比,化栓通脈方高劑量干預后,小鼠主動脈竇內(nèi)膜厚度、泡沫細胞數(shù)量及脂質(zhì)沉積明顯減輕(P<0.01)。見圖2,表4。

注:A 對照組;B 模型組;C 辛伐他汀組;D 化栓通脈方低劑量組;E 化栓通脈方高劑量組。

表4 各組小鼠AS模型小鼠斑塊面積及成分占比

主動脈竇Russell-Movat染色結(jié)果顯示,對照組內(nèi)膜未見明顯斑塊,內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)完整,彈力纖維彎曲連續(xù),富有彈性,中膜血管平滑肌排列整齊,周圍分布少量膠原纖維和網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu);模型組可見內(nèi)膜斑塊顯著突向管腔,斑塊內(nèi)部有大量泡沫細胞和脂質(zhì)堆積,斑塊表面有大量炎癥細胞浸潤黏附,平滑肌細胞大量增生,排列紊亂,血管中膜失去連續(xù)性,彈力纖維繃直、失去彈性,膠原纖維、網(wǎng)狀纖維排布錯亂。化栓通脈方干預后主動脈竇Movat染色顯示:斑塊炎癥細胞浸潤黏附有所減輕,脂質(zhì)堆積有所減少,膠原纖維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,覆蓋包裹在脂質(zhì)表面,血管中膜連續(xù)性較模型組有所改善(P<0.05),表明化栓通脈方促進斑塊穩(wěn)定,減少AS的發(fā)展。見圖3,表4。

注:A 對照組;B 模型組;C 辛伐他汀組;D 化栓通脈方低劑量組;E 化栓通脈方高劑量組。

2.5 化栓通脈方對小鼠主動脈竇自噬相關(guān)蛋白表達的影響

免疫熒光結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組小鼠主動脈中LAMP2、LC3A/B、P62的表達升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組相比,化栓通脈方高劑量干預后,AS模型小鼠主動脈竇中LAMP2、LC3A/B表達升高(P<0.01),P62的表達降低(P>0.05)。見圖4,表5。

注:A 對照組;B 模型組;C 辛伐他汀組;D 化栓通脈方低劑量組;E 化栓通脈方高劑量組。

表5 各組AS模型小鼠主動脈竇自噬蛋白表達情況比較

3 討論

在AS的中醫(yī)藥防治中,瘀與毒是導致易損斑塊形成及破裂的主要病理因素。穩(wěn)定斑塊和血栓屬于“內(nèi)阻瘀血”,各種炎癥因子屬于“內(nèi)生毒邪”,瘀為常,毒為變,由常生變,因瘀致毒,毒瘀互結(jié),AS易損斑塊在瘀血基礎(chǔ)上“毒邪”致病,治當以解毒化瘀[6-9]。化栓通脈方以金銀花為君,解毒清熱,直擊病本;山楂行氣散瘀化濁,雞血藤祛瘀養(yǎng)血通絡(luò),制何首烏、白芍養(yǎng)血益精,斂陰止痛,共為臣藥;甘草清熱解毒,調(diào)和諸藥。上述藥物合用,共奏解毒化瘀、養(yǎng)血通絡(luò)之效。

現(xiàn)代藥理學研究指出,化栓通脈方通過多成分、多靶點、多途徑,發(fā)揮抗AS作用——金銀花、山楂、雞血藤、白芍都具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集的作用[10-12],山楂還可調(diào)節(jié)血脂代謝及改善血管內(nèi)皮功能,雞血藤可調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)[13-14],制何首烏可補血、抗衰老、降血脂[15],白芍可通過調(diào)節(jié)免疫、抑制細胞凋亡、促進膽固醇流出等途徑抗AS[16-17]。由此可知,化栓通脈方中藥物成分可能通過抑制斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)、改善脂質(zhì)代謝和血流動力學,從而降低斑塊惡化破裂風險。故本研究旨在通過探討化栓通脈方對ApoE-/-小鼠抗AS的作用及其機制,為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

3.1 化栓通脈方通過降脂、抗炎實現(xiàn)抗AS作用

AS是一種慢性炎癥性血管疾病,脂質(zhì)代謝紊亂與炎癥因子升高會導致血管內(nèi)皮功能受損,引起血管內(nèi)壁脂質(zhì)堆積及斑塊和血栓的形成,與AS的生成與發(fā)展密切相關(guān)[3,18],促炎和抗炎機制的平衡決定著AS的結(jié)局,是病情轉(zhuǎn)化和惡化的關(guān)鍵[19]。有鑒于此,調(diào)節(jié)血脂代謝、抑制炎癥反應(yīng)在AS的治療中占有重要地位。本研究表明,化栓通脈方可調(diào)節(jié)血清脂蛋白、炎癥因子水平。研究結(jié)果指出,相比于模型組,高、低劑量化栓通脈方組血清中TC、TG、LDL-C水平均顯著下降,HDL-C水平顯著上升,促炎因子IL-1β、IFN-γ含量降低,抑炎因子IL-10、IL-4含量升高,斑塊面積、泡沫細胞和膠原纖維相對占比明顯減小,且隨化栓通脈方濃度升高而存在一定差異。由此表明,化栓通脈方可能通過調(diào)節(jié)血脂代謝、降低血清炎癥因子水平,減少主動脈斑塊面積,實現(xiàn)抗AS作用。

3.2 化栓通脈方抗AS作用可能與誘導細胞自噬有關(guān)

自噬是細胞自身的分解代謝機制,對AS具有重要影響,其水平主要通過自噬標志物(自噬體和自噬溶酶體)和自噬蛋白標志物的水平進行評價[20-21]。自噬體作為自噬過程的標志性結(jié)構(gòu),是檢測自噬的唯一金標準,而LC3是最可靠的自噬體標志物,其表達水平與自噬體數(shù)量呈正相關(guān);LAMP2是溶酶體標志物,其表達水平與自噬溶酶體亦呈正相關(guān);P62是自噬的特異性底物,其表達水平與自噬潮呈負相關(guān)。本研究免疫熒光結(jié)果顯示,模型組較對照組具有高水平的LC3A/B、LAMP2共定位,表明自噬的募集是對新興斑塊的應(yīng)激反應(yīng)?；ㄍ}方組較模型組LC3A/B、LAMP2的表達上調(diào)、P62的表達下調(diào),且高劑量組比低劑量組自噬蛋白表達更為顯著,表明化栓通脈方可增加自噬通量,升高自噬水平,起到抗AS作用,并與劑量呈相關(guān)關(guān)系。

綜上所述,化栓通脈方可能通過誘導細胞自噬,調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減弱炎癥反應(yīng),從而抑制斑塊形成與進展,達到防治AS的作用,具體機制通路有待進一步實驗驗證。