梁甜 周曉玲 周琳

纖維化是一種持續(xù)免疫因素刺激作用下形成的慢性病理結(jié)果,表現(xiàn)為器官組織炎癥、實質(zhì)細胞損害、成纖維細胞效應(yīng)細胞激活細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix, ECM)過量形成,造成組織內(nèi)纖維結(jié)締組織增多[1]。一項研究顯示,器官的纖維化占全世界全因死亡率的45%[2],纖維化是慢性炎癥疾病進展的特征,在持續(xù)炎癥刺激下影響任何組織器官發(fā)生纖維化病變,包括特發(fā)性肺纖維化、心肌纖維化和系統(tǒng)性硬化癥等疾病通常被認為是逐漸進展且不可逆的。然而,目前多項臨床前模型和臨床試驗表明,纖維化是一個高度動態(tài)的過程,具有固有可塑性[3]。并且,近年來越來越多的研究表明,中藥及其有效成分可通過干預(yù)NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)相關(guān)通路來減輕、甚至逆轉(zhuǎn)纖維化進展,因此本文基于探究中藥抗纖維化藥理機制,闡釋中醫(yī)藥調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體相關(guān)靶點、信號通路而發(fā)揮抗纖維化作用。

1 NLRP3炎癥小體與纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)

1.1 NLRP3炎癥小體的結(jié)構(gòu)與功能

NLRP3炎性小體由一個可溶模式識別受體(pattern recognition receptors,PPPs)通過氨基端吡啉結(jié)構(gòu)域(pyrin domain containing, PYD)與凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)的N 端與 NLRP3 連接,ASC的C 端與 procaspase-1 結(jié)合,三者共同組成NLRP3炎癥體[4]。NLRP3炎性小體作為機體固有免疫系統(tǒng)的第一道保護屏障,它的激活將介導(dǎo)免疫級聯(lián)反應(yīng)以抵抗外來病原體的入侵和通過釋放大量炎癥介質(zhì)促進機體損傷修復(fù)。NLRP3 通過pyrin結(jié)構(gòu)域上的細胞質(zhì)或質(zhì)膜上的獨特模式識別受體(PRRs),感知病原體衍生的病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecule patterns,PAMPs)或宿主衍生分子的損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs),從而識別感染并監(jiān)測非自身分子,參與各種炎性疾病的發(fā)病機。NLRP3炎性小體的異常激活上調(diào)促炎細胞因子,白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和IL-18水平上調(diào),促進免疫細胞滲透到感染或受損組織[4-5],介導(dǎo)適應(yīng)性免疫進一步擴大炎癥反應(yīng)。因此,NLRP3炎癥小體在激活機制炎癥、代謝性和免疫系統(tǒng)等疾病方面起著重要作用。

1.2 NLRP3炎癥小體參與纖維化的作用機制

纖維化疾病是由于嚴重的組織損傷或傷口愈合障礙引起的纖維結(jié)締組織增多,在長期慢性炎癥刺激和成纖維效應(yīng)細胞過度激活的協(xié)同狀態(tài)下導(dǎo)致的大量ECM增多的結(jié)果。早期研究發(fā)現(xiàn) NLRP3炎癥體主要存在免疫細胞,但近期越來越多的實驗結(jié)果證明炎癥小體也可以存在非免疫細胞中,如肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)、成纖維細胞/肌成纖維細胞(Myofibroblast,MF)、內(nèi)皮細胞(endothelial cells,ECs)和實質(zhì)細胞(parenchyma cell,PCs)等[6]。在外源性因素損傷器官后,介導(dǎo)toll樣受體(Toll-like receptor ,TLR)磷酸化,啟動核因子(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路,各細胞內(nèi)NLRP3的表達增加,上調(diào)IL-1β、IL-18前體的表達。內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式的胞內(nèi)損傷信號釋放激活NLRP3,與適配器蛋白ASC和pro-caspase-1的多蛋白復(fù)合體組裝,最終導(dǎo)致IL-1β和IL-18的成熟,引發(fā)炎癥反應(yīng)和gasdermin D的裂解,從而誘導(dǎo)焦亡[7-8]。目前較為普遍認可的理論主要有細胞外三磷酸腺苷(adenosine 5’-triphosphate,ATP)通過受體導(dǎo)致細胞鉀離子外流誘導(dǎo)NLRP3的活化,ROS依賴的方式活化和溶酶體組織蛋白酶B活化炎癥小體。基于這些證據(jù),抑制NLRP3炎癥小體通路的激活及調(diào)控炎癥反應(yīng)的研究為纖維化疾病的診治提供了新的機會。

2 中藥通過調(diào)節(jié)NLRP3相關(guān)P2X7嘌呤能受體靶點,減輕免疫炎癥反應(yīng)

2.1 治療心肌纖維化(myocardial fibrosis,MFS)

MFS是由心肌重構(gòu)引起的一種病理狀態(tài),其特征為ECM沉積,伴有收縮和舒張功能障礙,導(dǎo)致心肌細胞凋亡,損傷細胞的ATP泄漏激活細胞膜上的P2X7R,導(dǎo)致NLRP3炎癥小體的活化,引起炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)心律失常和心力衰竭,加重心功能障礙和纖維化[9]。

中藥復(fù)方參芪顆粒是在真武湯和四妙勇安湯的基礎(chǔ)上研制而成,由黃芪、丹參、忍冬、玄參、烏頭和甘草六味中藥組成。經(jīng)研究顯示,參芪顆粒調(diào)節(jié)心肌巨噬細胞的炎癥表型,通過抑制P2X7R-NEK7-NLRP3通路,干預(yù)急性心肌缺血(acute myocardial infarction,AMI)后巨噬細胞NLRP3炎癥小體激活誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),降低AMI后炎癥損傷引起的心肌缺血—缺氧損傷和各種內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式的釋放,從而改善心功能和降低心肌纖維化風(fēng)險[10]。扎沖十三味丸(ZC-13)是蒙醫(yī)臨床常用傳統(tǒng)方劑,具有鎮(zhèn)痛抗炎作用,姚坤辰[11]采用異丙腎上腺素誘導(dǎo)小鼠心肌纖維化模型和體外采用轉(zhuǎn)化生長因子-β刺激活化人臍靜脈內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)纖維化,發(fā)現(xiàn)ZC-13顯著降低心肌組織中caspase-1、IL-1β、IL-1受體基因和IL-6等炎癥因子的表達,并顯著降低P2X7r及NLRP3的蛋白及mRNA表達。Kong等[12]用姜黃素預(yù)處理人單核細胞向巨噬細胞分化的實驗中,發(fā)現(xiàn)姜黃素能下調(diào)P2X7R表達,并且調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB信號通路,減輕巨噬細胞NLRP3、caspase-1的表達和IL-1β分泌,減輕炎癥反應(yīng)抑制動脈粥樣硬化的進展,表明抑制心肌纖維化可以通過P2X7R-NEK7-NLRP3炎性體通路起作用,P2X7R有望成為心肌纖維化防治的新靶點。

2.2 治療肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)

HF是機體對慢性肝炎造成的持續(xù)性肝細胞損傷的一種反應(yīng),在小鼠飲食和化學(xué)誘導(dǎo)的肝損傷模型中,發(fā)現(xiàn)壞死、凋亡的肝細胞會釋放ATP等細胞內(nèi)容物激活 ATP 門控陽離子通道受體P2X7R ,觸發(fā)了細胞質(zhì)離子轉(zhuǎn)運(Na+和Ca2+內(nèi)流,K+外排)進而激活NLRP3炎癥小體,促使肝星狀細胞活化,產(chǎn)生大量的基質(zhì)沉積[13]。

宋健[14]研究發(fā)現(xiàn),人參皂苷可以通過調(diào)控配體ATP 激活P2X7r門控離子通道,抑制K+外流以及Ca2+、Na+內(nèi)流,從而抑制NLRP3和炎癥因子表達,促使肝臟I型膠原和α-SMA產(chǎn)生減少,改善了硫代乙酰胺(thioacetamide, TAA)誘導(dǎo)的肝纖維化。體外研究發(fā)現(xiàn),龍膽苦苷通過抑制P2X7受體-NLRP3的激活,并抑制脂多糖(LPS)和ATP刺激的RAW 264.7巨噬細胞和小鼠骨髓來源的巨噬細胞的IL-1β的產(chǎn)生和 ECM 的沉積[15]。鄧英等[16]在LPS和ATP聯(lián)合誘導(dǎo)肝細胞(L02細胞)炎癥發(fā)生的模型中,用連翹脂素干預(yù)可以抑制P2X7R的表達,減少ROS的產(chǎn)生從而抑制 NLRP3 炎癥小體及其下游炎癥因子IL-18 和 IL-1β的表達,從而緩解肝細胞炎癥,同時連翹脂素還可以通過抑制 P2X7R 的表達而抑制 NF-κB 的轉(zhuǎn)錄及表達。另一項體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn),和厚樸酚能通過抑制P2X7r、NLRP3、IL-1β等多種炎癥細胞因子的表達,有效抑制HSCs的活化,降低肝纖維化標志物α-SMA、I型膠原蛋白(Collagen I,Col I) 及mRNA的表達[17]。另外,木犀草素通過P2x7R-TLR4-RAGE-NLRP3軸來調(diào)節(jié)高遷移率族蛋白B1的釋放,減少LPS/ATP引起的肝臟炎癥[18]。中藥單體二氫槲皮素、樺木素可通過阻斷P2X7R介導(dǎo)的 NLRP3 炎癥小體信號通路改善小鼠肝臟脂質(zhì)堆積和脂肪變性,進而抑制脂肪性肝炎向纖維化進展[19-20]。提示中藥提取物或單體可通過P2RX7抑制肝臟不同細胞中NLRP3的激活產(chǎn)生的炎癥反應(yīng),起到肝纖維化的抑制作用。

2.3 治療腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF)

RIF幾乎是所有慢性腎病進展到終末期的共同轉(zhuǎn)歸。研究發(fā)現(xiàn),P2X7Rs的激活可能參與腎臟疾病,廣泛存在于腎間室,在免疫細胞、成纖維細胞和肌成纖維細胞中表達,在炎癥中上調(diào),并通過P2X7R-ATP-NLRP3軸促進促炎介質(zhì)的產(chǎn)生[21]。

研究發(fā)現(xiàn),在順鉑誘導(dǎo)的慢性炎癥和進行性腎纖維化模型中,給予黃連素(200 mg/kg)干預(yù)后下調(diào)了P2X7R表達進而抑制SIRT2/mdm2觸發(fā)的腎纖維化[22]。在高脂飼糧加低劑量鏈脲佐菌素致大鼠DN模型和高糖刺激致小鼠足細胞損傷模型中,發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草能顯著抑制足細胞中P2X7R的高表達和NLRP3炎性小體的激活及其下游效應(yīng)因子IL-1β和IL-18的激活和釋放[23]。錢盈盈[24]通過降低細胞外ATP水平和基因敲除P2X7R,抑制腎小管上皮細胞NLRP3炎癥體活化改善腎臟缺血再灌注損傷,并降低腎臟炎癥,表明中藥可以嘗試通過抑制P2X7R進而阻斷ATP釋放ATP受體信號通路的手段來減輕無菌性炎癥造成的腎損傷過程。

3 中藥通過抑制NLRP3相關(guān)活性氧自由基生成,減輕氧化應(yīng)激

3.1 治療心肌纖維化(myocardial fibrosis,MFS)

早期缺血性心肌細胞壞死時可釋放大量ROS,引起氧化應(yīng)激反應(yīng)在心肌纖維化形成中起關(guān)鍵作用,ROS一方面可直接損害心肌功能,另一方面誘導(dǎo)NLRP3炎癥信號的激活,誘導(dǎo)活性促炎細胞因子IL-1β和IL-18的產(chǎn)生,促進心肌纖維化,加重心肌梗死,降低心肌收縮功能[25]。

在結(jié)扎左前降支冠狀動脈誘發(fā)心肌梗死的小鼠模型中,發(fā)現(xiàn)中藥提取物黃芪甲苷干預(yù)后可以減少心肌線粒體中ROS的釋放,并降低NLRP3、caspase-1、IL-18和IL-1β蛋白的表達,表明黃芪甲苷可以下調(diào)ROS/Caspase-1/GSDMD信號通路來緩解心肌梗死引起的心肌纖維化和心臟重塑[26]。在體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rb1通過對線粒體I依賴酵母NADH脫氫酶呼吸和再灌注誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS起抑制作用,可減少線粒體ROS生成,減小心肌梗死面積,限制心肌纖維化[27]。Li等[28]在高糖誘導(dǎo)的小鼠糖尿病心肌病模型中,口服四氫姜黃素 [120 mg/(kg·d)]12周可顯著改善心功能,改善心肌纖維化和心肌肥厚,同時減少ROS的產(chǎn)生。另外,桑葉黃酮可顯著升高糖尿病小鼠心肌線粒體總鈣和 ATP 含量,增強線粒體功能,改善小鼠糖尿病心肌病心肌纖維化[29]。有研究表明,從忍冬科、車前科、杜仲科植物中提取的一種重要的生物活性物質(zhì)桃葉珊瑚苷,可通過抑制 ROS生成,進而有效地抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細胞增殖和 ECM 的生成[30]。知母的活性成分芒果苷具有抗氧化作用,在心肌纖維細胞中芒果苷通過激活核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2),上調(diào)細胞內(nèi)谷胱甘肽的含量,并驅(qū)動選擇性自噬發(fā)生使 ROS水平降低,抑制心肌纖維化[31]。李夢[32]進一步在細胞水平模擬 MF損傷模型,發(fā)現(xiàn)益母草堿通過降低ROS水平和心肌組織中TGF-β含量,顯著改善MF大鼠心肌組織纖維化程度,逆轉(zhuǎn)MF。這些研究結(jié)果表明,ROS被認為是NLRP3炎癥小體激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,抑制ROS可以逆轉(zhuǎn)NLRP3炎癥小體的激活。

3.2 治療肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)

在肺纖維化過程中,成纖維細胞增強了線粒體功能障礙,并產(chǎn)生了大量的線粒體ROS(mtROS),不僅引起線粒體脫氧核糖核酸(mitochondrial deoxyribonucleic acid,mtDNA)損傷、通透性轉(zhuǎn)換孔開放及膜通透性改變導(dǎo)致細胞凋亡,而且mtROS作為是肺纖維化NLRP3炎性小體激活的關(guān)鍵,NLRP3過度激活誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)促進肺纖維化發(fā)生[33]。

博來霉素氣道滴入建立肺纖維化大鼠模型是典型的肺纖維化模型,研究發(fā)現(xiàn),模型組和對照組的羥脯氨酸升高、丙二醛和ROS含量增加、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)含量減少,黃芪甲苷干預(yù)后可以減少肺組織羥脯氨酸含量,提高SOD含量,抑制肺損傷釋放的大量ROS,起到抗纖維化和減輕膠原纖維沉積作用[34]。同樣,在另一項體內(nèi)研究表明,從中藥南五味子提取出來的安五脂素單體能減少ROS 的產(chǎn)生,逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激對肺組織造成的損傷,減輕肺組織纖維化[35]。張秉芬等[36]采用氣管插管注入博來霉素法(5 mg/kg)建立大鼠肺纖維化模型,經(jīng)過延齡草皂苷治療后,大鼠肺組織 SOD 活性提高,ROS水平降低,肺纖維化標志蛋白fibronectin、Collagen I和 α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和炎癥因子表達減少,提示延齡草皂苷可能通過降低炎癥和氧化應(yīng)激水平來抑制肺纖維化發(fā)生。丹參酮 II A具有恢復(fù)氧化還原穩(wěn)態(tài)的能力,馮菲菲[37]采用 DCFH-DA 檢測矽肺大鼠肺組織ROS,顯示丹參酮II A+矽肺組共處理后ROS綠色熒光強度較矽肺組顯著下降,從而抑制氧化應(yīng)激,減輕矽肺肺纖維化。溫肺化纖湯是由生麻黃、熟地、鹿角霜、肉桂、炮姜、白芥子等12味中藥組成,經(jīng)研究證實,溫肺化纖湯干預(yù)原代肺間充質(zhì)干細胞(LMSCs)氧化應(yīng)激損傷模型,可減輕過氧化氫誘導(dǎo)的LMSCs線粒體功能障礙和代謝失衡,下調(diào)ROS表達(P<0.05),通過增強線粒體最低限度的氧消耗速率和 ATP 水平,減輕氧化應(yīng)激損傷[38]。因此,中藥復(fù)方或中藥提取物可以通過抑制肺組織ROS的產(chǎn)生,減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)抑制肺纖維化。

3.3 治療腎纖維化(pulmonary fibrosis,PF)

在代謝異常的疾病狀態(tài)下,如高血糖、胰島素抵抗、游離脂肪酸水平升高導(dǎo)致細胞內(nèi)線粒體ROS累積,介導(dǎo)細胞內(nèi)氧化應(yīng)激并且激活NLRP3釋放促炎因子,介導(dǎo)糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)、腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化[39]。

體外研究顯示,青蒿琥酯能調(diào)節(jié)線粒體ROS過量產(chǎn)生的線粒體功能和氧化還原失衡,并抑制了高糖誘導(dǎo)的炎性細胞因子的產(chǎn)生和ECM的沉積,改善糖尿病腎病小鼠腎臟的損傷[40]。大黃泄?jié)岱皆谂R床中治療慢性腎功能衰竭(CRF)的常用方子,由大黃、黃芪、丹參、當(dāng)歸、地龍、水牛角、醋龜甲、土茯苓、積雪草9味中藥組成。研究證明,大黃泄?jié)岱綄?5/6 腎切除大鼠造成的腎間質(zhì)纖維化模型中,通過調(diào)控 ROS/TXNIP/NLRP3 通路,下調(diào)了硫氧還蛋白、硫氧還蛋白結(jié)合蛋白、NLRP3、ASC、轉(zhuǎn)化生長因子-β、IV型膠原、α-SMA和調(diào)纖連蛋白(FN)表達,保護慢性腎衰竭大鼠腎功能、延緩腎間質(zhì)纖維化[41]。山茱萸具有抗氧化和抗炎和非特異性免疫增強作用,在治療肝腎疾病有著特殊的功效,體內(nèi)研究實驗顯示,山茱萸提取物治療CRF后腎小球和腎小管萎縮、炎性細胞浸潤和間質(zhì)纖維化等病變程度較模型組減輕,ROS含量降低(P<0.05)[42];沈曉燕[43]用Western Blot檢測人參皂苷Rg1干預(yù)后小鼠腎臟衰老相關(guān)性腎纖維化模型組織,結(jié)果表明Rg1可通過抑制NADPH氧化酶4(NOX4)介導(dǎo)的ROS氧化應(yīng)激和NLRP3炎癥小體激活來延緩腎臟衰老,減輕與衰老相關(guān)的腎損傷和纖維化。這些研究結(jié)果提示調(diào)控 ROS 相關(guān)NLRP3炎癥小體通路可能是延緩氧化應(yīng)激相關(guān)性腎纖維化進展的重要途徑。

4 中藥通過抑制NLRP3相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路,減少炎癥因子和細胞死亡

4.1 治療特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)廣泛存在于呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生過程中,在基因突變和環(huán)境暴露的條件下II 型肺泡上皮細胞(AEC II)發(fā)生功能障礙,導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊蛋白(UPR)的積累,發(fā)生ERS。ERS激活UPR后可通過肌醇依賴性激酶1α(inositol requiring enzyme 1α,IRE1α)和蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)酶(PRKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)促進TXNIP轉(zhuǎn)錄,誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生或IL-1β mRNA轉(zhuǎn)錄,激活NLRP3炎性小體產(chǎn)生IL-1β,并介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的β細胞死亡[44]。

在IPF小鼠模型,中藥提取物黃芩素、巖白菜素均能抑制博來霉素(blm)誘導(dǎo)的上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程,抑制NF-κB通路調(diào)控炎癥反應(yīng),導(dǎo)致肺組織NLRP3、p 65、IκBα 蛋白表達減少,抑制IL-1β和IL-18的產(chǎn)生[45-46],因此推測可通過抑制NF-κB/ NLRP3/IL-1β 信號通路和調(diào)節(jié)代謝發(fā)揮治療小鼠IPF的作用。另有研究發(fā)現(xiàn),溫肺化纖顆粒能通過下調(diào)blm構(gòu)建肺纖維化模型小鼠的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)和促細胞凋亡蛋白 Bax 蛋白的表達,抑制 ERS 介導(dǎo)的凋亡發(fā)生,降低肺組織TGF-β1及 α-SMA mRNA和蛋白表達而達到改善肺纖維化的目的[47]。進一步體外研究顯示,由經(jīng)典方金水六君煎為基礎(chǔ),化裁而成補腎益肺消癥方,可以調(diào)控 AECⅡ細胞 ERS,下調(diào)分子 C/EBP- 同源蛋白(C/EBPhomologous protein,CHOP)凋亡通路中關(guān)鍵信號分子 CHOP、PERK 等蛋白及基因水平的表達,恢復(fù)細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)、降低基底膜沉積,減輕肺纖維化[48]。王志超[49]則經(jīng)體內(nèi)體外研究證實,中藥陳皮堿性提取物可以緩解AECⅡ的ERS,并通過減少AEC II中TGF-β1等細胞因子的分泌間接降低肺成纖維細胞的膠原表達,最終緩解肺纖維化。此外,Shen等[50]建立IPF動物模型體和體內(nèi)肺纖維化模型中,進一步證實,麥門冬湯可以降低AECIIs中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78(glucose regulated protein 78,GRP78)和CHOP的表達,并增加AECIIs表面活性蛋白C (SPC)的分泌,顯著減輕了肺組織纖維化區(qū)的凋亡,提示IPF的發(fā)生機制可能與ERS 的下游CHOP、PERK-NLRP3通路參與的炎癥因子密切相關(guān),這可能為肺纖維化的治療提供一種新的方法。

4.2 治療胰腺炎纖維化(pancreatitis fibrosis,PF)

PF是各種原因所致慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)的共同特征,以腺泡細胞破壞、萎縮和進行性纖維化為主要疾病特點一組多因素炎癥綜合征,NLRP3炎癥小體的激活是CP中多種慢性炎癥反應(yīng)和包括胰腺纖維化在內(nèi)的慢性纖維化的中心介導(dǎo)物[51]。

高麗娟等[52]用L-精氨酸建立CP胰腺纖維化動物模型,憑借免疫組化技術(shù)及 Western-blot 檢測 CP 胰腺纖維化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑的相關(guān)調(diào)控CHOP和GRP78的變化情況,發(fā)現(xiàn)模型組CHOP及GRP78蛋白表達顯著上升,經(jīng)予胰泰復(fù)方治療后,胰高組、胰中組、對照組CHOP及GRP78蛋白表達顯著減少,與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。有研究表明,大黃丹參可以降低高脂飲食誘發(fā)的胰腺纖維化大鼠ERS相關(guān)JNK(the c-Jun N-terminal kinases)、GRP和Caspase-12 mRNA蛋白表達,下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的過度凋亡發(fā)揮防治胰腺炎纖維化的作用[53]。另外,通過體外培養(yǎng)大鼠胰腺腺泡細胞系A(chǔ)R42J細胞,結(jié)果證明蒼術(shù)的藥物濃度超過1 mg/mL,細胞活力下降,證明蒼術(shù)能通過抑制腺泡細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細胞內(nèi)GRP78高表達,降低細胞上清液中腫瘤壞死因子TNF-α (tumor necrosis factor,TNF-α)和白介素的含量,從而抑制NF-κB核轉(zhuǎn)移來緩解急性胰腺炎的病理改變[54]。在大鼠胰腺星狀細胞纖維化的模型中,用氧化苦參堿干預(yù)后能抑制NLRP3炎性小體活化,下調(diào)α-SMA、FN、Co L-I、NLRP3、caspase1、IL-1β蛋白及mRNA表達而產(chǎn)生抗纖維化作用[55]。ERS發(fā)生時CHOP 和GRP78表達升高,并且伴隨炎癥因子大量分泌,因此推測ERS可能參與了NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)促進PF發(fā)展,但具體調(diào)控機制有待更多相關(guān)實驗證實。

5 中藥通過抑制NLRP3相關(guān)自噬通路,減輕炎癥反應(yīng)及調(diào)控細胞凋亡

5.1 治療肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)

自噬是機體的一種自食機制,可以吞噬細胞器或大分子蛋白質(zhì),降解損壞、衰老的細胞以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),自噬在肺纖維化中起著雙重作用[56]。

一方面,自噬通量的過度激活,誘導(dǎo)肺泡巨噬細胞凋亡(AM),凋亡的AM會再分泌大量炎癥因子,引起炎癥級聯(lián)反應(yīng),增強肺成纖維細胞的增殖和遷移,在矽肺肺纖維化的發(fā)展中起至關(guān)重要的作用。中草藥冬凌草的提取物冬凌草甲素具有抗炎、抗菌作用,研究表明,對矽塵所致的肺泡巨噬細胞損傷和炎性活化具有調(diào)節(jié)作用,高競妍建立矽肺模型,予冬凌草甲素按10 mg/kg 劑量給藥,結(jié)果發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素在體內(nèi)抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的表達和酶活性,并與矽肺模型組相比降低轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)和NF-κB p65表達,延緩矽肺小鼠肺炎和肺纖維化的發(fā)生發(fā)展[57]。Tan等[58]采集小鼠肺泡巨噬細胞,分為對照組、蒼術(shù)內(nèi)酯-1(ATL-Ⅰ)組(100 μmol/L)和二甲基亞砜(DMSO)組(100 μmol/L),研究結(jié)果顯示ATL-I組肺泡巨噬細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平顯著降低,且肺泡巨噬細胞中p-NF-κb表達水平、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II(LC3-II)/LC3-I比值也顯著降低,表明ATL-I是通過抑制肺泡巨噬細胞自噬活性,減少肺泡巨噬細胞炎性因子的釋放減矽肺纖維化。有研究顯示,大黃素能夠通過下調(diào)促凋亡蛋白-BCL2關(guān)聯(lián)X蛋白(BCL2 associated X protein,Bax)和促炎因子TGF-β1、TNF-α、IL-1β的表達,以及上調(diào)抗凋亡蛋白 BCL2 來抑制硅誘導(dǎo)過度自噬,抑制肺泡細胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗纖維化作用[59]。

另一方面,自噬功能發(fā)生障礙,自噬通量減少,可通過刺激細胞進行線粒體介導(dǎo)的 NLRP3 炎癥小體激活,使IL-1β和IL-18過度分泌,導(dǎo)致焦亡發(fā)生,并進一步加速肺纖維化的形成[60]。尚璐璐等[61]用5 ng/mL TGF-β1誘導(dǎo)A549 細胞48小時建立肺纖維化細胞模型,予柴胡皂甙d干預(yù)后可提高肺纖維化的自噬流受體,升高E- 鈣黏蛋白、Beclin1、LC3B-II/LC3B-I水平,下調(diào)Col-I、α-SMA、p62等自噬通量蛋白表達水平,減輕肺纖維化程度。杜思曈[62]建立實驗性矽肺小鼠模型,在實驗組小鼠肺組織中發(fā)現(xiàn)LC3II、自噬相關(guān)基因5(autophagy-related gene 5, ATG5)、BECN1和P62蛋白水平增高,同時建立小鼠肺泡巨噬細胞(MH-S)體外矽塵暴露模型,給予自噬激活劑結(jié)果提示自噬通量的減少可以增加矽塵所致的小鼠肺泡巨噬細胞(MH-S)的凋亡,予薯蕷皂苷干預(yù)后,通過激光共聚焦顯微鏡觀察到薯蕷皂苷可以促進MH-S細胞內(nèi)的自噬流,其機制是促進肺泡巨噬細胞的線粒體自噬,緩解矽塵誘導(dǎo)的線粒體ROS高表達,促進MH-S細胞自噬相關(guān)蛋白LC3II、BECN1的表達,減少P62蛋白的表達,并且降低矽塵誘導(dǎo)的肺泡巨噬細胞凋亡發(fā)揮抗纖維化作用。上述研究結(jié)果提示適度自噬在肺纖維化中具有保護作用。

5.2 治療腎纖維化(pulmonary fibrosis,PF)

自噬被認為在纖維化相關(guān)的多種慢性腎臟病(CKD)中起關(guān)鍵作用。研究證實,自噬可調(diào)節(jié)腎纖維化,Sun A N等[63]在單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)致腎小管間質(zhì)纖維化(TIF)中,敲除腎小管遠端TECs中特異性的自噬基因Atg7,發(fā)現(xiàn)LC3-II/LC3-I明顯減少,自噬明顯受到抑制,進一步研究發(fā)現(xiàn),腎遠端TECs特異性Atg7基因缺失后,可通過氧化DNA損傷促進受損線粒體的積累,ROS生產(chǎn)增多,激活NLRP3炎性小體。

升清降濁膠囊是在參芪地黃湯的基礎(chǔ)上配以小柴胡湯合升降散,具有益氣升清、利濕泄?jié)帷⒒钛鲋?是臨床上防治慢性腎臟病的常用方,童楠等[64]以10 ng/mL的TGF-β1為造模條件,制備不同濃度的含藥血清對體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞進行干預(yù),當(dāng)予以藥物干預(yù)后,升清降濁膠囊組α-SMA及 Collagen Ⅳ表達較對照組減少,MDC 綠色熒光較強,Beclin-1、LC3-II/I表達增加,提示升清降濁膠囊含藥血清可減輕TGF-β1干預(yù)下系膜細胞纖維化的形成,可能與其恢復(fù)自噬活性相關(guān)。姜黃素是一種非甾體類抗炎天然藥物,葛亮等[65]建立糖尿病腎病大鼠模型,予姜黃素干預(yù)后,通過促進自噬相關(guān)蛋白 LC3 表達水平增加,并阻止了 ECM 沉積改善糖尿病腎病的腎臟纖維化。黃芪皂苷A (CA)是黃芪的一種活性成分,Ren等[66]通過體內(nèi)實驗研究,發(fā)現(xiàn)CA可減輕糖尿病小鼠腎小球肥大、膠原基質(zhì)沉積和腎小管間質(zhì)纖維化,進一步進行體外研究,發(fā)現(xiàn)CA可以通過提高自噬升高LC3II/LC3I和Beclin1水平,并且在HK-2細胞中特異性過表達的NOX4,消除了TGF-β1誘導(dǎo)的細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、ROS生成和NLRP3蛋白表達,其機制可能通過靶向NOX4抑制改善NLRP3炎癥小體和提高自噬激活發(fā)揮抗腎纖維化作用。表明增加自噬通量可以清除受損的線粒體抑制 ROS 的產(chǎn)生,從而抑制 NLRP3 炎癥小體的激活。另外有研究也發(fā)現(xiàn),丹酚酸 B、大黃素、白藜蘆醇能升高LC3-II及 Beclin-1蛋白表達,加強自噬的激活,改善腎間質(zhì)纖維化而發(fā)揮保護腎臟的作用[67-69]。但是持續(xù)的自噬激活狀態(tài)下,導(dǎo)致自噬溶酶體在細胞內(nèi)大量聚集,不僅無法及時清除ECM,反而會導(dǎo)致細胞死亡促進疾病進展。

5.3 治療肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)

在肝纖維化進展中,HSC的異?；罨c增殖是纖維化進程的核心環(huán)節(jié),自噬參與HSC激活機制的研究也越來越受到關(guān)注。Li等[70]研究表明,自噬可以激活HSC,增加ECM的釋放,加劇纖維化的發(fā)展;除此之外,在自噬過程中,含有溶酶體的組織蛋白酶B (NLRP3炎癥小體的激活劑)會被釋放到細胞質(zhì)中,從而導(dǎo)致NLRP3炎癥小體的激活,并最終激活HSC。體外細胞實驗發(fā)現(xiàn),從中藥黃連、黃柏中分離出來的小檗堿通過改變LX-2細胞中p62 和LC3表達,下調(diào)Atg5 mRNA 及蛋白水平來抑制HSC 活化,增殖以及遷移,從而達到抗肝纖維化的效果[71]。同樣,有研究表明,人參皂苷Rg3、莪術(shù)醇、芍藥苷均能通過抑制肝臟中自噬基因Atg5,誘導(dǎo)肝星狀細胞自噬與壞死性凋亡,進而緩解肝損傷和肝纖維化[72-74];而柴胡皂素d通過增加p62表達和降低BECN1表達,抑制肝臟自噬的激活,顯著減輕了ccl4誘導(dǎo)的肝纖維化[75]。另外也有研究證明,姜黃素通過調(diào)節(jié)AMPK/PI3K/AKT/mTOR信號通路提高肝細胞自噬水平[76],雙氫青蒿素通過降低自噬底物p62,促進自噬治療肝纖維化[77],大蒜素能夠通過上調(diào)的Atg7水平,增強自噬流改善小鼠纖維化及肝損傷[78]。

6 中藥通過靶向NLRP3相關(guān)微小RNA,減輕炎癥損傷及抑制纖維化

微小RNA(MicroRNAs,miRNA)主要通過靶向mRNA影響基因表達水平,在調(diào)控包括炎癥在內(nèi)的多種細胞過程的基因表達中發(fā)揮重要作用。研究表明,miR-145被認為是某些纖維化疾病的調(diào)控因子,miR-22-3p、miR-21、miR-132、miR-181a等[79]微小MRA可靶向和調(diào)節(jié)巨噬細胞中的NLRP3,引起組織、細胞炎癥反應(yīng)。虎杖苷、山梨醇等中藥提取物能增強miR-200a,Keap1下調(diào),Nrf2抗氧化途徑失活,ROS驅(qū)動TXNIP表達降低,NLRP3炎癥小體受到抑制,從而減輕肝臟炎癥和脂質(zhì)沉積[80]。白芍總苷[81]可以通過調(diào)控 MALAT1/miR-876-5p/NLRP3 軸來抑制肝纖維化的發(fā)生。莪術(shù)醇可通過調(diào)控miR-125b/NLRP3信號通路的活動達到抗肝纖維化作用[82]。肉桂提取物可通靶向miR-21、miR-155的表達抑制NLRP3 炎癥小體活化,進而抑制肝纖維[83]。

在其他臟器纖維化方面,多項研究顯示,相同的中藥其有效成分能夠通過不同的靶點、信號對各臟器纖維化NLRP3通路起到一定程度的抑制作用,如人參皂苷既能通過抑制P2X7嘌呤能受體抑制鉀離子外流,又能改善線粒體功能障礙減少ROS產(chǎn)生,起到了改善肝纖維化和心肌纖維化的作用;莪術(shù)醇既能通過抑制肝臟中自噬通量,又能通過調(diào)控HSC中微小RNA,起到抑制NLRP3通路作用,減輕炎癥反應(yīng)起到抑制肝纖維化作用。又如,白藜蘆醇既能通過調(diào)節(jié)自噬水平也能靶向微小RNA,在心臟和血管保護,腎臟炎癥損傷等方面起到保護作用,在高糖誘導(dǎo)的成骨細胞凋亡模型中,白藜蘆醇可靶向調(diào)控miR-25抑制NF-κB信號通路,降低促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3的表達,起到發(fā)揮抗炎、抗纖維化作用[84]。黃芪甲苷具有抗氧化酶活性,在肺損傷和心肌損傷時釋放的大量ROS起到抑制作用[85],也有研究發(fā)現(xiàn),黃芪甲苷在糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化模型中降低了血清 NLRP3、Caspase-1及TGF-β蛋白表達水平,但通過調(diào)節(jié)或抑制NLRP3相關(guān)氧化應(yīng)激通路、離子信號通路還是自噬通路,具體中藥調(diào)控機制還未見報道。

7 結(jié)語與展望

綜上所述,NLRP3的活化在多種器官及組織纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用,本文綜述已發(fā)現(xiàn)的多種中藥的有效成分和中藥復(fù)合制劑可以通過干預(yù)NLRP3通路上游信號相關(guān)靶點,起到抑制炎癥反應(yīng)、減輕氧化應(yīng)激和調(diào)控細胞凋亡及增殖等,從而抑制纖維化進展,但由于NLRP3的相關(guān)信號通路比較多,各器官纖維化發(fā)病機制因細胞類型、起效靶細胞和炎性小體啟動下游信號分子的不同,使中醫(yī)藥在調(diào)控NLRP3相關(guān)纖維化疾病多從藥效加以驗證,對其具體的調(diào)控機制研究不夠深入,進一步剖析膜受體通路之間的相互關(guān)系及藥物干預(yù)靶點,闡釋其機制作用,為中藥提取物應(yīng)用于臨床治療纖維化的提供重要研究方向。