嚴(yán)培虎 郭金有 李偉 張瑞漢 張百飛 劉源 張政 于富強(qiáng) 謝高山

膽囊癌是一種非常兇險(xiǎn)的惡性腫瘤,原發(fā)于膽囊黏膜上皮,早期沒有明顯典型癥狀,容易誤診,且病情進(jìn)展迅速,可很快發(fā)展到晚期,預(yù)后非常差,被譽(yù)為“癌中之王”,極大危害患者生命安全[1-3]。缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)在缺氧環(huán)境中表達(dá)升高,可通過提高血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)而促進(jìn)腫瘤血管生成,進(jìn)而促使結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤體內(nèi)生長和惡性進(jìn)展[4,5],下調(diào)HIF-1α可降低基質(zhì)金屬肽酶9表達(dá),進(jìn)而抑制缺氧誘導(dǎo)的GBC-SD細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和其異種移植模型中腫瘤生長[6],下調(diào)HIF-1α/VEGF可抑制缺氧誘導(dǎo)GBC-SD細(xì)胞遷移和體內(nèi)生長[7],因此HIF-1α/VEGF是膽囊癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的重要調(diào)控信號(hào)。金合歡素是一種廣泛存在于金合歡樹、刺槐、菊花等植物中的天然黃酮類化合物,具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎抑菌、抗腫瘤等多重生物活性,可增加細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生,對結(jié)直腸癌發(fā)揮抗腫瘤和誘導(dǎo)凋亡的作用[8,9],并可作為雪菊總黃酮的活性成分之一,抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移[10],因而推測金合歡素可能因其抗癌活性來治療膽囊癌。本文基于HIF-1α/VEGF信號(hào)通路,分析探究金合歡素對膽囊癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)作用,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 HUVEC細(xì)胞(貨號(hào)SNL-503)、人膽囊癌細(xì)胞GBC-SD(貨號(hào)SNL-230)、RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%血清與雙抗,貨號(hào)SNM-001E)購自武漢尚恩生物技術(shù)有限公司;金合歡素(HPLC≥98%,貨號(hào):IA1150)、ANNEXIN V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒(貨號(hào)CA1020)、人VEGF酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(貨號(hào)SEKH-0052)、CCK-8試劑盒(貨號(hào)CK04)、0.1%結(jié)晶紫染色液(貨號(hào)G1063)、兔SP檢測試劑盒(貨號(hào)SP0021)購自北京索萊寶科技有限公司;Matrigel膠(貨號(hào)354248)購自BD Biocoat公司;一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒(貨號(hào)QYR0604)購自北京啟研生物科技有限公司;TRIzol試劑(貨號(hào)15596026)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;兔源抗人Anti-HIF-1α一抗(貨號(hào)ab179483)、兔源抗人Anti-CD31一抗(貨號(hào)ab76533)、HRP偶聯(lián)驢抗兔二抗(貨號(hào)ab205722)購自Abcam公司;兔源抗人Anti-VEGF一抗(貨號(hào)AF1309)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司等。

1.2 儀器 酶聯(lián)免疫分析儀(ST-MB96A)購自山東三體儀器有限公司;研究級生物顯微鏡(XSP-13CA)購自上海光學(xué)儀器一廠;流式細(xì)胞分析儀(NovoCyte Advanteon)購自安捷倫科技(中國)有限公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(MA-6000)購自蘇州雅睿生物技術(shù)有限公司;電泳系統(tǒng)(XCell SureLock Mini-Cell)、轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(XCell II Blot Module)購自賽默飛世爾(中國)科技有限公司;石蠟切片機(jī)(QPJ-1B)購自濟(jì)南童鑫生物科技有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 采用CCK-8法檢測不同濃度金合歡素處理后GBC-SD細(xì)胞增殖率:凍存的GBC-SD細(xì)胞置于39.8℃溫水浴中快速解凍,離心后加入適量RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至約80%融合后傳代,接種在無菌96孔板培養(yǎng),每孔約104個(gè)細(xì)胞,24 h后分別以終濃度0、10、25、50、100、150 μmol/L的金合歡素處理[11]。將不接種GBC-SD細(xì)胞的培養(yǎng)孔作為空白對照,0 μg/ml金合歡素處理的GBC-SD細(xì)胞作為對照,不同濃度金合歡素處理24 h后,根據(jù)CCK-8試劑盒的制造商說明測定吸光值,參考其說明書中指導(dǎo)計(jì)算增殖率,增殖率=(吸光值處理組-吸光值空白對照組)/(吸光值對照組-吸光值空白對照組)×100%。

1.3.2 細(xì)胞分組處理及采集標(biāo)本:將GBC-SD細(xì)胞傳代接種在24孔板中,每孔約1.5×105個(gè)細(xì)胞,分為對照組、金合歡素低、高劑量組、金合歡素高劑量+空載組、金合歡素高劑量+HIF-1α過表達(dá)組,培養(yǎng)24 h后分組處理:對照組不做處理,金合歡素低劑量組、金合歡素高劑量組細(xì)胞分別以終濃度50、100 μmol/L的金合歡素處理,金合歡素高劑量+空載組細(xì)胞以終濃度100 μmol/L的金合歡素處理的同時(shí)以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒,金合歡素高劑量+HIF-1α過表達(dá)組以終濃度100 μmol/L的金合歡素處理的同時(shí)轉(zhuǎn)染HIF-1α過表達(dá)質(zhì)粒,24 h后收集細(xì)胞沉淀備用。

1.3.3 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡法檢測GBC-SD細(xì)胞HIF-1α、VEGF表達(dá):實(shí)時(shí)熒光定量PCR:TRIzol試劑提取1.3.2中各組GBC-SD細(xì)胞的總RNA,測出其濃度后每組取適量總RNA、各基因引物與一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒中預(yù)混液混合,參考試劑盒說明書中方法設(shè)定反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),獲得各組基因Ct值后以2-ΔΔCt算法分析,同時(shí)采用GAPDH做HIF-1α、VEGF的內(nèi)參,最終量化各組基因相對表達(dá)。免疫印跡法:采用蛋白提取試劑盒制備總蛋白。裂解產(chǎn)物經(jīng)10% SDS-PAGE分離,并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用5%脫脂牛奶封閉膜,然后用HIF-1α、VEGF一抗和特異性二抗孵育。最后在ChemiDoc MP成像系統(tǒng)下捕獲印跡并使用Image J軟件進(jìn)行分析。見表1。

1.3.4 采用CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)檢測各組GBC-SD細(xì)胞增殖率、凋亡率:CCK-8法:將GBC-SD細(xì)胞接種在96孔板(1×104個(gè)/孔)中,24 h后根據(jù)1.3.2中的方法處理,24 h后按照1.3.1的方法檢測并計(jì)算增殖率。流式細(xì)胞術(shù):將GBC-SD細(xì)胞傳代接種在24孔板中,每孔約1.5×105個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后按照1.3.2中步驟進(jìn)行分組處理,24 h后采集各組GBC-SD細(xì)胞,采用ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒對各組細(xì)胞(2×105個(gè))進(jìn)行處理,在流式細(xì)胞儀上檢測各組GBC-SD細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組GBC-SD細(xì)胞侵襲數(shù)、遷移率:Transwell侵襲實(shí)驗(yàn):將1.3.2中收集的各組細(xì)胞PBS洗滌、RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基(不含胎牛血清)、計(jì)數(shù)后每組取約2×105個(gè),接種在Transwell培養(yǎng)板上室中(Matrigel膠包被過夜),同時(shí)在Transwell培養(yǎng)板下室中加入適量RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清),繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h,洗滌、固定穿梭侵襲到下室的細(xì)胞后采用0.1%結(jié)晶紫染色液染色,洗滌后采用生物顯微鏡觀察并攝制各組細(xì)胞圖片,以Image J軟件定量圖片中各組侵襲細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):將GBC-SD細(xì)胞傳代接種在24孔板中,每孔約1.5×105個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后按照1.3.2中步驟進(jìn)行分組處理,24 h后使用槍頭在每個(gè)培養(yǎng)孔中央劃一條直線,洗去劃痕中細(xì)胞后采用生物顯微鏡觀察并攝制各組細(xì)胞圖片,以Image J軟件定量圖片中各組劃痕寬度H0h,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h再次測量各組劃痕寬度H24h,計(jì)算各組細(xì)胞遷移率,公式為:遷移率=(H0h-H24h)/H0h×100%。

1.3.6 采用ELISA和小管形成實(shí)驗(yàn)分別檢測GBC-SD細(xì)胞VEGF產(chǎn)生水平、HUVEC細(xì)胞成管長度:①ELISA:將GBC-SD細(xì)胞傳代接種在24孔板中,每孔約1.5×105個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后按照1.3.2中步驟進(jìn)行分組處理,24 h后收集培養(yǎng)基后離心得到其條件培養(yǎng)基,采用ELISA試劑盒測定其中VEGF水平,具體步驟根據(jù)制造商說明書中指導(dǎo)進(jìn)行。②小管形成實(shí)驗(yàn):將HUVEC細(xì)胞傳代接種在經(jīng)Matrigel膠提前包被過的24孔板中,每孔約1.5×105個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后加入上述收集的各組GBC-SD細(xì)胞條件培養(yǎng)基分組處理,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后采用生物顯微鏡觀察并攝制各組細(xì)胞圖片,以Image J軟件定量圖片中各組HUVEC的成管長度。

1.3.7 建立GBC-SD裸鼠移植瘤模型后檢測各組裸鼠腫瘤組織微血管密度(CD31表達(dá))及腫瘤體積:參考文獻(xiàn)構(gòu)建GBC-SD裸鼠移植瘤模型[12]:取1.3.2中收集的分組處理后的各組GBC-SD細(xì)胞,以PBS重懸、計(jì)數(shù)后制成密度為1×107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,于裸鼠右腋皮下注射上述各組細(xì)胞懸液200 μl,1周后觀察到有皮下硬質(zhì)結(jié)節(jié)出現(xiàn)表明裸鼠移植瘤模型構(gòu)建成功,4周后頸椎脫臼處死各組裸鼠后剝離出腫瘤組織,測量其長徑a和短徑b,計(jì)算出各組腫瘤體積,公式為:腫瘤體積(mm3)=1/2×a×b2,然后對腫瘤組織進(jìn)行固定、脫水、石蠟包埋、切片后,選出無褶皺的薄片脫蠟、水化、封閉后孵育兔源抗人Anti-CD31一抗,洗滌后采用兔SP檢測試劑盒孵育二抗、DAB顯色,按照其試劑盒說明指導(dǎo)進(jìn)行免疫組化染色,洗滌、中性樹脂封片后采用生物顯微鏡觀察并攝制各組細(xì)胞圖片,以Image J軟件定量圖片中各組細(xì)胞總數(shù)量和CD31陽性細(xì)胞數(shù)量,計(jì)算各組細(xì)胞CD31陽性細(xì)胞比例,公式為:CD31陽性細(xì)胞比例=CD31陽性細(xì)胞數(shù)量/細(xì)胞總數(shù)量×100%。

2 結(jié)果

2.1 金合歡素作用濃度確定 10、25、50、100、150 μmol/L的金合歡素可抑制GBC-SD細(xì)胞增殖,并隨濃度的升高而抑制作用增強(qiáng),本文擇IC50值附近的50、100 μmol/L的金合歡素處理GBC-SD細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

圖1 不同濃度金合歡素對GBC-SD細(xì)胞增殖率的影響

2.2 金合歡素對GBC-SD細(xì)胞HIF-1α/VEGF通路蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比,金合歡素低、高劑量組GBC-SD細(xì)胞HIF-1α、VEGF mRNA與蛋白表達(dá)均降低(P<0.05),金合歡素高劑量組GBC-SD細(xì)胞HIF-1α、VEGF mRNA與蛋白表達(dá)相比金合歡素低劑量組進(jìn)一步降低(P<0.05)。與金合歡素高劑量組相比,金合歡素高劑量+HIF-1α過表達(dá)組GBC-SD細(xì)胞HIF-1α、VEGF mRNA與蛋白表達(dá)升高(P<0.05);金合歡素高劑量+空載組GBC-SD細(xì)胞HIF-1α、VEGF mRNA與蛋白表達(dá)無顯著變化(P>0.05)。見圖2,表2。

圖2 免疫印跡檢測GBC-SD細(xì)胞HIF-1α/VEGF通路蛋白表達(dá);A 對照組;B 金合歡素低劑量組;C 金合歡素高劑量組;D 金合歡素高劑量+空載組;E 金合歡素高劑量+HIF-1α過表達(dá)組

表2 5組GBC-SD細(xì)胞HIF-1α、VEGF蛋白相對表達(dá)

2.3 金合歡素對GBC-SD細(xì)胞增殖與凋亡的影響 與對照組相比,金合歡素低、高劑量組GBC-SD細(xì)胞增殖率均降低(P<0.05),凋亡率均升高(P<0.05);金合歡素高劑量組與金合歡素低劑量組相比,GBC-SD細(xì)胞增殖率降低(P<0.05),凋亡率升高(P<0.05)。與金合歡素高劑量組相比,金合歡素高劑量+HIF-1α過表達(dá)組GBC-SD細(xì)胞增殖率升高(P<0.05),凋亡率降低(P<0.05);金合歡素高劑量+空載組GBC-SD細(xì)胞增殖率、凋亡率無顯著變化(P>0.05)。見圖3,表3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測5組GBC-SD細(xì)胞凋亡率(×200)

表3 5組GBC-SD細(xì)胞增殖率、凋亡率 n=6,%,

2.4 金合歡素對GBC-SD細(xì)胞侵襲與遷移的影響 與對照組相比,金合歡素低、高劑量組GBC-SD細(xì)胞侵襲數(shù)與遷移率下降(P<0.05);金合歡素高劑量組與金合歡素低劑量組相比,GBC-SD細(xì)胞侵襲數(shù)、遷移率下降(P<0.05)。與金合歡素高劑量組相比,金合歡素高劑量+HIF-1α過表達(dá)組GBC-SD細(xì)胞侵襲數(shù)與遷移率升高(P<0.05);金合歡素高劑量+空載組GBC-SD細(xì)胞侵襲數(shù)與遷移率無顯著變化(P>0.05)。見圖4、5,表4。

圖4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測各組GBC-SD細(xì)胞侵襲數(shù)(×200)

圖5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測5組GBC-SD細(xì)胞遷移率(×200)

表4 5組GBC-SD細(xì)胞侵襲數(shù)與遷移率n=6,%,

2.5 金合歡素對GBC-SD細(xì)胞分泌VEGF及HUVEC細(xì)胞成管的影響 與對照組相比,金合歡素低、高劑量組GBC-SD細(xì)胞培養(yǎng)基中VEGF水平、HUVEC細(xì)胞成管長度均降低(P<0.05),金合歡素高劑量組GBC-SD細(xì)胞培養(yǎng)基中VEGF水平、HUVEC細(xì)胞成管長度相比金合歡素低劑量組進(jìn)一步降低(P<0.05)。與金合歡素高劑量組相比,金合歡素高劑量+HIF-1α過表達(dá)組GBC-SD細(xì)胞培養(yǎng)基中VEGF水平、HUVEC細(xì)胞成管長度升高(P<0.05);金合歡素高劑量+空載組GBC-SD細(xì)胞培養(yǎng)基中VEGF水平HUVEC細(xì)胞成管長度無顯著變化(P>0.05)。見圖6,表5。

圖6 5組HUVEC細(xì)胞成管情況(×200)

表5 5組HUVEC細(xì)胞成管長度 n=6,

2.6 金合歡素對GBC-SD移植瘤裸鼠微血管密度(CD31表達(dá))及腫瘤體積的影響 與對照組相比,金合歡素低、高劑量組GBC-SD裸鼠腫瘤組織CD31陽性細(xì)胞比例及腫瘤體積均降低(P<0.05);金合歡素高劑量組相較于金合歡素低劑量組,GBC-SD裸鼠腫瘤組織CD31陽性細(xì)胞比例、腫瘤體積更低(P<0.05)。與金合歡素高劑量組相比,金合歡素高劑量+HIF-1α過表達(dá)組GBC-SD裸鼠腫瘤組織CD31陽性細(xì)胞比例及腫瘤體積升高(P<0.05);金合歡素高劑量+空載組GBC-SD裸鼠腫瘤組織CD31陽性細(xì)胞比例及腫瘤體積無顯著變化(P>0.05)。見圖7,表6。

圖7 GBC-SD移植瘤裸鼠腫瘤組織CD31表達(dá)(免疫組化×200)

表6 5組GBC-SD移植瘤裸鼠腫瘤組織CD31陽性細(xì)胞比例及腫瘤體積 n=6,

3 討論

目前膽囊癌的臨床療手段單一,對放化療均不敏感,因而除了手術(shù)切除之外,還沒有很好的輔助治療手段,并且還易發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移,患者生存期很短,死亡率很高,急需開發(fā)新的更有效治療方式[13,14]。

總黃酮是一大類天然產(chǎn)物,作為中藥的有效成分,可抑制腫瘤細(xì)胞生長、增殖及侵襲轉(zhuǎn)移,對肺癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤均具有一定的防治作用[15],金合歡素作為一種廣泛存在于各種藥用植物中的天然黃酮類化合物,可以劑量和時(shí)間依賴的方式抑制肝癌細(xì)胞增殖、存活和血管生成[16],并可減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,抑制間皮細(xì)胞誘發(fā)的卵巢癌惡性特征,降低卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲能力[17]。

本文以不同劑量金合歡素處理GBC-SD細(xì)胞,可降低細(xì)胞增殖率、侵襲數(shù)、遷移率、GBC-SD細(xì)胞培養(yǎng)基中VEGF水平、HUVEC細(xì)胞成管長度、裸鼠腫瘤組織CD31陽性細(xì)胞比例及腫瘤體積,升高其凋亡率,表明金合歡素可降低膽囊癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移力,減少VEGF產(chǎn)生分泌,抑制膽囊癌移植瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤生長和血管生成,顯著抑制膽囊癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為,對膽囊癌發(fā)揮明顯抗癌功效,揭示金合歡素在膽囊癌的臨床治療中具有很好的應(yīng)用前景。

研究表明,HIF-1α可通過調(diào)控糖酵解介導(dǎo)膽囊癌或膽管癌、結(jié)直腸癌、胃癌等多種腫瘤的發(fā)生及惡性進(jìn)展,缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α的高表達(dá)與腫瘤患者較短的總生存期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性、更深的侵襲顯著相關(guān)[18],缺氧條件下HIF-1α的激活還可上調(diào)VEGF表達(dá),促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長、遷移、侵襲血管生成、和其體內(nèi)腫瘤生長[19],抑制HIF-1α/VEGFA表達(dá)可成功抑制肝癌體內(nèi)腫瘤生長和血管生成[20]。

本文結(jié)果顯示,以不同劑量金合歡素處理GBC-SD細(xì)胞,可降低細(xì)胞HIF-1α、VEGF mRNA與蛋白表達(dá),表明HIF-1α/VEGF信號(hào)參與介導(dǎo)金合歡素對膽囊癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制過程。本文還發(fā)現(xiàn),金合歡素和HIF-1α過表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合處理可提高GBC-SD細(xì)胞HIF-1α、VEGF mRNA與蛋白表達(dá),并升高其增殖率、侵襲數(shù)、遷移率、GBC-SD細(xì)胞培養(yǎng)基中VEGF水平、HUVEC細(xì)胞成管長度、裸鼠腫瘤組織CD31陽性細(xì)胞比例及腫瘤體積,降低其凋亡率,表明過表達(dá)HIF-1α可減弱金合歡素對GBC-SD細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的抑制作用,消除其對膽囊癌移植瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤生長和血管生成的減輕作用,最終逆轉(zhuǎn)金合歡素對膽囊癌的抗癌功效,揭示金合歡素對膽囊癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制是通過下調(diào)HIF-1α實(shí)現(xiàn)的。

總之,本文結(jié)果證實(shí)了金合歡素可降低HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá),抑制膽囊癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,誘導(dǎo)其凋亡,并減輕其體內(nèi)腫瘤生長和血管生成,最終減弱其惡性生物學(xué)行為,下調(diào)HIF-1α/VEGF信號(hào)通路可能是其藥理機(jī)制之一,本文為膽囊癌的臨床治療提供了金合歡素這一新的藥物候選,有利于膽囊癌患者生存期的延長。