李傳金 姜波 王德利 劉經(jīng)星 唐小莉

中風(Stroke)一種常見的急性腦血管病,發(fā)病率、復(fù)發(fā)率和死亡率都較高[1,2]。缺血性中風約占所有中風病例的80%。這是由于大腦供血的局部或全身減少,導(dǎo)致缺血或梗死,神經(jīng)功能喪失或腦卒中[3]。中風導(dǎo)致的腦缺血導(dǎo)致ATP水平降低、乳酸積累和炎癥級聯(lián)反應(yīng)的激活,從而導(dǎo)致腦組織缺血和壞死[4]。腦缺血損傷的臨床治療包括恢復(fù)血流和腦再灌注,從而減少中風引起的梗死面積和神經(jīng)功能缺損。然而,腦再灌注在恢復(fù)過程中導(dǎo)致?lián)p傷增加,稱為腦缺血再灌注損傷(CIRI)[5]。最近的研究表明,線粒體功能障礙、氨基酸釋放、鈣超載、活性氧(ROS)的產(chǎn)生、氮的形成、環(huán)狀RNA(circRNAs)、炎癥和細胞凋亡與CIRI的發(fā)病機制有關(guān)[6,7]。電針(Electroacupuncture ,EA)具有雙重治療效果,是一種簡單、方便和成本效益高的治療方案,已廣泛用于治療腦缺血后的認知障礙[8,9]。如百會(GV 20)和大椎(GV 14)穴位的電針導(dǎo)致CIRI大鼠大腦皮層的超微結(jié)構(gòu)改變[10];GV 20和神庭(GV24)穴位的EA刺激可以顯著改善MCAO/R誘導(dǎo)的認知缺陷和行為功能障礙[11,13]。研究表明,細胞焦亡在神經(jīng)認知障礙的形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[14]。炎癥體的激活是調(diào)控細胞焦亡的經(jīng)典途徑。NLRP3通過包含CARD的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)等連接蛋白募集caspase-1,并誘導(dǎo)其前體蛋白酶(pro-caspase-1)發(fā)生自水反應(yīng)?；罨腸aspase-1可有效觸發(fā)下游因子引起細胞焦亡[15,16]。NLRP3作為腦缺血后中樞神經(jīng)系統(tǒng)無菌性炎性反應(yīng)的啟動因子,誘導(dǎo)細胞焦亡,導(dǎo)致神經(jīng)細胞損傷,在腦缺血/再灌注后炎癥級聯(lián)效應(yīng)中起關(guān)鍵作用[17,18]。如EA通過α7nAChR介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體抑制減輕腦卒中大鼠腦缺血損傷和神經(jīng)炎癥[19]。另外,介導(dǎo)細胞焦亡的經(jīng)典caspase-1信號通路在中風后被激活,并加劇腦損傷,而抑制caspase-1激活可減少中風損傷并發(fā)揮保護作用[20,21]。本研究的目的是通過NLRP3/caspase-1途徑信號通路研究聯(lián)合高頻重復(fù)經(jīng)顱刺激GV20和GV24穴位是否能改善大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusio,MCAO)后的學習和記憶障礙。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 從北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司獲得36只無特異性病原體的雄性 Sprague-Dawley 大鼠[10～12周齡,體重(260±20) g]。大鼠在22℃度和濕度50% 的環(huán)境中,以12 h/12 h的光照/黑暗周期飼養(yǎng)。對于安樂死,使用2% 的戊巴比妥。將36只大鼠隨機分為假手術(shù)組、 MCAO 組和 MCAO + 電針組,每組12只。本實驗獲得十堰市人民醫(yī)院動物倫理委員會批準。

1.2 MCAO模型建立 MCAO模型使用Longa方法建立[22]?；诟牧嫉膄ornylon縫合法,通過頸部切口仔細暴露左側(cè)頸總動脈、左側(cè)頸外動脈和頸內(nèi)動脈并解剖。將約18～22 mm的尼龍單絲插入頸內(nèi)動脈并推進,直至大腦中動脈的起點被阻斷。閉塞120 min后,提取尼龍單絲以恢復(fù)血流。對于假手術(shù)組,單純分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈。在手術(shù)期間和之后,使用加熱墊將動物的內(nèi)部溫度保持在37℃。神經(jīng)功能缺損評分用于評估MCAO的成功。

1.3 EA治療 MCAO手術(shù)后2 h,MCAO+EA組的大鼠使用EA裝置在百會(GV20,位于頂骨中心)和神庭(GV24,位于前中線)穴位接受EA治療。將針刺針以45°角插入頭部GV20和GV24穴位2～3 mm的深度。刺激參數(shù)如下:擴張波頻率,1～20 Hz;6 V峰值電壓;2 mA強度,30 min/d,連續(xù)8 d。

1.4 神經(jīng)功能缺損評分 再灌注后2 h和電針治療第8天,使用Longa評分量表評估神經(jīng)功能[22]:0表示無神經(jīng)功能缺損,1表示輕度缺損(未能完全伸展右前爪),2表示向右繞圈,3表示向右跌倒,提示中度缺損,4個代表嚴重缺陷(完全喪失行走能力)。得分在1～3表明MCAO建模成功,并被納入后續(xù)實驗。

1.5 水迷宮試驗 為了評估學習和記憶能力,如先前的研究方法所述[23,24],在手術(shù)后第4天開始使用Morris水迷宮測試大鼠。從第4天到第8天對大鼠進行訓練,并在第9天進行測試。Morris水迷宮測試由兩部分組成:地點導(dǎo)航測試和空間探針測試。水迷宮裝置由直徑150 cm、高度60 cm的圓形水池組成。攝像機記錄并觀察老鼠的活動。在位置導(dǎo)航測試中,大鼠被隨機分配到四個象限中的一個,并被允許找到一個隱藏的平臺。然后,記錄大鼠爬上平臺所需的時間,上限為90 s。如果大鼠在90 s內(nèi)爬上平臺并停留超過3 s,則認為大鼠找到了平臺,時間記錄為潛伏期。如果大鼠在90 s內(nèi)無法定位平臺,則將其手動引導(dǎo)至平臺,并讓其在10 s內(nèi)熟悉平臺位置。對于必須被引導(dǎo)到平臺的大鼠,潛伏期記錄為90 s。每天上午10∶00開始訓練,大鼠每天訓練4次,每次訓練間隔10 min,連續(xù)5 d。延遲被記錄為到達平臺所需的時間,并在4次訓練中取平均值。為了進行空間探測測試,在第6天移除隱藏平臺,并測試大鼠記住隱藏平臺位置的能力。讓大鼠自由游泳90 s,并記錄在90 s的試驗中,大鼠游到平臺先前位置的次數(shù)。

1.6 2,3,5-三苯基氯化四唑染色 如前研究方法所述[25],使用2,3,5-三苯基四氮唑氯化物染色在形態(tài)學水平上評估腦梗死。簡而言之,在Morris迷宮試驗后,通過心臟向大鼠灌注0.9%氯化鈉溶液,然后迅速取出大腦并在-20℃下冷凍30 min。將腦組織切成5個2 mm冠狀切片,立即在37℃的2%2,3,5-三苯基四氮唑氯化物溶液中培養(yǎng)20 min,然后在黑暗中固定在4%聚甲醛中24 h。用相機拍攝染色部分。計算腦梗死體積百分比。

1.7 透射電子顯微鏡 透射電子顯微鏡用于觀察神經(jīng)元凋亡和自噬的變化[26]。麻醉后,用3%戊二醛和1.5%多聚甲醛的混合物在4℃下固定皮層缺血周圍區(qū)域8 d,然后用1%四氧化鋨在碳酸鈣緩沖液中固定2 h。在室溫下用0.1%磷酸鹽緩沖液洗滌切片。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌后,將樣品用30%～100%乙醇丙酮梯度脫水,加入Epon Araldite 618混合物中2 h,然后切成80 nm的模塊化超薄切片,并用電子顯微鏡觀察。

1.8 Western blot 蛋白質(zhì)提取以及Western Blot檢驗的相關(guān)步驟參考Wang等[27]的方法進行。一抗主要有兔抗β-actin NLRP3、caspase-1(Abcam)。二抗山羊抗兔IgG(Thermo Fisher Scientific,USA)。

1.9 HE染色 腦組織切片分別用二甲苯和無水乙醇脫蠟2次,并水合。清潔后,使用蘇木精染色10 min。用1%鹽酸乙醇進行區(qū)分,用1/400氨水進行發(fā)藍。清洗后,用伊紅染色5 min。乙醇逐漸脫水。二甲苯透明2次,并用中性樹脂密封。在顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)細胞的形態(tài),以判斷神經(jīng)細胞損傷的程度。

1.10 免疫熒光 冷凍切片在乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)溶液(Servicebio,China)中煮沸用于抗原提取,并在室溫下用3%牛血清白蛋白封閉30 min。然后,將切片在4℃下與一抗抗caspase-1(和NLRP3的孵育過夜。然后,將切片與相應(yīng)的二級抗體在室溫下孵育90 min。將切片在PBS中洗滌3次(5 min/次),并使用DAPI對干燥切片染色10 min。通過熒光素(FITC)TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。在顯微鏡下觀察腦組織的形態(tài)學變化。隨機選擇海馬CA1區(qū)的2個90×視野進行攝影。陽性細胞數(shù)按以下公式計算:雙染色細胞/總細胞×100%。

2 結(jié)果

2.1 EA減輕局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能缺損和梗死體積 在本研究中,神經(jīng)評分用于評估應(yīng)用于GV20和GV24穴位的電針是否能改善MCAO后的神經(jīng)功能。神經(jīng)評分降低表明神經(jīng)功能改善。假手術(shù)組的大鼠沒有表現(xiàn)出任何神經(jīng)缺陷的跡象。然而,MCAO后4～8 d,與MCAO組相比,MCAO+EA組的神經(jīng)評分顯著降低(P<0.05)。使用2,3,5-三苯基四氮唑氯化物染色測量梗死體積。MCAO組和MCAO+EA組的腦梗死體積顯著大于假手術(shù)組,表明MCAO模型成功建立。術(shù)后8 d,MCAO+EA組的腦梗死體積相較于與MCAO組顯著減少,表明EA對預(yù)防局灶性腦損傷具有顯著療效。見表1、2,圖1。

圖1 EA減輕局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能缺損和梗死體積

表1 3組大鼠腦梗死體積的定量結(jié)果 %,

表2 EA對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)評分的影響 只

2.2 EA治療抑制局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠缺血周圍皮質(zhì)細胞凋亡 在透射電子顯微鏡下,假手術(shù)組可以觀察到豐富的線粒體、完整的線粒體嵴、有序的溶酶體和完整的細胞核仁。觀察到大軸突,染色質(zhì)均勻分布。在MCAO組中,線粒體腫脹,線粒體嵴被破壞,溶酶體出現(xiàn)紊亂,細胞在缺血周圍皮質(zhì)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)紊亂,在神經(jīng)元細胞核邊緣觀察到常染色質(zhì)。所有這些觀察結(jié)果與早期凋亡信號一致。MCAO+EA組細胞膜部分破裂,線粒體輕度受損。MCAO+EA組未觀察到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和染色質(zhì)的變化,細胞核仁完整,染色質(zhì)均勻分布。接著探究了EA對局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠缺血周圍皮質(zhì)NLRP3/caspase-1信號通路的影響。 Western blot分析結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,MCAO組缺血周圍皮質(zhì)中NLRP3、caspase-1的水平顯著升高;與MCAO組相比,MCAO+EA組顯示缺血周圍皮質(zhì)中NLRP3、caspase-1的水平顯著降低。這些結(jié)果表明,EA可以抑制NLRP3/caspase-1信號通路的活性。見圖2,表3。

圖2 EA治療抑制局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠缺血周圍皮質(zhì)細胞凋亡;A 透射電子顯微鏡細胞形態(tài);B 檢測NLRP3、caspase-1的水平

表3 3組大鼠缺血周圍皮質(zhì)NLRP3/caspase-1信號通路相關(guān)蛋白的檢測結(jié)果

2.3 EA對腦缺血/再灌注損傷后海馬神經(jīng)元損傷的形態(tài)學觀察 既往研究表明EA治療對腦缺血/再灌注損傷海馬神經(jīng)元具有細胞保護作用。HE染色顯示,MCAO組海馬神經(jīng)元數(shù)量減少,排列松散,可見空泡樣改變和不規(guī)則的核形態(tài)。MCAO+EA組海馬神經(jīng)元的病理變化減少,神經(jīng)元變性或壞死減少。TUNEL染色結(jié)果顯示,MCAO組中觀察到觀察到大量TUNEL和caspase-1雙染色神經(jīng)元,MCAO+EA組的TUNEL和caspase-1陽性率顯著降低。此外,MCAO大鼠海馬神經(jīng)元中caspase-1和NLRP3共定位的表達。EA治療可有效減少MCAO大鼠神經(jīng)元中caspase-1和NLRP3共定位表達。見圖3,表4。

圖3 EA對腦缺血/再灌注損傷后海馬神經(jīng)元損傷的形態(tài)學觀察;A HE染色;B TUNEL染色

表4 3組大鼠缺血周圍皮質(zhì)NLRP3/caspase-1信號通路相關(guān)蛋白的檢測結(jié)果

2.4 EA減輕局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠的學習和記憶損傷 Morris水迷宮試驗用于評估大鼠的認知能力。在位置導(dǎo)航試驗中,MCAO組大鼠的平均潛伏期比假手術(shù)組大鼠長。與MCAO組的潛伏期相比,MCAO+EA組的潛伏期顯著降低。在空間探針測試期間,MCAO組穿過目標象限的頻率低于假手術(shù)組。然而,與MCAO組相比,MCAO+EA組更頻繁地穿過目標象限。這些結(jié)果表明,EA治療顯著改善了MCAO大鼠的學習和記憶能力。見表5、6。

表5 3組大鼠在空間探針試驗中穿過目標象限的次數(shù)

表6 EA對局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠位置導(dǎo)航試驗潛伏期的影響

3 討論

大量臨床研究證實,EA刺激穴位可促進中風癥狀和癱瘓肢體功能的恢復(fù),并可顯著改善缺血性中風患者的認知水平和運動功能[28,29]。然而,這種影響的潛在作用機制尚未完全闡明。

許多研究表明,腦缺血后,神經(jīng)功能損傷和細胞死亡在第一天達到峰值,然后逐漸減少并穩(wěn)定[30]。腦缺血后早期的EA治療可以增加腦血流,降低腦缺血/再灌注損傷的程度,并擴大治療時間窗[31,32]。這表明針灸治療的最佳時間是缺血后3 h內(nèi)。因此,我們選擇腦缺血損傷后1.5 h和腦缺血后1 d的EA作為觀察時間。既往研究表明,EA可以改善肢體運動功能,并對腦缺血/再灌注損傷具有一定的神經(jīng)保護作用[33,34]。這項研究的結(jié)果表明,EA可以顯著改善腦缺血/再灌注后的神經(jīng)功能缺損癥狀。

具有異常外觀的線粒體,如腫脹或無組織的線粒體,被認為是誘導(dǎo)缺血周圍區(qū)域凋亡的主要因素[35,36],導(dǎo)致神經(jīng)元代謝和發(fā)育異常[37,38]。本研究發(fā)現(xiàn)EA治療的腦缺血/再灌注大鼠神經(jīng)元變性或壞死減少。細胞焦亡最明顯的特征是迅速形成質(zhì)膜孔、細胞腫脹和滲透性壞死,釋放大量細胞內(nèi)容物和促炎介質(zhì),形成過度的炎性反應(yīng)[39]。在MCAO組中,HE染色顯示細胞死亡、腦組織結(jié)構(gòu)疏松、間質(zhì)水腫、神經(jīng)細胞紊亂和腫脹、固縮和細胞核碎裂的典型特征,神經(jīng)細胞數(shù)量顯著減少。然而,在EA組中,這種現(xiàn)象的發(fā)生減少,僅在缺血病灶的周圍區(qū)域觀察到少量神經(jīng)細胞變性和壞死。在TUNEL熒光染色中,發(fā)現(xiàn)在凋亡和局灶性細胞核中可以形成綠色或棕黃色顆粒沉淀,而正常細胞中沒有斷裂的DNA片段,不會與標記物反應(yīng),因此正常細胞核是藍色的[40]。此外,我們在TUNEL的基礎(chǔ)上添加了caspase-1染色,以鑒定caspase-1介導(dǎo)的神經(jīng)元焦亡。在MCAO組大鼠種觀察到TUNEL和caspase-1雙染色神經(jīng)元的陽性率顯著增加,這表明細胞焦亡與腦缺血/再灌注損傷有關(guān)。EA治療后大鼠的陽性率顯著降低,表明電針可以減少腦缺血/再灌注損傷后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的焦亡,這可能是通過抑制caspase-1的表達實現(xiàn)的。先前的研究還表明,EA可以抑制腦缺血大鼠海馬中的神經(jīng)元凋亡,并可以促進腦缺血/再灌注損傷后神經(jīng)細胞的恢復(fù)[41]。此外,雙標記免疫熒光顯示,MCAO組大鼠神經(jīng)元中NLRP3和caspase-1顯著共表達,這與之前報道結(jié)果[42,43]相似。EA組大鼠共表達神經(jīng)元的數(shù)量減少,這表明EA治療可能抑制神經(jīng)元焦亡。

總之,EA聯(lián)合高頻重復(fù)經(jīng)顱刺激可以顯著改善腦缺血/再灌注損傷小鼠的神經(jīng)損傷癥狀和腦細胞形態(tài)學變化,減少梗死面積,保護腦組織免受缺血損傷。這種治療減少了NLRP3、caspase-1的表達,減少了細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的發(fā)生,表明EA對腦缺血/再灌注損傷的保護作用可能是通過抑制NLRP3/caspase-1途徑發(fā)揮的。