羅斌 李智偉 王倩 王昌敏

鮑曼不動桿菌是臨床感染的重要致病因素之一,具有較高的死亡風險,近年來,在院內(nèi)感染中一直占有很高的比例[1,2]。既往研究報道生物被膜形成和外排泵是鮑曼不動桿菌感染和異?？股乜顾幮缘闹虏C制[3-5]。替加環(huán)素是一種新型靜脈注射用四環(huán)素類抗感染藥物,由惠氏制藥公司從米諾環(huán)素衍生而來。替加環(huán)素是美國食物及藥物管理局首個批準在臨床使用的氨?；股?用于治療復(fù)雜腹腔感染、皮膚感染及社區(qū)感染性肺炎[6,7]。替加環(huán)素對鮑曼不動桿菌有很好的治療作用,但其耐藥性越來越嚴重[8]。本研究重點研究替加環(huán)素耐藥鮑曼不動桿菌的耐藥外排泵基因和菌毛合成基因,分析了耐藥基因AdeB和菌毛合成基因BfmS在生物被膜形成過程中的作用,希望找到抗替加環(huán)素鮑曼不動桿菌生物相關(guān)基因和外排泵基因之間的潛在關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 菌種來源 該項試驗于2018年10月至2019年10月從新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)院臨床檢驗所采集到了72株鮑曼不動球菌的臨床標本,全部采用法國VITEK II Compact鑒定藥敏儀和VITEK MS質(zhì)譜儀設(shè)備進行鑒定,儀器均來自法國梅里埃公司,在標準麥康基瓊脂培養(yǎng)基上生長48 h。檢出菌種: 血21株(29.2%) ,尿13株(18.1%) ,痰38株(52.8%)。選取菌株時剔除同一例患者,同一來源的重復(fù)菌株和其他不動桿菌菌株。

1.2 藥敏實驗 根據(jù)美國食品及藥物管理局推薦標準,臨床實驗室標準研究所(CLSI) ,并按照2019 CLSI S23m100臨床實驗室指南解釋[10],依照標準操作程序,使用法國生物醫(yī)藥公司 vitek2復(fù)方測定替加環(huán)素的敏感性。用肉湯微量稀釋法測定,替加環(huán)素的最低抑菌含量約為2(mg/L)。根據(jù)美國食品和藥物管理局對替加環(huán)素敏感性的推薦標準,替加環(huán)素無敏感性被定義為MIC至少4 mg/L(敏感 MIC, 2 mg/L; 中介 MIC, >2 mg/L and <8 mg/L;耐藥 MIC, 8 mg/L)。

1.3 生物膜與耐藥基因檢測

1.3.1 生物膜形成能力測試:測定后鮑曼保持不動桿菌生物膜的正常水平,并劃線后置于血瓊脂平板上培養(yǎng),在第35℃培養(yǎng)后的18 h內(nèi)。將單菌落懸浮于0.85%(w/V)鹽水緩沖液中,制備1麥肯齊菌懸液。在96孔板的每孔中分別加入200 μl LB培養(yǎng)基和10 μl菌懸液,每株菌平行3孔,設(shè)陰性對照。35℃孵育48 h后,抽吸培養(yǎng)液,0.85%(w/V)生理鹽水緩沖液洗凈,每孔加99%(V/V)甲醇200 μl固定20 min,抽吸甲醇,0.85%(w/V)生理鹽水緩沖液洗二次。孔中加入了1%的(w/V)結(jié)晶紫洗染液200 μl,保持10 min。經(jīng)洗滌后,用蒸餾水洗滌2遍,然后晾干。各孔注入了95%乙醇200 μl,使結(jié)晶紫充分水解,用酶標儀于570 nm上讀出吸光度值(A570)。吸光度值實驗應(yīng)變的正平均值等于負的控制,即菌膜的形成能力是正常的,和菌膜的形成能力的比較結(jié)果是由3個平行井的正平均吸光度值減去負面的平均值控制。

1.3.2 生物膜合成基因檢測:基因組DNA制備取血瓊脂平板上鮑曼不動桿菌菌落,按照制造商說明書(Qiagen,美國),在QIA symphony系統(tǒng)中使用QIA symphony DSP病毒/病原試劑盒分離基因組DNA。純化后的基因組DNA溶液-20℃保存?zhèn)溆?。利用常?guī)PCR方法對8個生物膜合成相關(guān)基因和外排泵基因進行檢測。擴增的擴增時間是:95℃變性2 min,后95℃變性30 s,后56℃再退火30 s,前72℃延長1 min,最后72℃再延長10 min,共35個周期。DNA模板在所有擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)TAE緩沖液1%(w/V)瓊脂糖凝膠電泳分析。本研究所的引物序列與擴增的長度。見表1。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗結(jié)果 本次試驗共采集了經(jīng)臨床分離的鮑曼不動球菌共72株,結(jié)果全部達到多重耐藥的指標,且耐藥度普遍較好,其中又以碳青霉烯的耐藥度最高,而耐藥度最低的則是復(fù)方新諾明。見表2。

2.2 外排泵及耐藥基因檢測 用微量肉湯稀釋法測定替加環(huán)素的藥敏指標。72株菌株中,8個替加環(huán)素的MIC在0.04～17.26 mg/ml。根據(jù)美國食品藥品監(jiān)督管理局腸桿菌科對替加環(huán)素敏感臨界點推薦標準,將鮑曼不動桿菌分為對替加環(huán)素耐藥的鮑曼不動桿菌(TR-AN)組45株(62.5%)和對替加環(huán)素敏感的鮑曼不動桿菌(TS-AN)組27株(37.5%)。分別對blaOXA-23、blaOXA-58、blaOXA-51、AdeABC和AdeRS基因的轉(zhuǎn)錄水平分析表明,AdeB在TR-AN組的表達量比TS-AN組高6.1倍。與TS-AN組相比,TR-AN組AdeA、AdeC、AdeR、AdeS基因表達增加1.5倍、2.1倍、0.8倍、0.7倍。進一步對有或沒有生物膜的TR-AN組進行AdeB基因轉(zhuǎn)錄水平分析,有生物膜形成的TR-AN組為94.6%,無生物膜的TR-AN組為37.5%。見圖1。

注:M maker TR1-TR5 耐藥組試驗菌株

2.3 生物膜基因檢測 在72份痰標本中,abaI,bfmS, bfmR, csuA, csuB和csuE的檢出率均<20%,bap, bfmR和bfs的檢出率分別為34.7%、41.6% 和68.1%。45株TR-AN菌株中在體外形成生物膜37株,TS-AN菌株僅形成4株。通過對膜形成組和非膜形成組bfs基因轉(zhuǎn)錄水平的研究,可以得出結(jié)論: 膜形成組bfs的表達水平比非膜形成組高9.3倍。見圖2,表3。

圖2 生物膜相關(guān)基因電泳與表達量比較

表3 TR-AN 和 TS-AN 生物膜基因組 PCR 檢測結(jié)果 株(%)

2.4 生物膜與耐藥性關(guān)系 臨床分離的72株鮑曼不動桿菌生物被膜形成與替加環(huán)素耐藥性之間的關(guān)系,其中57株在體外形成生物被膜。替加環(huán)素敏感組與替加環(huán)素耐藥組細菌生物膜形成能力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。替加環(huán)素抗性組生物被膜形成能力明顯強于敏感組(P<0.01)。用接受者操作曲線(ROC)評價替加環(huán)素對鮑曼不動桿菌生物膜形成的敏感性。生物膜形成曲線下面積(AUC)為0.92(95% 置信區(qū)間[CI]0.864～0.981),最佳截止水平為1.13,靈敏度和特異度為90.2%和82.1%。見圖3。

圖3 ROC曲線圖

3 討論

不動桿菌根據(jù)其基因組可分為31種,已命名的有17種,其中鮑曼不動桿菌最為突出[10,11]。近年來,已成為醫(yī)院中感染的重要致病菌,同時鮑曼不動桿菌還具有了高度的對環(huán)境適應(yīng)能力,還有著獲得外源性污染和不敏感基因的能力[12,13]。醫(yī)院獲得性感染已成為患者發(fā)病率和死亡率高的主要原因之一,特別是重癥監(jiān)護病房和免疫力低下的患者[14,15]。

鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素耐藥機制的研究主要集中在抗生素失活酶的產(chǎn)生、外排泵高表達、孔蛋白丟失、藥物靶點改變以及生物膜形成等方面[16,17]。本研究中,38種(52.8%)均來源于抽吸物標本,表明了鮑曼不動桿菌在我院的住院患者中可導(dǎo)致塑料吸管傳染和定植有關(guān),或與細菌被人員操作引起的外源性感染傳染有關(guān),或與鮑曼不動桿菌在導(dǎo)管中定植所引起的內(nèi)源性感染有關(guān)。而根據(jù)對醫(yī)院細菌分布考察結(jié)果顯示,醫(yī)院的重癥監(jiān)護病區(qū)是鮑曼不動桿菌傳染的最重要發(fā)病位點。這可能與重癥監(jiān)護病房患者病情危急,免疫功能低下,各種侵入性手術(shù),留置管道廣泛使用有關(guān)?？股匾鸬膬?nèi)源性和外源性感染是相關(guān)的[18,19]。研究證明生物被膜其實是鮑氏不動桿菌的一種重要保護機制,它能夠附著于各種醫(yī)療器械的表層,進而導(dǎo)致感染[20]。生物膜使微生物產(chǎn)生了強烈的免疫逃逸功能,是引起慢性持續(xù)感染和難治性感染的主要因素[21,22]。目前,關(guān)于鮑曼不動桿菌生被膜產(chǎn)生功能和抗性間的聯(lián)系,還存在著一些爭論。不過Rodriguez等[23]指出,由于鮑曼不動桿菌生物膜的產(chǎn)生功能,對環(huán)丙沙星、頭孢類藥物噻肟、氨曲南等的耐藥性明顯增強。Espinal等[24]還證明,生物膜陽性菌株對常見抗生素的耐藥性高于陰性菌株。生物被膜合成相關(guān)基因bfs存在于鮑曼不動桿菌全基因組中,其氨基酸序列含有與生物被膜形成相關(guān)的功能區(qū)[25]。在替加環(huán)素的耐藥組中,由于bfs基因轉(zhuǎn)錄能力的增強,相關(guān)的菌膜形成能力也提高,而在鮑曼比不動桿菌生物膜形成組中外排泵基因?qū)deB的表達能力,也明顯超過了鮑曼相比的不動桿菌生物膜形成組,所以,bap與bfs都與菌膜的形成能力有關(guān)。而bfs基因的陽性組耐藥概率也明顯超過相關(guān)基因的陰性組(P<0.05)。

因此,筆者認為我院分離的鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的耐藥與bfs有顯著相關(guān)性,而替加環(huán)素的耐藥主要是由于外排泵基因adeB和bfs共表達所致。