王飛 曾湘暉

正常的黃體功能是妊娠成功的保證。控制性超促排卵(COH)作為輔助生殖技術(shù)(ART)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),通過(guò)藥物刺激多個(gè)卵泡同時(shí)發(fā)育并成熟,從而獲得多個(gè)卵和較高質(zhì)量胚胎, 增加受孕率。育齡期女性在自然月經(jīng)周期中,黃體功能不全(luteal phase defect,LPD)發(fā)生率為3%～10%,但在COH中,LPD則幾乎為100%[1]。通常因?yàn)樵诼殉才怕押?出現(xiàn)黃體早退的現(xiàn)象,根本無(wú)法分泌夠劑量的孕激素,內(nèi)膜分泌反應(yīng)性因此出現(xiàn)延遲,未達(dá)到與胚胎發(fā)育徹底的同步,影響妊娠結(jié)局。迄今為止,臨床上對(duì)于行黃體支持藥物種類(lèi)、劑量、劑型以及使用方案未達(dá)成統(tǒng)一共識(shí)。常用的黃體支持的藥物主要人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)、P、雌激素(estradiol,E)。黃體酮直接使用或與HCG和E聯(lián)合使用是最常用的方案。使用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(gonadotropin releasing hormone agonist,GnRHa)行黃體支持治療,以期有效改善妊娠結(jié)局,其有效性和安全性正處于不斷探究過(guò)程中。國(guó)外有研究表明,GnRHa有類(lèi)似避孕藥作用,可引發(fā)黃體溶解,不利于胚胎種植[2]。Balasch等[3]發(fā)現(xiàn)黃體中期添加GnRHa,妊娠率不僅沒(méi)有降低,反而胚胎著床率較前升高,猜測(cè)GnRHa可能通過(guò)刺激促黃體生成素(basal luteinizing hormone,LH)的作用,改善妊娠結(jié)局。2015年國(guó)內(nèi)專(zhuān)家共識(shí)中首次提到,GnRHa作為新增黃體支持的藥物備選藥物之一,肯定了其療效,該藥物可通過(guò)增強(qiáng)黃體功能,明顯提升了胚胎植入成功率,從而改善妊娠結(jié)果[4]。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)黃體期添加GnRHa增加出生率、多胎率,有助于妊娠,且拮抗劑方案中效果更優(yōu)[5]。近年來(lái),GnRHa也被用于黃體支持,但因機(jī)制尚不明確,仍存在爭(zhēng)議。因此本課題擬探討在拮抗劑新鮮胚胎移植黃體期,于常規(guī)黃體支持(黃體酮+芬嗎通)基礎(chǔ)上添加不同劑量GnRHa對(duì)ART妊娠結(jié)局的影響,為有效標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2020年1月至2023年2月于我院生殖中心行體外受精(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF)/卵泡漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)拮抗劑方案鮮胚移植314例患者臨床資料。該研究項(xiàng)目已于2021年10月通過(guò)人類(lèi)遺傳資源與醫(yī)學(xué)倫理審查(2021SQCJ4499)與我院醫(yī)學(xué)倫理審查(2021-64),患者簽署了知情同意書(shū)。采用前瞻性對(duì)照臨床試驗(yàn),研究在拮抗劑新鮮胚胎移植黃體期于常規(guī)黃體支持(黃體酮+芬嗎通)基礎(chǔ)上再行添加不同劑量GnRHa,對(duì)ART妊娠結(jié)局的影響,按劑量依次分為A組:未添加GnRHa 95例;B組:添加0.1 mg GnRHa 92例;C組:添加0.3 mg GnRHa 55例;D組:添加0.4 mg GnRHa 72例。4組患者男女年齡、不孕年限、不孕類(lèi)型、BMI、AMH、 AFC、FSH、LH、E2差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4組患者一般情況比較

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡20～40歲;②基礎(chǔ)促卵泡激素(FSH)<10 U/mL;③抗苗勒管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)≥1.2 μg/L;④體重指數(shù)(Body mass index,BMI)正常;⑤移植周期數(shù)≤2,鮮胚移植胚胎為卵裂期胚胎(D3),且至少一個(gè)優(yōu)質(zhì),且移胚總數(shù)≤3個(gè);⑥拮抗劑方案,進(jìn)行控制性超促排卵。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn):①子宮器質(zhì)性疾病(子宮肌瘤、子宮畸形、內(nèi)膜息肉、內(nèi)異癥、宮腔粘連等);②新鮮胚胎移植周期HCG日,患者血清孕酮值≥1.52 ng/ml;移植日B超示子宮內(nèi)膜厚度<7 mm;③輸卵管中重度積水、輸卵管倒流、卵巢過(guò)度刺激綜合征(OHSS);④內(nèi)分泌及代謝性疾病(如多囊卵巢刺激癥(PCOS)、甲亢、甲減、高泌乳素血癥等);⑤IVF/ICSI-ET禁忌證;⑥未簽署知情同意書(shū)的患者。

1.3 COH方案 使用拮抗劑方案,月經(jīng)第2～3天測(cè)血FSH、LH、E2、P,依據(jù)性激素水平、竇卵泡數(shù)(basal antral follicle count,AFC)及大小決定是否開(kāi)始啟動(dòng)FSH,根據(jù)患者的卵巢功能(AFC和AMH)、年齡、BMI決定啟動(dòng)劑量。當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)到12～14 mm時(shí),根據(jù)LH值,決定是否使用GnRH-ant(思則凱,默克雪蘭諾,法國(guó))0.25 mg/d,規(guī)律監(jiān)測(cè)B超和血清E2、LH、P的激素水平變化情況。當(dāng)雙側(cè)卵泡直徑>17 mm的數(shù)量>3 h,再根據(jù)患者血清中各性激素水平,選擇艾澤250 μg板機(jī)或雙扳機(jī):注射用人絨毛促性腺激素(HCG,安徽豐原藥業(yè))2 000 U+注射用醋酸曲普瑞林(達(dá)必佳,德國(guó)輝凌)0.2 mg。扳機(jī)后36 h B超檢查開(kāi)始取卵,并在取卵的當(dāng)天啟動(dòng)黃體支持。取卵日取精,行IVF或ICSI常規(guī)體外受精,移植第3天卵裂期胚胎數(shù)目≥1個(gè),至少有一個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎,對(duì)符合條件的剩余卵裂胚進(jìn)行囊胚培養(yǎng),并行囊胚冷凍保存。

1.4 鮮胚常規(guī)黃體支持方案 自取卵日開(kāi)始,通過(guò)肌內(nèi)注射提供黃體酮40 mg*1次,此后黃體酮60 mg(黃體酮軟膠囊600 mg/d,陰道放置,移植日給予芬嗎通(黃片2 mg/d,Abbott Biologicals B.V.),直至移植后14 d,妊娠者維持至移植后8～10周。

1.5 添加GnRHa的黃體支持方案 A組:常規(guī)黃體支持;B組:添加0.1 mg GnRHa,在常規(guī)黃體(地屈孕酮+芬嗎通)支持基礎(chǔ)上,取卵后第6天(移植后3 d)皮下注射0.1 mg GnRHa(醋酸曲普瑞林,0.1 mg/支,達(dá)必佳,德國(guó)輝凌);C組:添加0.3 mg GnRHa:(在常規(guī)黃體支持基礎(chǔ)上,分別于取卵第2、5、8天單次皮下注射0.1 mg GnRHa);D組:添加0.4 mg GnRHa,(在常規(guī)黃體支持基礎(chǔ)上,分別于取卵第2、4天單次皮下注射0.2 mg GnRHa)。移植后14 d測(cè)定血β-HCG,妊娠者維持至移植后8～10周。

1.6 胚胎移植 鮮胚取卵后72 h進(jìn)行移植,移植胚胎為卵裂期胚胎(D3),至少一個(gè)優(yōu)質(zhì),移胚總數(shù)≤3個(gè)。

1.7 觀察指標(biāo)及隨訪 主要指標(biāo):種植率、臨床妊娠率、多胎率、早期流產(chǎn)率;次要指標(biāo):男女雙方年齡、不孕年限、不孕類(lèi)型、BMI、AMH、AFC、bFSH、bLH、bE2、HCG日LH、E2、P水平及內(nèi)膜厚度、獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、總受精數(shù)、卵裂數(shù)、2PN數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率、優(yōu)質(zhì)D3胚胎數(shù)、可利用D3胚胎數(shù)、囊胚形成數(shù)、優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)、移植日內(nèi)膜厚度、平均移植胚胎數(shù)等。隨訪:于移植后14 d對(duì)血液中的β-HCG進(jìn)行檢測(cè),35 d B超可見(jiàn)孕囊和胎心跳動(dòng)提示為臨床妊娠。

2 結(jié)果

2.1 4組促排卵情況 4組為IVF受精方式,HCG日LH、E2、P水平比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 4組實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)及胚胎發(fā)育情況比較 4組患者在獲卵數(shù)、MⅡ數(shù)、總受精數(shù)、卵裂數(shù)、2PN數(shù)、優(yōu)質(zhì)D3胚胎數(shù)、可利用D3胚胎數(shù)、囊胚形成數(shù)、優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 4組患者實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)及胚胎發(fā)育情況比較

2.3 4組患者妊娠結(jié)局情況比較 4組患者在胚胎種植率、早期流產(chǎn)率、多胎率等方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),A組妊娠率低于B、C、D組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

2.4 與臨床妊娠結(jié)局有關(guān)的單因素分析 根據(jù)患者是否發(fā)生臨床妊娠,分為臨床妊娠組與非臨床妊娠組。2組在男女雙方年齡、不孕年限、不孕類(lèi)型、 BMI、AMH、AFC、bFSH、bLH、bE2、HCG日LH、E2、P水平及內(nèi)膜厚度水平方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2組在獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、總受精數(shù)、卵裂 數(shù)、2PN數(shù)、優(yōu)質(zhì)D3胚胎數(shù)、可利用D3胚胎數(shù)、囊胚形成數(shù)、優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)、移植日內(nèi)膜厚度等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。臨床妊娠組的平均移植胚胎數(shù)、GnRHa黃體支持占比均高于非臨床妊娠組(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 臨床妊娠結(jié)局相關(guān)指標(biāo)單因素分析

2.5 與臨床妊娠結(jié)局有關(guān)因素的Logistic回歸分析 將P值≤0.05的變量納入回歸分析模型。Logistic回歸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn):平均移植胚胎數(shù)對(duì)臨床妊娠結(jié)局影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);GnRHa黃體支持占比對(duì)臨床妊娠結(jié)局影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。排除混雜因素后發(fā)現(xiàn)添加GnRHa、移植胚胎數(shù)均是影響拮抗劑方案鮮胚移植患者臨床妊娠結(jié)局的關(guān)鍵因素。見(jiàn)表6。

表6 臨床妊娠結(jié)局相關(guān)指標(biāo)Logistic回歸分析

3 討論

3.1 GnRHa的結(jié)構(gòu)及發(fā)揮黃體功能的機(jī)制 GnRHa是GnRH第6、10位的氨基酸替換形成的新型結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定且半衰期更長(zhǎng)的十肽化合物,同時(shí)其與GnRH受體親和力增加100～200倍。GnRH通過(guò)垂體門(mén)脈系統(tǒng),作用于垂體前葉產(chǎn)生FSH和LH,而GnRHa通過(guò)持續(xù)性分泌,消耗了大量的GnRH受體,導(dǎo)致垂體脫敏,抑制了LH的產(chǎn)生,對(duì)黃體功能造成影響,同時(shí)也影響了子宮內(nèi)膜的容受性。

GnRHa對(duì)于黃體支持的有效性和安全性的作用原理尚不清楚,可能與其多種不同作用機(jī)制有關(guān)。在現(xiàn)階段認(rèn)為GnRHa用于黃體支持的可能機(jī)制為以下幾個(gè)方面:(1)GnRHa刺激垂,E、P分泌增多,接近于自然周期,更有利于妊娠的發(fā)生和維持。另外,GnRHa可能通過(guò)對(duì)黃體施加直接作用來(lái)產(chǎn)生雌孕激素。(2)研究發(fā)現(xiàn)人類(lèi)胚胎、胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞及子宮內(nèi)膜都有GnRHa受體mRNA,黃體期給藥GnRHa能加速已種植的胚胎產(chǎn)生HCG,有益于早期胎兒發(fā)育[6]。(3)釋放LH可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞血管生長(zhǎng)因子,以及與胚胎種植有關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá),從而有利于胚胎的著床和發(fā)育[7]。(4)GnRHa可明顯減低NK細(xì)胞的毒性,提高免疫功能,具有更有利于胚胎移植環(huán)境[8]。

3.2 添加GnRHa黃體支持在拮抗劑方案鮮胚移植周期中的作用 本研究中使用拮抗劑方案行鮮胚移植患者,在常規(guī)黃體支持方案中添加不同劑量(0.1 mg、0.3 mg、0.4 mg)GnRHa組的臨床妊娠率(61.96%,63.63%,62.50%)均明顯高于未添加GnRHa組(44.21%)。而添加不同劑量(0.1 mg、0.3 mg、0.4 mg)GnRHa種植率(39.77%,40.00%,36.59%)、早期流產(chǎn)率(14.04%,11.76%,11.11%),相較于未添加GnRHa組種植率(33.89%)、早期流產(chǎn)率(14.29%),雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但種植率均有一定程度升高,早期流產(chǎn)率有下降的趨勢(shì)。

本研究結(jié)果提示,在拮抗劑方案鮮胚移植周期中,常規(guī)黃體支持(地屈孕酮+芬嗎通)的基礎(chǔ)上,加用GnRHa能明顯提高臨床妊娠率,改善妊娠結(jié)局,但添加3種不同劑量GnRHa的患者妊娠結(jié)局也略有差別。綜合本研究對(duì)使用不同劑量GnRHa的妊娠結(jié)局考慮,分別于取卵第2 d、5 d、8天單次皮下注射0.1 mg GnRHa,總劑量達(dá)0.3 mg時(shí),種植率和臨床妊娠率在3組中效果最佳,這與曲丹妮等[9]研究結(jié)果相似,持續(xù)間斷給予GnRHa可改善ART妊娠結(jié)局。其可能原因?yàn)镚nRHa雖抑制內(nèi)源性的LH峰,但半衰期短,作用時(shí)間不長(zhǎng),僅可持續(xù)24～36 h,且取卵后6 d為體內(nèi)黃體的最低期,加用GnRHa可再次刺激垂體LH的分泌,及時(shí)挽救了內(nèi)源性黃體,安全并有效地發(fā)揮了黃體支持的作 用,對(duì)妊娠結(jié)局起到了積極的作用。

Oliveira等[10]發(fā)現(xiàn)拮抗劑方案加用GnRHa后,臨床結(jié)局的各項(xiàng)指標(biāo)(種植率和臨床妊娠率)均有大幅度的升高。國(guó)內(nèi)近期也有研究顯示,行IVF/ICSI患者,加用1次0.1 mg GnRHa(曲普瑞林)也顯著改善了妊娠結(jié)局[11],且有大樣本數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,在低反應(yīng)人群(FSH<8 mU/mL)中添加0.1 mg GnRHa,也達(dá)到了相同的效果[12]。一項(xiàng)納入行拮抗劑方案鮮胚移植的328周期ICSI患者的研究提示,于相同時(shí)機(jī)添加相同劑量GnRHa,提示添加GnRHa并未提高胚胎種植率、臨床妊娠率[13],與本研究結(jié)論不一致。分析其可能原因:雖抑制效應(yīng)能快速消去,但黃體中期僅僅只是注射0.1 mg GnRHa刺激黃體,劑量太小,產(chǎn)生的孕酮未達(dá)到能發(fā)揮黃體支持的生理劑量的閾值,發(fā)揮效果顯微。有國(guó)外Meta分析顯示多劑量的GnRHa使用的活產(chǎn)率較單劑量高[14]。因此國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究多劑量的GnRHa黃體支持對(duì)妊娠結(jié)局的影響。

Qublan等[15]研究顯示移植著床率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率也顯著升高。Aboulghar 等[16]發(fā)現(xiàn)不會(huì)提升繼續(xù)妊娠和臨床妊娠的機(jī)率,妊娠結(jié)局無(wú)影響。國(guó)外有RCT顯示選擇ICSI患者,分別移植日后3 d皮下注射1次1 mg GnRHa(亮丙瑞林100例),與移植日后第3、6天各注射1次(100例)比較,發(fā)現(xiàn)添加1次與2次妊娠結(jié)局無(wú)差異,且與未添加組相較,多胎率明顯升高[17]。因此可推測(cè)認(rèn)為單次與多次添加GnRHa無(wú)差異,反而增加多胎率。各項(xiàng)研究的得出結(jié)論不一,但其研究報(bào)道少,周期數(shù)少,缺乏強(qiáng)有力臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)反復(fù)驗(yàn)證,因而對(duì)GnRHa用于黃體支持用法劑量存在爭(zhēng)議。

3.3 拮抗劑鮮胚移植周期中添加GnRHa的安全性 GnRHa的黃體支持作用可能有利于妊娠發(fā)生,但胚胎移植以后使GnRHa是否對(duì)母兒有不良影響,增加胎兒畸形的發(fā)生。理論上GnRHa半衰期較短,當(dāng)皮下注射0.1 mg GnRHa后,其生物有效性大約持續(xù)24 h,可及時(shí)排泄。用藥后發(fā)生妊娠,此時(shí)的胚胎則不受GnRHa影響。

近年國(guó)外有研究指出,拮抗劑方案中添加GnRHa增加多胎妊娠的發(fā)生率[18]。國(guó)內(nèi)余璐萍等[5]亦得到了相同的結(jié)果,添加GnRHa組的多胎率高于未添加組。李潔等[19]研究顯示,在移植后0、2 d分別添加GnRHa各0.1 mg,結(jié)果提示2組的自然流產(chǎn)率無(wú)差異,且出生的嬰兒中無(wú)畸形兒,表明GnRHa應(yīng)用于拮抗劑方案的黃體期是相對(duì)安全的。國(guó)內(nèi)前瞻性研究在黃體支持基礎(chǔ)上持續(xù)間斷皮下注射GnRHa,發(fā)現(xiàn)添加多劑量GnRHa長(zhǎng)期隨訪安全性良好[9]。

國(guó)外前瞻性對(duì)照研究中顯示,于贈(zèng)卵周期ICSI后的第6天注射單劑量的0.1 mg GnRHa,并未增加流產(chǎn)率[8],這與本研究的結(jié)論相一致。另有研究納入120例子宮內(nèi)膜厚度不超過(guò)7 mm的患者,在GnRHa添加組中,內(nèi)膜增厚的速度比常規(guī)黃體支持組更快,同樣胚胎種植率和臨床妊娠率亦有明顯提升[15]。在卵巢低反應(yīng)(FSH<8 mU/mL)患者中也得出相同的結(jié)論[12]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn),對(duì)第1次IVF失敗者,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)黃體支持方案取卵開(kāi)始,連續(xù)14 d每日持續(xù)0.1 mg GnRHa注射,比OPU后6 d注射1次GnRHa更有效,多劑量組能取得較好的妊娠結(jié)局,可顯著提高妊娠率和活產(chǎn)率,提高妊娠率及活產(chǎn)率,且安全持久[20]。

既往研究發(fā)現(xiàn),黃體期給藥GnRHa提示還未見(jiàn)能直接引起神經(jīng)系統(tǒng),消化系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)的損傷,進(jìn)而導(dǎo)致胎兒畸形的發(fā)生,但并不排除不影響早期胚胎發(fā)育的可能性[8, 21]。國(guó)外研究表示,黃體期加入GnRHa,具有重要臨床價(jià)值[22],今后需進(jìn)一步跟蹤調(diào)查其圍產(chǎn)期結(jié)局、胎兒神經(jīng)系統(tǒng)、先天畸形等問(wèn)題安全性。

目前大多數(shù)研究顯示鮮胚移植黃體中期添加GnRHa有利于臨床妊娠結(jié)局,且合適并安全的多劑量間斷給藥在胚胎著床率及臨床妊娠率方面效果較優(yōu),但添加時(shí)機(jī)及劑量尚無(wú)明確規(guī)定,且GnRHa用量超出安全范圍會(huì)導(dǎo)致垂體功能受到抑制,GnRHa黃體支持作用不僅無(wú)法發(fā)揮,反而帶來(lái)弊端[23-25]。目前國(guó)內(nèi)進(jìn)行的相關(guān)研究方法,多為取卵后第6天添加0.1 mg GnRHa。臨床上多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)用藥,此時(shí)醫(yī)生更應(yīng)熟練掌握藥物適應(yīng)證及禁忌證,給ART助孕患者獲得良好結(jié)局打下基礎(chǔ)。

綜上所述,在黃體期加入GnRHa的拮抗劑方案中,可以改善此方案新鮮移植周期的妊娠結(jié)果。采用GnRHa扳機(jī)聯(lián)合黃體期應(yīng)用,以增強(qiáng)黃體支持作用,降低OHSS的發(fā)生機(jī)率也是可行的。內(nèi)膜較薄、反復(fù)IVF/ICSI-ET失敗的患者,贈(zèng)卵周期等均可將于黃體期添加GnRHa作為黃體支持新型選擇?？紤]到拮抗劑鮮胚添加GnRHa可能增加多胎率的風(fēng)險(xiǎn)及添加多劑量的效果更優(yōu),因此可相對(duì)減少移植胚胎的數(shù)量,增加GnRHa的劑量,從而降低多胎率,改善妊娠結(jié)局。