常 宏,高振安,張美沙,宿瑋潔,王 萌,劉思宇,肖銀軍,唐徐浩,王 勇

(1.華北理工大學中醫(yī)學院,河北唐山 063210;2.河北省中西醫(yī)結(jié)合防治糖尿病及其并發(fā)癥重點實驗室,河北唐山 063210;3.北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院,北京 100029)

心力衰竭(heart failure,HF)是多種心臟疾病發(fā)展的終末階段,全球HF患者接近2 600萬,給醫(yī)療和經(jīng)濟造成沉重負擔[1]。HF患者除了心臟受損,還有運動耐力降低,究其原因,不僅因為心功能低下,還跟骨骼肌萎縮密切相關(guān)[2]。骨骼肌萎縮在HF患者的早期階段就已經(jīng)出現(xiàn)[3],嚴重影響HF患者的生命質(zhì)量和預(yù)后[4-5]。因此,在HF的治療上,防治骨骼肌萎縮與改善心功能同等重要。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin aldosterone system, RAS)不僅能調(diào)控血壓,還參與到多種疾病如充血性HF、慢性腎臟疾病、腫瘤等誘導的骨骼肌萎縮的病理發(fā)展中[6]。該系統(tǒng)作用的發(fā)揮主要包括兩個途徑:一是經(jīng)典RAS途徑,此途徑主要靠血管緊張素(angiotensin,Ang )Ⅱ發(fā)揮作用,Ang Ⅱ能促進肌蛋白降解,導致骨骼肌萎縮[6];一是非經(jīng)典RAS途徑,該途徑作用的發(fā)揮主要靠ACE2-Ang(1-7)-Mas軸。在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)2的催化下,AngⅡ能轉(zhuǎn)化為Ang(1-7),Ang (1-7)與其Mas受體(mas receptor,Mas R)結(jié)合,具備與Ang Ⅱ相反的效果,即抑制骨骼肌的萎縮[7]。

芪參顆粒是臨床治療HF的有效驗方,研究發(fā)現(xiàn)該方能通過調(diào)控RAS發(fā)揮防治HF的作用[8],動物實驗中還發(fā)現(xiàn)該方能改善HF大鼠游泳力竭時間(代表疲勞癥狀)和呼吸頻率(代表氣短癥狀)[9],這些發(fā)現(xiàn)提示該方可能對骨骼肌萎縮起到抑制作用。本研究通過建立HF合并骨骼肌萎縮模型,從ACE2-Ang(1-7)-Mas軸探討芪參顆粒對HF合并骨骼肌萎縮的防治作用及相關(guān)機制。

1 材料

1.1 動物

正常雄性SD大鼠28只[體重(200±10)g,SPF級]購自北京華阜康有限公司,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2020-0004。大鼠飼養(yǎng)于華北理工大學動物實驗中心動物房,飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級,溫度(20～24 ℃),相對濕度(40%～60%),光照和黑暗12 h交換進行,普通飲食、飲水。

1.2 主要試劑和藥品

大鼠N端腦利鈉肽前體(n-terminal brain natriuretic peptide precursor, NT-pro BNP)ELISA檢測試劑盒、Ang (1-7) ELISA檢測試劑盒、Ang Ⅱ ELISA檢測試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司,貨號分別為CSB-E08752r、CSB-E14241r、CSB-E00494r;ACE2抗體、GAPDH抗體、MyHc 抗體均購自華安生物科技有限公司,貨號分別為ET 1611-58、ET1601-4、ET1702-88;MasR抗體購自以色列Alomone Labs公司,貨號AAR013AN1125;羊抗兔二抗購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司,貨號C1309;芪參顆粒凍干粉(黃芪、丹參、附子、玄參、金銀花、甘草購自北京同仁堂股份有限公司,由北京中醫(yī)藥大學中藥學院水提醇沉制備而成[10]);福辛普利鈉片購自中美上海施貴寶制藥有限公司,國藥準字H19980197,規(guī)格10 mg/片。

1.3 主要儀器與設(shè)備

M200PRO型多功能酶標儀,瑞士TECAN集團公司;L-800R型臺式低速大容量冷凍離心機,蘇州江東精密儀器有限公司;BIO-RADLS-C50型蛋白凝膠成像系統(tǒng),美國Bio-Rad公司;AUTOSTAINER XL型組織自動染色機、TP1020型組織脫水機、RM2245型切片機,上海徠卡生物系統(tǒng)有限公司;JK-TBP-3A型生物組織攤片機,上海精學科學儀器有限公司;DB-B2型烤片機,常州國華電器有限公司;A3型動物心電圖機,珠海宏邦醫(yī)療科技有限公司;BX53型顯微鏡,日本Olympus公司。

2 方法

2.1 模型制備

根據(jù)已有實驗技術(shù)基礎(chǔ)[10-11],通過結(jié)扎大鼠左側(cè)冠狀動脈前降支,復制心梗后心衰模型。3 d后,通過心電圖檢測病理性Q波情況,若大鼠心電圖12個導聯(lián)中有6～8個導聯(lián)出現(xiàn)病理性Q波,即被選擇為造模成功[12]。

圖1 大鼠心臟HE染色(×200)

2.2 分組和藥物干預(yù)

根據(jù)心電圖病理性Q波的多少和所在導聯(lián)將造模成功后的大鼠隨機分為模型組、芪參顆粒組和福辛普利組,每組7只。同時以假手術(shù)組作為對照。各組處理方法如下:假手術(shù)組(0.9%氯化鈉溶液灌胃,1 mL/100 g/d),模型組處理同假手術(shù)組,芪參顆粒組(凍干粉水溶液灌胃,2.352 mg/kg/d),福辛普利組(藥物水溶液灌胃,4 mg/kg/d),干預(yù)時間為12周。

2.3 標本采集及指標檢測

2.3.1 左心室射血分數(shù) 腹腔麻醉大鼠,胸部備皮,進行超聲心動圖檢測,每組選擇5只大鼠,檢測其左心室射血分數(shù)(ejection fraction, EF)。

2.3.2 大鼠拉力值和腓腸肌濕重 將大鼠放在拉力測量儀的抓力板上,待其抓穩(wěn)后,操作者抓住鼠尾向后牽拉直至大鼠松爪,讀數(shù)并記錄拉力值。取材時,剝離出大鼠左后肢一半腓腸肌,稱重并記錄。

2.3.3 取材 1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠,從腹主動脈獲得血液,經(jīng)過低溫和常溫離心后分別獲得血清和血漿。留取左后肢半片腓腸肌和心臟梗死邊緣區(qū)組織,分別放入液氮和4%多聚甲醛保存。

2.3.4 ELISA法檢測NT-pro BNP、Ang Ⅱ和Ang(1-7)濃度 按照說明書上的操作步驟,根據(jù)各樣品吸光度OD值和標準曲線,計算各組大鼠NT-pro BNP、Ang Ⅱ和Ang(1-7)的含量。

2.3.5 心肌和腓腸肌病理學觀察 取出已固定的心肌和腓腸肌組織,流水沖洗過夜,常規(guī)石蠟包埋,心臟組織5 μm切片,腓腸肌組織4 μm切片。用于蘇木素伊紅(htoxylin eosin, HE)染色的切片,經(jīng)二甲苯、不同梯度的乙醇脫蠟、水洗,而后進行蘇木素、伊紅染色、脫水、透明等,最后采用中性樹膠封片。應(yīng)用顯微鏡采集病理圖片,采用Image J軟件分析圖像。

2.3.6 Western blot檢測大鼠腓腸肌中蛋白ACE2、MasR和MyHc的表達 取50 mg腓腸肌組織用600 μL組織裂解液裂解,離心獲取上清,采用二喹啉甲酸(bicinchonininc acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒測定樣品蛋白總濃度。經(jīng)過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,封閉1 h,含吐溫的Tris-HCl緩沖鹽溶液(Tris buffered saline with Tween, TBST)洗膜,孵育一抗ACE2(1:1 000)、MasR(1:200)、MyHc(1:1 000)和GAPDH(1:1 000),放入4 ℃冰箱,孵育過夜。次日經(jīng)過二抗(1:5 000)孵育1 h,加入發(fā)光液,在BIO-RAD凝膠成像儀中曝光條帶,并分析灰度值。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠心臟EF與血清中NT-pro BNP、Ang Ⅱ和Ang(1-7)濃度變化比較

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心臟EF值降低(P<0.01),血清中NT-pro BNP濃度顯著升高(P<0.01),血漿中Ang Ⅱ的含量升高(P<0.01),而Ang(1-7)的含量顯著下降(P<0.01)。應(yīng)用藥物干預(yù)后,大鼠心臟EF值和Ang(1-7)的含量得到升高(P<0.01),NT-pro BNP和Ang Ⅱ的濃度明顯降低(P<0.01),見表1。

表1 各組大鼠心臟EF與血中NT-pro BNP、Ang Ⅱ和Ang(1-7)濃度變化比較

3.2 大鼠心臟HE染色變化

HE染色顯示假手術(shù)組大鼠的心肌組織排列規(guī)則、組織致密;模型組大鼠的心肌組織排列不規(guī)則,部分組織出現(xiàn)肌絲斷裂,甚至炎細胞浸潤;芪參顆粒和福辛普利干預(yù)后,大鼠的心肌組織得到改善,心肌細胞排列相對規(guī)則,見圖1。

3.3 大鼠的抓力值和腓腸肌濕重變化

與假手術(shù)組比較,模型組中大鼠的抓力值和腓腸肌重量都呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(P<0.01),芪參顆粒和福辛普利干預(yù)后,兩個指標都有所改善(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠抓力值和腓腸肌重量變化比較

3.4 大鼠腓腸肌HE染色變化和肌纖維橫截面積情況

假手術(shù)組大鼠的腓腸肌HE染色表現(xiàn)為肌纖維的間隔小,肌絲致密,模型組大鼠的腓腸肌肌纖維間距增寬,肌纖維的橫截面積顯著縮小(P<0.01)。應(yīng)用藥物干預(yù)后,腓腸肌的肌纖維間隔變小,肌纖維橫截面積增大(P<0.01),見圖2、表3。

圖2 大鼠心臟HE染色(HE,×200)

表3 大鼠的腓腸肌肌纖維橫截面積變化

3.5 大鼠腓腸肌相關(guān)蛋白的表達情況

與假手術(shù)組比較,模型組腓腸肌組織中ACE2、MasR和MyHc蛋白表達降低(P<0.05);與模型組比較,用藥干預(yù)后,芪參顆粒組和福辛普利組大鼠腓腸肌組織中ACE2、MasR和MyHc蛋白表達升高(P<0.05),見圖3、表4。

注:血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2),Mas受體(MasR),肌球蛋白重鏈(MyHc)J.假手術(shù)組;M.模型組;Q.芪參顆粒組;F.福辛普利組

表4 大鼠腓腸肌組織中ACE2、MasR和MyHc蛋白表達情況

4 討論

《中國心血管健康與疾病報告2020》概述顯示,2012年到2015年間,全國132家醫(yī)院13 687名HF患者中,住院患者的病死率為4.1%[13]。隨著運動療法在多種疾病的防治中發(fā)揮重要作用,研究者越來越重視骨骼肌在HF病變進展中的作用[14]。HF時,患者骨骼肌的質(zhì)量及力量均明顯下降[15],究其原因,主要在于骨骼肌肌纖維的改變,具體表現(xiàn)為肌纖維橫截面積變小,具備抗疲勞能力的I型肌纖維數(shù)量減少,而相對易出現(xiàn)疲勞的Ⅱ型肌纖維數(shù)量增加[16]。HF患者心功能會隨著骨骼肌質(zhì)量的下降而惡化,造成其生活質(zhì)量低下[5]。研究發(fā)現(xiàn),在射血分數(shù)降低的HF患者中,伴有四肢骨骼肌含量降低的患者在1年內(nèi)的全因死亡率顯著增加[17]。迄今為止,由于對HF合并骨骼肌萎縮的發(fā)病機制尚未完全明確,也沒有專門針對骨骼肌萎縮或恢復其健康的治療方法[18]。目前,大多數(shù)學者主要從營養(yǎng)[19]、藥物[20]和運動醫(yī)學[21]三個領(lǐng)域研究HF合并骨骼肌萎縮,其中運動干預(yù)被認為是目前治療HF合并骨骼肌萎縮有效且臨床證據(jù)相對充分的方法[2]。流行病學證據(jù)顯示,運動訓練雖然可以降低心血管疾病的風險,但是HF患者運動能力和運動耐力也受到了限制,患者如果對運動訓練的強度和時間掌控欠佳,通過運動訓練改善骨骼肌功能就會存在一定問題。由此可見,探尋既能防治HF,又能改善骨骼肌萎縮的藥物顯得尤其重要。

本實驗中結(jié)扎大鼠左冠脈前降支,建立心梗后心衰模型,12周后發(fā)現(xiàn)模型組大鼠心臟EF值顯著降低,而血清中NT-pro BNP濃度升高,心肌組織排列不規(guī)則;同時大鼠拉力值降低,腓腸肌重量減輕,肌纖維的截面積減小,MyHc表達下降,以上數(shù)據(jù)提示大鼠不僅出現(xiàn)HF,還存在骨骼肌萎縮。芪參顆粒和福辛普利能明顯改善大鼠心臟的結(jié)構(gòu)和功能,同時抑制骨骼肌的萎縮。

研究提示RAS不僅能調(diào)控心肌成纖維外基質(zhì)代謝[22],還能調(diào)控骨骼肌的病變過程[6]。研究者發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ能激活泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome system,UPS),造成關(guān)鍵酶肌肉環(huán)指蛋白(muscle rring-finger protein,MuRF)-1和F-box蛋白(muscle atrophy f-box,MAFbx)的表達升高,最終導致肌蛋白降解增加和骨骼肌萎縮[23]。與AngⅡ作用相反的Ang(1-7),與MasR結(jié)合后發(fā)揮保護骨骼肌的作用,表現(xiàn)為抑制肌強度、纖維直徑和肌球蛋白重鏈水平的下降,抑制肌蛋白的降解和骨骼肌萎縮[24-25]。本實驗中,模型組大鼠血漿中Ang Ⅱ升高,Ang(1-7)降低,腓腸肌組織中ACE2、Mas R和MyHc蛋白表達降低。應(yīng)用芪參顆粒和福辛普利后,大鼠血漿中Ang Ⅱ濃度降低,Ang(1-7)含量和ACE2、MasR和MyHc蛋白表達都升高,表明藥物能調(diào)控RAS平衡來防治HF合并骨骼肌萎縮。

HF的證候類型復雜,氣虛、血瘀是其最常見的證候要素,在此基礎(chǔ)上形成了益氣活血的治則。心氣虧虛導致推動無力,表現(xiàn)為血瘀之證;血脈瘀滯,久而化毒犯心,損傷心之陽氣,從而加重HF。因此,益氣活血治療HF的同時,當須輔以解毒,尤其是清熱解毒,更能契合病機?；诖?課題組在益氣活血的治則上加入解毒理念,提出了治療HF的有效復方——芪參顆粒。前期研究發(fā)現(xiàn)該方能改善HF大鼠疲勞癥狀[9],其他研究發(fā)現(xiàn),方中黃芪可以延緩多種疾病導致的骨骼肌萎縮[26-28],這些藥物有效作用的研究為我們進一步探討芪參顆粒防治HF合并骨骼肌萎縮提供了實驗依據(jù)。

本實驗發(fā)現(xiàn),芪參顆粒能調(diào)控經(jīng)典與非經(jīng)典RAS途徑的平衡,從而發(fā)揮對心功能和骨骼肌的雙重改善作用。然而該方中到底是什么藥物成分發(fā)揮效應(yīng)尚未明確,今后研究中將進一步結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學和轉(zhuǎn)錄組學,挖掘起效成分和對應(yīng)靶標。