申福國(guó) 孔維麗 孫文才 郭 浩 姜 鑫 修 姜 肖文龍 于政恩 金 松

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院骨外科，黑龍江 齊齊哈爾， 161000；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院呼吸內(nèi)科，黑龍江 齊齊哈爾， 161000）

隨著社會(huì)的發(fā)展，創(chuàng)傷、慢性炎性反應(yīng)、老齡化等導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨損傷發(fā)病率越來越高[1-2]。軟骨組織為特殊的結(jié)締組織，其分化性較強(qiáng)且缺乏血管、神經(jīng)及淋巴結(jié)構(gòu)[3]。軟骨組織損傷后自我修復(fù)能力有一定局限性，如不能進(jìn)行很好修復(fù)，將來可能發(fā)展成骨性關(guān)節(jié)炎。因此，采用有效的方法治療早期關(guān)節(jié)軟骨損傷，阻止或減緩軟骨損傷的發(fā)展，對(duì)降低骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率起到十分重要的作用。

目前，臨床中治療膝關(guān)節(jié)軟骨損傷主要為自體軟骨移植手術(shù)、關(guān)節(jié)鏡下微骨折手術(shù)、同種異體軟骨移植手術(shù)、生物支架移植手術(shù)等治療方法，但是臨床中各種治療方法均存在一定局限性，其臨床治療效果并不可觀[4-6]。臨床患者軟骨損傷后很難修復(fù)到正常軟骨組織，臨床通過各種方法只能促進(jìn)軟骨修復(fù)及軟骨搬運(yùn)移植，這也一直為骨科醫(yī)生面對(duì)的難題。隨著組織工程學(xué)發(fā)展，軟骨再生及支架材料的興起，給軟骨損傷患者帶來了福音[7]。組織工程學(xué)領(lǐng)域涵蓋了生命科學(xué)和材料工程學(xué)等相關(guān)學(xué)科，希望通過組織再生從根本上解決組織或器官損傷、缺失所引起的相關(guān)臨床疾病，在現(xiàn)今疾病治療中占有重要地位。種子細(xì)胞、生物材料和生物活性因子，是組織工程的三個(gè)重要部分[8]。

人骨組織是一種含有有機(jī)成分和無機(jī)成分的復(fù)雜結(jié)締組織，其中無機(jī)成分主要是羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA），人骨中磷灰石的含量在60%～70%，而磷灰石作為人體的主要骨礦物質(zhì)，具有良好的生物學(xué)性能，而被大量地應(yīng)用在骨修復(fù)材料領(lǐng)域。目前在骨修復(fù)研究領(lǐng)域已經(jīng)研究出各種羥基磷灰石復(fù)合材料，其中較為成熟的是納米級(jí)羥基磷灰石，因其空間立體結(jié)構(gòu)為晶體結(jié)構(gòu)、尺寸，與人體骨組織非常接近，且羥基磷灰石能夠很好地與正常骨組織相結(jié)合，形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。羥基磷灰石具有良好的生物相容性與成骨活性，在生物體內(nèi)可提供早期的骨強(qiáng)度和骨長(zhǎng)入基石。

目前國(guó)內(nèi)外羥基磷灰石已經(jīng)在臨床骨缺損中得到很好運(yùn)用。人骨中還存在微量的稀土元素，其中就包括含量較少的釓元素（Gadolinium，Gd），微量稀土元素化合物對(duì)細(xì)胞增殖及分化有“Hormesis”效應(yīng)[9]。有研究表明稀土元素微量釋放對(duì)細(xì)胞有“高抑低促”的作用，也就是高濃度的稀土元素能抑制細(xì)胞增殖，低濃度的稀土元素能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖，同樣作為鑭系中排名第8 的釓元素也具備對(duì)細(xì)胞“高抑低促”的作用[10-11]。本研究利用羥基磷灰石為基石和微量稀土化合物釓促進(jìn)細(xì)胞增殖特性，設(shè)計(jì)出一種新型復(fù)合支架材料，有望為臨床軟骨缺損提供新的支架材料。

1 材料與方法

1.1 材料

主要試劑見表1，主要儀器見表2。

表1 主要試劑

表2 主要儀器

1.2 主要方法

目前對(duì)于羥基磷灰石粉體的合成方法主要分為兩大類別，即液相合成法和高溫固相合成法，然而對(duì)于納米粉體的合成均為水液合成方法來完成。目前，化學(xué)材料方面液相合成法中主要有：水解法、水熱反應(yīng)法、共沉淀法、溶膠-凝膠法、氣溶膠分解法、微乳液法及超聲波法等[12]。但是目前上述方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，為克服各種方法不足，采用多種方法組合進(jìn)行制備，獲得很好效果。本研究查閱劉天健[13]研究參考過程通過均相沉淀法進(jìn)行制備，具體如下。

1.2.1 制備Ca（H2P04）2·H20 晶體

取85%磷酸按照磷酸:水=4:1（體積比）稍加稀釋后緩慢滴入Ca（OH）2懸濁液，獲得澄清溶液后，在140 ℃烘箱中烘10～12 h，在85～95 ℃時(shí)結(jié)晶析出片狀無色晶體即Ca（H2P04）2·H20 晶體。

1.2.2 納米摻釓羥基磷灰石的制備過程

（1）取上述結(jié)晶溶解成Ca（H2P04）2·H20 溶液，穩(wěn)定后加入飽和Ca（OH）2溶液，強(qiáng)力攪拌2 min，待溶液完全反應(yīng)后進(jìn)行下一步操作。

（2）根據(jù)不同的摻釓比例（本研究制備0%、1%、5%、10%和15%含釓化合物羥基磷灰石材料，以備后期實(shí)驗(yàn)用），加入不同量的飽和的Ca（OH）2溶液，其配比條件是根據(jù)參考劉天健[13]研究，保證摩爾比（Ca+Gd）/P=1.67 的條件下，不同的Ca、Gd 含量與加入飽和的Ca（OH）2溶液量。

（3）取干燥無水的Gd（N03）3晶體，根據(jù)Ca、Gd 含量加入上述溶液后充分反應(yīng)后靜止5 min，加入一定量的分散劑，檢測(cè)pH，加入NH3·H2O 調(diào)試，pH 為7 左右。

（4）取上述溶液用超聲處理10 min，1 h/次，連續(xù)5 個(gè)周期，最后靜置獲得膠凍狀備用。

（5）將溶膠狀液體低溫冷凍24 h，溫度設(shè)置為-20 ℃，干燥后再200 ℃煅燒獲得n-Gd/HAP 粉末

（6）取獲得的n-Gd/HAP 粉末研磨放置在圓柱形磨具內(nèi)獲得含釓羥基磷灰石復(fù)合材料。

1.3 含釓化合物的羥基磷灰石復(fù)合支架的掃描電鏡觀察

將獲得的釓化合物的羥基磷灰石復(fù)合支架進(jìn)行表面噴金過夜；待滿足要求后將噴金后的釓化合物的羥基磷灰石復(fù)合支架置于掃描電鏡下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 采用均相沉淀法獲得的含有釓化合物的羥基磷灰石外觀圖

獲得含釓化合物的羥基磷灰石粉末放置在圓柱形磨具內(nèi)制備圓柱狀復(fù)合支架，獲得外觀支架形態(tài)約高5 mm 直徑為3 mm 大小圓柱形（為下一步體內(nèi)植入試驗(yàn)完整匹配骨缺損區(qū)域），大體形態(tài)觀察可見支架有大量空隙結(jié)構(gòu)，空隙結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞容納繁殖及骨組織長(zhǎng)入。復(fù)合支架具有大量稀疏多孔結(jié)構(gòu)也就具有大的表面積及高孔隙率,這樣有利于細(xì)胞粘附、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸送以及細(xì)胞代謝產(chǎn)物排出，更有助于細(xì)胞的充分滲透，見圖1。

圖1 含釓化合物的羥基磷灰石復(fù)合支架大體側(cè)面外觀

圖2 釓化合物的羥基磷灰石復(fù)合支架大體正面外觀

2.2 含釓化合物的羥基磷灰石復(fù)合支架掃描電鏡結(jié)果

對(duì)含釓化合物的羥基磷灰石復(fù)合支架進(jìn)行電鏡掃描，可見支架內(nèi)大量疏松交錯(cuò)蜂窩樣空隙結(jié)構(gòu)，空隙率高，連通性好；其電鏡下表面觀察可見含釓化合物的羥基磷灰石顆粒呈現(xiàn)不規(guī)則多邊形結(jié)構(gòu)，排列錯(cuò)綜復(fù)雜，相互交織形成三維立體微孔結(jié)構(gòu)，見圖3。

圖3 含釓化合物的羥基磷灰石復(fù)合支架電鏡圖（1.00 μm）

3 討論

目前在組織工程研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)取得了一定成果，但是由于材料性能及制備過程均存在諸多亟待解決的問題：人體關(guān)節(jié)骨軟骨復(fù)合組織是組分和結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的功能組織，理想的構(gòu)建策略不是將再造的軟骨和骨組織簡(jiǎn)單地縫合或粘合在一起。設(shè)計(jì)仿生功能結(jié)構(gòu)有望解決再造組織質(zhì)量缺陷、移植物與宿主整合欠佳、易松動(dòng)等問題，研發(fā)新型支架材料已成為目前骨科組織工程領(lǐng)域熱門課題。

羥基磷灰石（HA）是目前研究較多的活性生物材料之一，因其具有良好的生物相容性和一定的力學(xué)性能，近年來備受青睞。人骨中磷灰石的含量在60%～70%，而羥基磷灰石作為人體的主要骨礦物質(zhì)，具有良好的生物學(xué)性能，而被大量地研究應(yīng)用于骨修復(fù)材料領(lǐng)域，因此，目前在骨修復(fù)研究領(lǐng)域已經(jīng)研究出各種羥基磷灰石復(fù)合材料，其中較為成熟的還是納米級(jí)羥基磷灰石，因其空間立體結(jié)構(gòu)為晶體結(jié)構(gòu)、尺寸，與人體骨組織非常接近，大量研究發(fā)現(xiàn)納米級(jí)羥基磷灰石具有無毒性、無刺激性、無免疫原性、無不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，并且具有很好的生物相容性及優(yōu)良的骨傳導(dǎo)性和誘導(dǎo)成骨性，且羥基磷灰石能夠很好地與正常骨組織相結(jié)合，形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[14-16]。羥基磷灰石具有良好的生物相容性與成骨活性，在生物體內(nèi)可提供早期的骨強(qiáng)度和骨長(zhǎng)入基石。

近年來，隨著對(duì)稀有元素深入研究發(fā)現(xiàn)，高分散均勻的稀土納米粒子（NPs）的成功合成促使人們進(jìn)一步探索含Gd的微/納米材料在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[17-19]。LARANJEIRA等[20]使用NaGdF4NPs 探針在體內(nèi)進(jìn)行腫瘤靶向MR 成像。XU 等[21]研究了NaGdF4 釋放了低水平的自由離子，所以它是無毒的。合成的羥基磷灰石納米粒子（HA NPs）在化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)上與天然骨相似。與HA 陶瓷相比，HA NPs 具有更大的納米尺寸和比表面積，因此具有更好的生物降解性和生物活性。GdPO4等稀土磷酸鹽具有毒性低、分子穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，目前在臨床給藥或腫瘤治療方面得到很好運(yùn)用[22-24]。人骨中還存在微量的稀土元素，其中釓元素在臨床運(yùn)用較多，目前安全性相對(duì)較好。本研究設(shè)想運(yùn)用稀土元素釓對(duì)細(xì)胞的影響存在“Hormesis”效應(yīng)，在體內(nèi)少量釋放，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

獲得含釓化合物的羥基磷灰石形態(tài)大體滿意，空隙率較高，基本強(qiáng)度較好，已經(jīng)滿足實(shí)驗(yàn)基本需求，掃描電鏡中發(fā)現(xiàn)含釓化合物的羥基磷灰石復(fù)合支架緊密排列、相互連接的同時(shí)保持了相互之間微孔的存在。材料的微孔隙率一直不容易被支架材料研究中所重視，然而在組織工程支架材料評(píng)估方向，大孔隙和相互之間連通性良好的微孔隙共同存在，能夠更好地促進(jìn)成骨細(xì)胞在支架上的粘附和生長(zhǎng)，為支架材料在組織工程骨中發(fā)揮更大的作用，奠定了良好的基礎(chǔ)條件。本實(shí)驗(yàn)獲得的含釓化合物的羥基磷灰石復(fù)合支架電鏡下掃描可見支架內(nèi)大量疏松交錯(cuò)蜂窩樣空隙結(jié)構(gòu)，空隙率高，連通性好；對(duì)其電鏡下表面觀察可見含釓化合物的羥基磷灰石顆粒呈現(xiàn)不規(guī)則多邊形結(jié)構(gòu)，排列錯(cuò)綜復(fù)雜，相互交織形成三維立體微孔結(jié)構(gòu)，為將來進(jìn)行種子細(xì)胞的增殖、分化提供了前期基礎(chǔ)條件。支架復(fù)合材料需要一定強(qiáng)度、孔隙率等復(fù)雜結(jié)構(gòu)，才能更加真實(shí)地模擬人體的微環(huán)境，本實(shí)驗(yàn)中的含釓化合物的羥基磷灰石材料滿足了孔隙率及大孔徑共存的三維立體結(jié)構(gòu)，其對(duì)細(xì)胞增殖的能力值得期待。

本實(shí)驗(yàn)制備的含釓化合物的羥基磷灰石復(fù)合支架材料，其外觀及電鏡下已經(jīng)具有很好的孔隙率及大孔徑的三維立體微孔結(jié)構(gòu)，但是其支架的細(xì)胞毒性及共培養(yǎng)后細(xì)胞增殖能力的影響，仍需要我們進(jìn)一步深入研究。