王亞東 王俊峰

（1.蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院普外科，安徽 蕪湖， 241000；2.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥， 230032；3.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院普外科，安徽 蕪湖， 241001）

胰腺癌是全球七大常見癌癥之一，在發(fā)達(dá)國家排名第三，是一種致命疾病，五年生存率僅為9%[1]。但由于缺乏早期特異性癥狀和晚期診斷，手術(shù)只對15%～20%的胰腺癌患者有較好的治療效果，且近年來我國胰腺癌的發(fā)病率和病死率都在持續(xù)上升[2-3]。因此在分子水平開展對胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究尤為重要。microRNA（miRNA）是近年來的研究熱點(diǎn)RNA，其長度約為20～22 個(gè)核苷酸，屬于小型的非編碼RNA，其在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[4]。研究表明，miRNA 影響幾種生物過程，其中包括細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖和凋亡，當(dāng)表達(dá)失調(diào)時(shí)，這些過程的改變可能引發(fā)癌變[5]。miR-590-3p 屬于真核翻譯起始因子4H 基因的內(nèi)含子之一，miR-590-3p 首次報(bào)道可增強(qiáng)心肌梗死后的心肌細(xì)胞增殖和心臟再生[6-7]。最近的研究報(bào)道m(xù)iR-590-3p 對幾種類型的癌癥有影響，不過其在胰腺癌中的作用尚不清楚[8]。本研究將通過上調(diào)miR-590-3p 在胰腺癌Capan-2 細(xì)胞中的表達(dá)，探索并討論其對胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

Capan-2（人胰腺癌細(xì)胞系）從中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院中心購入，在37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)于含10%胎牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)基（Sigma）。細(xì)胞貼壁生長，用0.25%的胰酶消化傳代。當(dāng)Capan-2 細(xì)胞數(shù)量增至約為6×105時(shí)將其接種于6 孔板中，待細(xì)胞達(dá)到80%左右生長密度時(shí)，按照試劑說明書使用lipofectamine2 000 轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。根據(jù)是否轉(zhuǎn)染將細(xì)胞分為陰性對照組（NC 組）以及轉(zhuǎn)染miR-590-3p mimics 組（miR-590-3p mimics 組）。

1.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）

通過Trizol 試劑盒將細(xì)胞的總RNA 進(jìn)行提取，再通過分光光度計(jì)檢測RNA 的濃度和純度，并將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；miR-590-3p 正向引物5’-AGCCGGAGACTTACCCA ATTG-3’，反向引物：5’-GTCTCTCGACAGTTACTC-3’；GAPDH 為F: 5’-GCTCATCGGCCTCCATTCA-3’ , R:5’-TACGCGACGTCGGCGAGCTT-3’。將cDNA 作為模板，并根據(jù)試劑盒配置反應(yīng)體系的說明在95℃下預(yù)熱5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s（循環(huán)40 次）的反應(yīng)條件下進(jìn)行反應(yīng)。最后miR-590-3p 的相對表達(dá)水平通過 2-ΔΔCT方法進(jìn)行計(jì)算。

1.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

當(dāng)Capan-2 細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)，用胰蛋白酶將其消化，并用冷藏保存的磷酸鹽緩沖液（PBS）對細(xì)胞進(jìn)行洗滌，根據(jù)Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒說明步驟，采用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

當(dāng)Capan-2 細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)，用胰蛋白酶將其消化，懸浮細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞至合適的密度，以每孔90～100 μL 的液體量接種細(xì)胞懸液于96 孔板，分別在轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h時(shí)，加入10 μL 濃度為5 mg/mL 的MTT 溶液到各孔中，在37 ℃的溫度下孵育4 h 后棄掉上清夜，加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO）至各孔，最后進(jìn)行搖床孵育。在490 nm 波長處檢測各孔的吸光度（OD 值）。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，用20 μL 槍頭進(jìn)行劃痕，將脫落的細(xì)胞洗滌。接著通過顯微鏡進(jìn)行拍照，記錄下劃痕寬度并標(biāo)記。最后放置于培養(yǎng)箱培育24 h 后同樣在顯微鏡下進(jìn)行拍照并標(biāo)記劃痕寬度。根據(jù)細(xì)胞愈合時(shí)的相對間距評估細(xì)胞運(yùn)動能力。

1.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

當(dāng)Capan-2 細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)，用胰蛋白酶將其消化，用少量不含胎牛血清的培養(yǎng)液將其懸液，并將90～100 μL細(xì)胞接種至Transwell 小室的上半室，并加入約400 μL 的培養(yǎng)基于下半室中。將其放置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后，用0.3%的結(jié)晶紫染液染色30 min，洗去殘余染液，在顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)。

1.7 Western blot 實(shí)驗(yàn)

當(dāng)Capan-2 細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)，加入RIPA 細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白。采用BCA 試劑盒測量細(xì)胞樣品的蛋白含量，取適量且等量的樣品加入10% SDS-PAGE 凝膠的上樣孔中，通過電泳法進(jìn)行蛋白分離，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至NC 膜，通過5%脫脂牛奶在室溫下將其封閉1.5 h。待封閉結(jié)束，在相應(yīng)分子量對應(yīng)條帶位置進(jìn)行裁剪，并分別加入1:1 000 濃度的AKT、p-AKT、mTOR 以及p-mTOR 一抗溶液，在4 ℃下孵育過夜，一抗孵育24 h 后取出條帶用TBST洗滌3 次，10 min/次，洗滌結(jié)束后于室溫條件下進(jìn)行1 h二抗孵育，結(jié)束后用TBST 洗滌3 次，10 min/次，最后加入ECL 發(fā)光液于化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行曝光，以GAPDH 為內(nèi)參，通過Image Lab 軟件對蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)并分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0 軟件對上述實(shí)驗(yàn)所得的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-590-3p 在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)情況

采用qRT-PCR 法檢測人胰腺導(dǎo)管上皮hTERT-HPNE 細(xì)胞以及胰腺癌Capan-2 細(xì)胞中miR-590-3p 的表達(dá)。結(jié)果顯示，miR-590-3p 表達(dá)量分別為（1.00±0.23）、（0.56±0.12）,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 miR-590-3p 在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)情況 （±s）

表1 miR-590-3p 在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)情況 （±s）

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2.2 上調(diào)miR-590-3p 對胰腺癌Capan-2 細(xì)胞中miR-590-3p水平的表達(dá)

qRT-PCR 結(jié)果顯示，miR-590-3p 在NC 組及miR-590-3p mimics 組mRNA 表達(dá)量分別為（1.00±0.15）、（4.23±0.32），miR-590-3p mimics 組miR-590-3p mRNA 水平較NC 組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 上調(diào)miR-590-3p 對胰腺癌Capan-2 細(xì)胞中miR-590-3p 水平的表達(dá) （±s）

表2 上調(diào)miR-590-3p 對胰腺癌Capan-2 細(xì)胞中miR-590-3p 水平的表達(dá) （±s）

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2.3 上調(diào)miR-590-3p 對胰腺癌Capan-2 細(xì)胞凋亡能力的影響

細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NC 組以及miR-590-3p mimics組凋亡率分別為（15.64±1.82） %、（37.95±2.65） %。miR-590-3p mimics 組凋亡能力較NC 組表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.020，P＜0.001），見圖1。

圖1 上調(diào)miR-590-3p 對胰腺癌Capan-2 細(xì)胞凋亡能力的影響

2.4 上調(diào)miR-590-3p 對胰腺癌Capan-2 細(xì)胞增殖能力的影響

MTT 增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Capan-2 細(xì)胞中NC 組及miR-590-3p mimics 組24 h、48 h、72 h 細(xì)胞增殖率分別為[（72.56±5.12）、（80.18±6.23）、（89.65±6.37）]%、[（52.15±5.02）、（56.34±5.62）、（62.15±5.84）]%。miR-590-3p mimics組增殖能力較NC 組表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-4.930，P=0.008 ；t=-4.921，P=0.008 ；t=-5.512，P=0.005）。

2.5 上調(diào)miR-590-3p 對胰腺癌Capan-2 細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-590-3p mimics 組細(xì)胞遷移能力較NC 組明顯減弱，表明過表達(dá)miR-590-3p 顯著降低了Capan-2 細(xì)胞遷移能力，見圖2。

圖2 上調(diào)miR-590-3p 對胰腺癌Capan-2 細(xì)胞遷移能力的影響

2.6 上調(diào)miR-590-3p 對胰腺癌Capan-2 細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-590-3p mimics組細(xì)胞侵襲能力[（26.45±3.56）個(gè)]較NC 組[（57.25±4.52）個(gè)]明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.623，P＜0.001），見圖3。

圖3 上調(diào)miR-590-3p 對胰腺癌Capan-2 細(xì)胞侵襲能力的影響

2.7 上調(diào)miR-590-3p 對胰腺癌Capan-2 細(xì)胞AKT/mTOR 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與NC 組相比，miR-590-3p mimics 組中p-AKT 和p-mTOR 蛋白水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；NC 組與miR-590-3p mimics 組中AKT 和mTOR 蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3、圖4。

圖4 上調(diào)miR-590-3p 對胰腺癌Capan-2 細(xì)胞AKT/mTOR 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表3 上調(diào)miR-590-3p 對胰腺癌Capan-2 細(xì)胞AKT/mTOR 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 （±s）

表3 上調(diào)miR-590-3p 對胰腺癌Capan-2 細(xì)胞AKT/mTOR 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 （±s）

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3 討論

目前，胰腺癌仍然屬于高度致命的惡性腫瘤，預(yù)計(jì)在未來三十年左右會成為全國癌癥死亡的第二大病因[9]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約85%的胰腺癌患者會出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，因此胰腺癌的五年生存率僅僅只有10%[10]。雖然胰腺癌的診斷方法、圍手術(shù)期管理、放療技術(shù)和晚期患者全身治療獲得了顯著進(jìn)展，但仍有20%的患者在手術(shù)后只能存活五年，這表明在分子水平上找到正確的治療胰腺癌的靶點(diǎn)仍然是關(guān)鍵的。

近年的研究報(bào)道m(xù)iR-590-3p 在各類型的癌癥中發(fā)揮著重要作用，但其在胰腺癌中的作用尚未確定，一些研究報(bào)告了miR-590-3p 在其他類型的癌癥中的腫瘤促進(jìn)和腫瘤抑制作用。例如，miR-590-3p 通過抑制RB1 促進(jìn)T 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的細(xì)胞增殖和侵襲，通過靶向Hippo 途徑和促進(jìn)β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)促進(jìn)結(jié)直腸癌的細(xì)胞增殖和侵襲[8-11]。同樣，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中也觀察到miR-590-3p 具有腫瘤促進(jìn)作用[12]。另外，研究報(bào)道m(xù)iR-590-3p 可抑制肝細(xì)胞癌生長并抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移[13-14]。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染miR-590-3p mimics 到胰腺癌Capan-2 細(xì)胞系獲得了miR-590-3p 過表達(dá)細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)miR-590-3p mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中凋亡能力增加，細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力明顯減弱，表明上調(diào)miR-590-3p 可以抑制胰腺癌腫瘤細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展。

P13K/AKT/mTOR 通路是一種細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，參與多個(gè)生物學(xué)過程，是細(xì)胞應(yīng)激生存的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。該通路的失調(diào)與多種人類疾病的進(jìn)展有關(guān)，包括糖尿病、自身免疫性疾病和腫瘤[15]。由于腫瘤存在于內(nèi)在應(yīng)激環(huán)境中，該通路在癌癥中的作用至關(guān)重要。P13K 是由調(diào)節(jié)亞基p85 和催化亞基p110 構(gòu)成二聚體。當(dāng)它與生長因子受體（如EGFR）結(jié)合后，可改變AKT 的蛋白結(jié)構(gòu)并使其活化，并以磷酸化作用激活或抑制下游一系列底物如凋亡相關(guān)蛋白的活性，從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等表型[16]。P13K/AKT下游靶點(diǎn)是mTOR，它接收并整合由營養(yǎng)攝入、生長因子和其他細(xì)胞刺激啟動的信號，以調(diào)節(jié)下游信號和蛋白質(zhì)合成，并通過其下游效應(yīng)子參與啟動核糖體翻譯，將mRNA 轉(zhuǎn)化為細(xì)胞生長、細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞代謝所必需的蛋白質(zhì)[17]。由此可見，P13K/AKT/mTOR 通路的激活會導(dǎo)致對細(xì)胞生長和生存控制的嚴(yán)重干擾，最終導(dǎo)致競爭生長優(yōu)勢、轉(zhuǎn)移能力、血管生成和治療耐藥性[18]。因此針對這一通路進(jìn)行靶向治療可以有效地抑制腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展。本研究中通過檢測P13K/AKT/mTOR 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，探討上調(diào)miR-590-3p 對胰腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，結(jié)果顯示miR-590-3p mimics轉(zhuǎn)染組p-AKT 和p-mTOR 表達(dá)明顯降低，表明上調(diào)miR-590-3p 可明顯降低抑制AKT 與mTOR 的磷酸化，進(jìn)一步抑制胰腺癌的進(jìn)展。

綜上所述，本研究以胰腺癌Capan-2 細(xì)胞為研究對象，證實(shí)了上調(diào)miR-590-3p 對胰腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力具有明顯抑制的作用， 其作用機(jī)制還需要深入研究。 以上研究進(jìn)一步加深了miR-590-3p 在胰腺癌中的功能和分子機(jī)制的認(rèn)識，為胰腺癌在臨床的診療提供了一定的理論思路與依據(jù)。