黃昭瑩，盧麗酈，朱其鳳*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011）

錳（Mn）是廣泛存在于自然界里的一種金屬元素，也是人體生長發(fā)育必不可少的微量元素，參與機(jī)體的多種生理過程，但體內(nèi)錳含量過多會對機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的器官毒性［1］。有研究表明，過量的錳能夠干預(yù)機(jī)體內(nèi)線粒體代謝及神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)而直接損傷神經(jīng)系統(tǒng)［2］；同時(shí)，血錳高水平狀態(tài)被證實(shí)與脂肪性肝病和肝纖維化高度相關(guān)［3］。此外，長期暴露在高錳環(huán)境下，肺的通氣功能隨著暴露時(shí)間的延長會逐漸下降［4］，對腎臟、脾臟也產(chǎn)生毒性作用［5］。甲基環(huán)戊二烯三羰基錳（methylcyclopentadienyl manganese tricar-bonyl，MMT）是一種有機(jī)含錳化合物［（CH3C5H4）Mn（CO）3］，為黃色液體，具有易揮發(fā)、脂溶性強(qiáng)和微溶于水等特點(diǎn)［6］，近年來，隨著工業(yè)、采礦業(yè)、制造業(yè)的快速發(fā)展，汽油被廣泛使用，MMT 作為汽油抗爆劑也隨之大量被使用，導(dǎo)致環(huán)境中錳含量增高，人們在日常生活中接觸錳的機(jī)會增多，可能導(dǎo)致一般人群體內(nèi)錳含量失衡，進(jìn)而產(chǎn)生毒性作用，損害體內(nèi)臟器功能。動物急性MMT 暴露會導(dǎo)致肝、脾、肺和腎損害，并出現(xiàn)虛弱、抽搐和呼吸困難［7-8］。因此，本研究通過觀察MMT 暴露SD 大鼠體質(zhì)量增長情況、大鼠實(shí)質(zhì)性臟器（心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟）的臟器系數(shù)和錳含量，并對實(shí)質(zhì)性臟器質(zhì)量與錳含量進(jìn)行相關(guān)性分析，探討MMT 暴露對SD 大鼠實(shí)質(zhì)性臟器的影響，以便為臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物 8 周齡SPF 級SD 大鼠，雄雌各半，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號：SCXK（桂）202010018。將大鼠飼養(yǎng)于可控的SPF 級環(huán)境條件下，室溫為（22±2）℃，濕度范圍為（50±5）%，光暗周期為12 h/12 h，每日添加飼料、飲水，大鼠可自由飲水采食。動物研究根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動物和福利倫理審查指南》（標(biāo)準(zhǔn)號：GB/T 35892-2018）進(jìn)行。

1.2 試劑與儀器 甲基環(huán)戊二烯三羰基錳（MMT）、MnCl2·4H2O（無機(jī)MnCl2，由上海麥克林生化科技有限公司提供，貨號：203637-22）；電子分析天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；制冰機(jī)（日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社）；醫(yī)用低溫保存箱（青島海爾集團(tuán)）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動物分組 取30只SD大鼠（雌雄各半），將15只雄性SD 大鼠按隨機(jī)區(qū)組法分為正常對照組、MMT 低劑量組（L-MMT 組，1 mg/kg）、MMT中劑量組（M-MMT組，2 mg/kg）、MMT高劑量組（H-MMT組，4 mg/kg）和Mn-Cl2·4H2O組（MnCl2組，200 mg/kg），每組3只。另將15只雌性SD 大鼠按上述方法分為5 組，每組3 只。

2.2 動物處理 MMT 和無機(jī)MnCl2染毒劑量根據(jù)文獻(xiàn)［9-10］確定。MMT 低、中、高劑量組分別予經(jīng)口灌胃MMT 溶液（1 mg/kg、2 mg/kg、4 mg/kg，溶于玉米油），MnCl2組大鼠經(jīng)口灌胃MnCl2·4H2O（200 mg/kg，溶于生理鹽水），正常對照組大鼠經(jīng)口灌胃玉米油，各組灌胃體積均為1 ml/kg。每日1 次，每周6 d，連續(xù)8 周。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 體質(zhì)量 每天測定SD 大鼠體質(zhì)量，評估其生長發(fā)育情況，并根據(jù)當(dāng)天大鼠體質(zhì)量調(diào)整MMT 和Mn-Cl2的劑量。

2.3.2 臟器系數(shù)指標(biāo) 每組取3 只雄性大鼠和3 只雌性大鼠斷頭處死后進(jìn)行腹主動脈采血，鑷子分離心、肝、脾、肺、腎臟器后，用濾紙將各器官的血水拭干，稱量并記錄各器官質(zhì)量。臟器系數(shù)（%）=臟器質(zhì)量/空腹體質(zhì)量×100%［11］。

2.3.3 組織錳含量測定 首先使用微波消解技術(shù)將大鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟樣本放入5 ml 濃硝酸中消解。硝酸消解程序設(shè)定：溫度爬升至100 ℃保持消化10 min，然后在溫度爬升至180 ℃時(shí)保持20 min。微波消解儀消解結(jié)束后冷卻至室溫，將所得溶液在150 ℃石墨電熱板上趕酸。最后將所得澄清透亮溶液轉(zhuǎn)移至15 ml 離心管，使用超純雙蒸水定容至6 ml 濃硝酸中消解，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）分析錳濃度。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，符合正態(tài)分布采用Pearson 進(jìn)行相關(guān)性分析，若不符合正態(tài)分布，用Spearman 進(jìn)行相關(guān)性分析，并用Levene 檢驗(yàn)方差的同質(zhì)性。組間比較通過單因素方差分析（ANOVA），然后進(jìn)行Tukey事后檢驗(yàn)。P＜0.05為具有顯著性差異。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠體質(zhì)量比較 在干預(yù)前，各組大鼠的體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。干預(yù)后與正常對照組比較，MMT 各劑量組和MnCl2組的雄性大鼠和雌性大鼠的體質(zhì)量增長均有所下降。與正常對照組比較，MnCl2組干預(yù)第2 周、第3 周后雄性大鼠的體質(zhì)量增長下降（P＜0.05）。與MnCl2組大鼠比較，第2 周L-MMT和M-MMT 組的雄性大鼠體質(zhì)量明顯增長（P＜0.05），而H-MMT 組和MnCl2組雄性大鼠的體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)后第2 周、第3 周，H-MMT 組雌性大鼠體質(zhì)量較正常對照組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其余組大鼠的體質(zhì)量與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（g，）

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（g，）

注：與正常對照組同性別、同時(shí)間點(diǎn)比較，①P＜0.05；與MnCl2組同性別、同時(shí)間點(diǎn)比較，②P＜0.05

組 別第1周雄性（n=3）277.57±16.88 277.90±18.16 280.50±13.28 262.83±12.48 261.11±17.44雌性（n=3）291.07±30.28 282.80±20.14 273.20±19.83 261.80±20.20 270.07±12.04雌性（n=3）235.87±12.81 231.73±13.87 222.40±18.63 215.50±14.03 228.93±7.97正常對照組L-MMT組M-MMT組H-MMT組MnC12組第2周雄性（n=3）320.37±14.56 312.63±21.41②315.13±11.56②299.73±12.39 279.39±12.43①雌性（n=3）251.67±18.19 242.70±14.91 237.10±16.71 222.67±16.30①240.43±8.28第3周雄性（n=3）344.53±20.41 332.67±23.44 339.07±15.55 330.00±19.30 301.06±16.37①雌性（n=3）260.90±21.78 252.37±15.02 247.33±14.10 229.57±16.73①249.77±8.94第8周雄性（n=3）449.90±43.64 448.71±25.38 435.87±26.06 426.73±32.10 401.17±49.07

3.2 各組大鼠實(shí)質(zhì)性臟器系數(shù)比較 干預(yù)8 周后，與正常對照組比較，L-MMT 組、H-MMT 組和MnCl2組雄性大鼠心臟系數(shù)較小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。H-MMT組雌性大鼠肝臟系數(shù)比正常對照組?。≒＜0.05），L-MMT 組、M-MMT 組和MnCl2組雌性大鼠肺臟系數(shù)較正常對照組小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其余組大鼠臟器系數(shù)與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與MnCl2組大鼠比較，H-MMT 組雌性大鼠肺臟系數(shù)較大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。然而，L-MMT 組、M-MMT 組雌性大鼠肺臟系數(shù)與MnCl2組大鼠比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。此外，與雌性大鼠比較，部分組別雄性大鼠在心臟、肺臟和腎臟系數(shù)均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）；肝臟、脾臟系數(shù)未見性別差異（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠實(shí)質(zhì)性臟器系數(shù)比較（%，）

表2 各組大鼠實(shí)質(zhì)性臟器系數(shù)比較（%，）

注：與正常對照組同性別比較，①P＜0.05；與MnCl2組同性別比較，②P＜0.01；與同暴露程度雌性大鼠比較，③P＜0.05，④P＜0.01

組 別正常對照組L-MMT組M-MMT組H-MMT組MnC12組雌性（n=3）0.65±0.06 0.61±0.06 0.61±0.04 0.64±0.04 0.63±0.01心臟雄性（n=3）0.38±0.03 0.30±0.03①③0.35±0.04 0.31±0.05①0.31±0.03①雌性（n=3）0.38.0.03 0.36±0.03 0.37±0.02 0.36±0.02 0.37±0.02肝臟雄性（n=3）3.20±0.29 2.72±0.47 2.76±0.16 2.77±0.01 2.84±0.53雌性（n=3）3.12±0.10 3.02±0.34 3.05±0.15 2.64±0.20①2.87±0.14脾臟雄性（n=3）0.17±0.01 0.19±0.01 0.16±0.02 0.20±0.01 0.16±0.00雌性（n=3）0.20±0.01 0.17±0.01 0.18±0.02 0.20±0.02 0.19±0.02肺臟雄性（n=3）0.37±0.06 0.40±0.09 0.36±0.03 0.44±0.03④0.44±0.04雌性（n=3）0.61±0.03 0.47±0.04①0.50±0.06①0.56±0.03②0.43±0.00①腎臟雄性（n=3）0.58±0.04 0.60±0.10 0.64±0.05 0.56±0.01③0.61±0.03

3.3 各組大鼠實(shí)質(zhì)性臟器錳濃度比較 MMT 各劑量組、MnCl2組大鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟及腎臟錳濃度較正常對照組升高，多數(shù)存在顯著性差異（P＜0.05 或P＜0.01）。與MnCl2組比較，L-MMT 組雄性大鼠肺臟、腎臟錳濃度顯著升高（P＜0.05）；M-MMT 組雄性大鼠腎臟及雌性大鼠肺臟、腎臟錳濃度顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；H-MMT 組雄性大鼠肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及雌性大鼠心臟、脾臟、肺臟及腎臟錳濃度顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。此外，MMT各劑量組雌性大鼠脾臟錳濃度高于雄性大鼠，雄性大鼠肝臟錳濃度顯著高于雌性大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠實(shí)質(zhì)性臟器錳濃度比較（μg/g，）

注：與正常對照組同性別比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與MnCl2組同性別比較，③P＜0.05，④P＜0.01；與同暴露程度雌性大鼠比較，⑤P＜0.05

組 別雌性（n=3）0.37±0.03 0.46±0.04 0.71±0.06②④0.98±0.05②④0.45±0.03正常對照組L-MMT組M-MMT組H-MMT組MnC12組心臟雄性（n=3）0.16±0.02 0.20±0.01 0.34±0.02①0.41±0.01②0.31±0.09①雌性（n=3）0.13±0.01 0.21±0.02 0.25±0.01①0.41±0.07②③0.26±0.01①肝臟雄性（n=3）1.12±0.13 2.02±0.11①⑤2.52±0.16②⑤3.66±0.21②④⑤2.26±0.14①雌性（n=3）1.09±0.13 1.69±0.18①1.99±0.04②2.18±0.10②1.85±0.15②脾臟雄性（n=3）0.20±0.02 0.26±0.04⑤0.30±0.01①⑤0.46±0.02②④0.27±0.04⑤雌性（n=3）0.25±0.03 0.36±0.01 0.43±0.03①0.54±0.09②③0.37±0.04肺臟雄性（n=3）0.13±0.04 0.78±0.02②③1.28±0.10②1.79±0.17②④1.14±0.02②雌性（n=3）0.13±0.01 0.56±0.11①1.23±0.13②③2.23±0.16②④0.74±0.14①腎臟雄性（n=3）0.49±0.04 1.05±0.03②③1.44±0.09②④1.87±0.01②④0.82±0.08②

3.4 錳暴露大鼠臟器質(zhì)量與錳濃度的相關(guān)性分析 除雄性大鼠肝臟質(zhì)量與錳濃度的相關(guān)系數(shù)（R值）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）外，其余各臟器質(zhì)量與錳濃度相關(guān)性分析均無顯著性差異（P＞0.05），見表4。

表4 MMT暴露大鼠實(shí)質(zhì)性臟器質(zhì)量與錳濃度的相關(guān)性分析（n=3）

4 討 論

體質(zhì)量是評價(jià)大鼠生長發(fā)育的一項(xiàng)直觀且重要的指標(biāo)，可以反映毒物對生物體整體生長的影響，是動物實(shí)驗(yàn)、醫(yī)學(xué)研究觀察必不可少的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。體質(zhì)量增長的變化通常用于評價(jià)藥物、各類化學(xué)物對實(shí)驗(yàn)動物的毒性作用。同樣，在人體的臨床研究中，體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）是國際上常用的基于人體身高、體重的測量方法，目前已廣泛應(yīng)用于評估高血壓、糖尿病、癌癥、高膽固醇血癥和其他慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)及相關(guān)性研究。本次關(guān)于MMT 的動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MMT 和MnCl2均可導(dǎo)致雄性和雌性SD 大鼠體質(zhì)量增長速度下降，表明錳暴露會延緩SD 大鼠的生長發(fā)育，驗(yàn)證了之前的研究結(jié)果［12］。結(jié)果還顯示，與正常對照組比較，H-MMT 組雌性大鼠體質(zhì)量增長較少，這表明高劑量MMT（4 mg/kg）可能對雌性大鼠造成了更明顯的毒性傾向，也說明雌性大鼠對MMT的敏感性較雄性大鼠高。有實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道，腹腔內(nèi)注射MnCl2會導(dǎo)致SD 雄性大鼠體質(zhì)量持續(xù)下降［13］。本研究結(jié)果顯示，MnCl2組雄性大鼠的體質(zhì)量增長小于正常對照組。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，雄性L-MMT 組、M-MMT組和MnCl2組體質(zhì)量增長比較存在顯著性差異，其原因可能是由于低劑量產(chǎn)生的毒性作用較弱。H-MMT組與MnCl2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明高劑量MMT 與MnCl2致大鼠體重增長速度下降作用相似，這為有機(jī)MMT、無機(jī)MnCl2的錳毒性研究提供了相關(guān)劑量參考。同樣，Nachtman 等［14］研究指出，給予MnCl2（1.0 mg/ml）飲用水的大鼠中，在13周內(nèi)在不同暴露水平下各組之間的體質(zhì)量比較無顯著性差異。

臟器系數(shù)指標(biāo)在毒理研究中可以反映各類有毒物質(zhì)對動物臟器損害的嚴(yán)重程度，常用于評價(jià)藥物安全。當(dāng)動物臟器受損、充血、水腫或增生時(shí)，臟器系數(shù)會增大。錳一旦進(jìn)入血液循環(huán)，就會分布到肝臟、肺臟和腎臟等組織器官［15］，根據(jù)生長指標(biāo)評估毒物的毒性終點(diǎn)，本研究分析了有機(jī)MMT 和無機(jī)MnCl2不同形式錳暴露大鼠下的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟的臟器系數(shù)。有研究報(bào)道，錳對大鼠心臟的影響是迅速且可逆的，急性期大鼠心臟積累的錳不影響心功能和能量代謝［16］。在本研究中，L-MMT、H-MMT 及MnCl2組雄性大鼠心臟系數(shù)較正常對照組降低。另外，錳暴露會導(dǎo)致肺部引起炎癥、細(xì)胞損傷和纖維化［17］。在本研究中，L-MMT 組、M-MMT 組及MnCl2組雌性大鼠肺臟系數(shù)較正常對照組降低。但是，H-MMT組與MnCl2組相比，雌性大鼠肺臟系數(shù)較正常對照組大，提示可能與錳劑量相關(guān)。臟器系數(shù)的改變存在性別差異，與雌性大鼠相比，雄性大鼠在心臟、肺臟和腎臟系數(shù)均降低。此外，與MnCl2組大鼠比較，H-MMT 組雌性大鼠肺臟系數(shù)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，L-MMT組和M-MMT 組雌性大鼠肺臟系數(shù)與MnCl2組大鼠比較差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究結(jié)果表明，MMT 和無機(jī)MnCl2染毒均可導(dǎo)致錳在大鼠實(shí)質(zhì)性臟器中沉積。MMT 各劑量組、Mn-Cl2組大鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟及腎臟中的錳濃度顯著升高，提示錳暴露造模有效。本研究結(jié)果表明，與MnCl2相比，更高劑量的MMT 暴露會導(dǎo)致實(shí)質(zhì)性臟器更高的錳濃度。

值得注意的是，在既往研究中使用大鼠模型類似的動物模型實(shí)驗(yàn)表明，錳在肝臟中的含量最高，其次是腎臟和心臟［18］。本研究結(jié)果，所有雄雌性大鼠的最大臟器系數(shù)均為肝臟系數(shù)。錳迅速從血液分布到肝臟，到達(dá)脾臟的量較少。肝臟是以代謝功能為主的器官，主要參與營養(yǎng)物質(zhì)、藥物和毒物的代謝，造血和凝血功能及膽汁的分泌等［19］。肝臟和膽道排泄是錳排泄的主要途徑［20］，因此，錳從血液到肝臟的快速消除過程可能部分是從肝臟通過膽汁代謝。本研究結(jié)果還顯示，雄性大鼠肝臟中錳濃度高于雌性大鼠，提示雄性大鼠中MMT 消除較慢。由于毒性代謝的性別差異已在許多研究中得到證實(shí)［21-22］，故本研究假設(shè)MMT的性別依賴性代謝可能是其原因。

本研究對MMT 暴露大鼠臟器質(zhì)量與錳濃度的相關(guān)性分析顯示，雄性大鼠肝臟質(zhì)量與錳濃度存在顯著相關(guān)性（P＜0.01），且呈負(fù)相關(guān)。肝臟作為全身最大的代謝和解毒臟器，在錳清除過程中發(fā)揮著重要作用。MMT暴露可能對大鼠的肝臟組織產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致肝臟組織充血、水腫或增生肥大［23］。不僅如此，肝臟是一個(gè)可以受性激素調(diào)控的器官，雌激素通過卵巢內(nèi)分泌對肝臟生理功能發(fā)揮重要的調(diào)控作用［24］。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是評估肝臟病變的常用指標(biāo)，在既往比較研究雄雌性大鼠對有毒、有害物質(zhì)造成的肝損傷實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雄性大鼠肝組織中VEGF 的陽性細(xì)胞較雌性大鼠表達(dá)更為顯著，說明雄性大鼠肝損傷后修復(fù)能力較強(qiáng)［25］。有研究發(fā)現(xiàn)，MMT 暴露后，雄性大鼠的表觀分布容積與雌性大鼠相似，但雄性大鼠的錳表觀清除率是雌性大鼠的2 倍［26］。因此，雄性大鼠的肝臟質(zhì)量與錳濃度存在負(fù)相關(guān)性可能與性別差異有關(guān)。

綜上所述，MMT 和無機(jī)MnCl2暴露會減緩大鼠體質(zhì)量的增長，同時(shí)，MMT 和無機(jī)MnCl2暴露可導(dǎo)致大鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟的錳濃度升高。職業(yè)、環(huán)境或醫(yī)源性錳來源都可能導(dǎo)致人體過量錳暴露，且長期接觸生長性毒物的職業(yè)人群錳暴露風(fēng)險(xiǎn)更高，而環(huán)境中燃燒產(chǎn)物所致的錳污染也會使人群錳暴露的風(fēng)險(xiǎn)增高。但目前關(guān)于MMT 過量暴露對臟器毒性的機(jī)制并未完全清楚，錳對臟器毒性的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究不夠完善，流行病學(xué)調(diào)查多為描述性結(jié)果，且研究樣本量偏小。因此，需要更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及流行病學(xué)研究來進(jìn)一步探索、檢驗(yàn)和驗(yàn)證MMT 過量暴露致實(shí)質(zhì)性臟器毒性的作用機(jī)制，為MMT 與錳毒性防治、制訂預(yù)防對策提供科學(xué)參考。