張桂珍，蘇 健，胡 穎，江圓圓，黃春韻，李學(xué)堅(jiān)*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西中醫(yī)藥科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一種由多病因引起的以血糖升高為特征的代謝類疾?。?］。國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2021 年全球糖尿病患者總數(shù)約有5.37 億人，且糖尿病患病率每年在持續(xù)增加［2-3］。臨床上治療糖尿病的口服降糖藥物主要包括格列奈類、雙胍類、二甲基肽酶4（DPP-4）抑制劑、α-葡萄糖苷酶抑制劑和磺酰脲類等。α-葡萄糖苷酶抑制劑可通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性，減緩淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖的速率，減少小腸對(duì)葡萄糖的吸收，從而達(dá)到降低餐后血糖的目的［4］。從天然產(chǎn)物中篩選糖苷酶抑制劑是開發(fā)降糖藥物的策略之一，目前研究人員已經(jīng)從藥用植物中提取或分離出數(shù)個(gè)具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的活性成分［5-8］。

貓豆是豆科黧豆屬植物，為廣西特色藥用植物，廣西是最主要的產(chǎn)區(qū)［9］。貓豆具有多種有效成分，從其中提取的左旋多巴在帕金森綜合征的臨床治療中發(fā)揮著重要的作用［10-11］。此外實(shí)驗(yàn)研究也顯示貓豆提取物在糖尿病大鼠模型實(shí)驗(yàn)中具有明確的降血糖作用［12-14］。為進(jìn)一步探討其降糖作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用系統(tǒng)溶劑法制備貓豆不同部位（根、莖、葉、花、豆和豆莢）的提取物，研究各提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，并篩選出相應(yīng)的活性成分。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材與試劑 貓豆采自廣西百色市，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室滕建北教授鑒定為豆科植物貓豆Mucuna pruriensvar.utilis（Wall.ex Wight）Baker ex Burck。將貓豆植株清洗干凈，把根、莖、葉、花、豆和豆莢分開，在陰涼處晾干，備用。α-葡萄糖苷酶（貨號(hào)G8823，批號(hào)12021013，規(guī)格為1KU）和阿卡波糖（貨號(hào)A9281，批號(hào)1228D031，純度＞95%）購自北京索萊寶科技有限公司；對(duì)硝基苯酚葡萄糖苷（PNPG，貨號(hào)N8390，批號(hào)505Q021，純度＞98%）購自美國Sigma公司；提取用的溶劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器 Epoch2T 全波長酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）；XEVO G2 QTOF高分辨質(zhì)譜儀、H-class超高效液相色譜儀（美國沃特斯公司）；EYE4 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會(huì)社）；Alpha 1-2 LDplus 凍干機(jī)（德國Christ 公司）。

2 方 法

2.1 貓豆各植株部位提取物的制備 稱取干燥的貓豆根50 g，粉碎成粗粉，加入1 000 ml 乙醇冷浸24 h，期間不時(shí)攪拌，過濾，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上揮去乙醇，得到乙醇總提取物。用50 ml 氯仿∶水（1∶1）溶液使其溶解，振蕩萃取10 min，離心，分離氯仿層和水層。氯仿層置于水浴鍋中揮干氯仿，向殘?jiān)屑尤?0 ml 正己烷和60%甲醇（1∶1）溶解，振蕩萃取10 min，離心，分離上層，揮去溶劑后得到正己烷提取物；甲醇層依次用四氯化碳和氯仿各振搖萃取10 min，分離出各層提取物，揮去溶劑后分別得到四氯化碳提取物、氯仿提取物和甲醇提取物。向上述的水層加入25 ml 水飽和正丁醇，振搖萃取10 min，離心，分離上下層，揮去溶劑分別得到正丁醇提取物和水提取物Ⅰ。將前述乙醇提取后的植物殘?jiān)鼡]去溶劑，加入1 000 ml 蒸餾水，冷浸24 h，過濾，濾液凍干后得到水提取物Ⅱ。用上述方法分別制備貓豆的莖、葉、花、豆和豆莢的提取物。上述得到的各部位提取物，分別用含6%二甲基亞砜（DMSO）的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解，制備成濃度為1.0 mg/ml、0.1 mg/ml、0.01 mg/ml的提取物溶液，用于α-葡萄糖苷酶活性抑制實(shí)驗(yàn)。將上述正己烷提取物和四氯化碳提取物用乙腈溶解，氯仿提取物、正丁醇提取物、甲醇提取物和水提取物（Ⅰ，Ⅱ）用50%乙腈溶解，分別制成1 mg/ml 的溶液，用于液相質(zhì)譜分析測(cè)定。

2.2 α-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定 反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行。每孔反應(yīng)液總體積為180 μl，其中α-葡萄糖苷酶溶液（2 U/ml）30 μl，0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS）72 μl；對(duì)照組加入阿卡波糖溶液（5.6 mg/ml）18 μl，貓豆不同提取物組加入各濃度的提取物溶液18 μl，空白組加入6% DMSO PBS 溶液18 μl，混合均勻，于37 ℃下預(yù)熱10 min后，再分別加入底物溶液（2.5 mmol/L）60 μl 啟動(dòng)反應(yīng)。酶標(biāo)儀測(cè)定波長為405 nm，溫度為37 ℃，每隔5 min 測(cè)定吸光值1 次，檢測(cè)總時(shí)長為20 min。

2.3 半數(shù)抑制濃度計(jì)算 以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制反應(yīng)曲線并計(jì)算其斜率。通過比較斜率計(jì)算出每個(gè)提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率，將各提取物在不同濃度下對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率輸入SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)算出半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.4 色譜方法 色譜柱：Acquity UPLC HSS T3（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：乙腈-水（含0.1%甲酸）為1∶1；流速：0.3 ml/min；進(jìn)樣量：3 μl；梯度洗脫程序：0～5 min，5%乙腈；6～30 min，乙腈濃度由5%升至100%。

2.5 質(zhì)譜方法 采用ESI 離子源的，正離子靈敏度模式，離子源溫度為100 ℃，脫溶劑溫度為450 ℃，毛細(xì)管電壓為3.0 kV，椎孔電壓為40 V，脫溶劑氣流為650 L/h，椎孔氣流為50 L/h，質(zhì)譜信號(hào)采集模式為連續(xù)MSEContinuum 模式，低能級(jí)碰撞能量為6 V，高能級(jí)碰撞能量為20～40 V，質(zhì)量校正及采集范圍50～2 000 Da，質(zhì)譜信號(hào)通過MasslynxTMV 4.1軟件采集。

2.6 已知化合物標(biāo)準(zhǔn)庫的建立 查閱國內(nèi)外歷年文獻(xiàn)［15-20］，收集整理已報(bào)道的黧豆屬植物所含化合物共84 個(gè)。在Chemspider、Chemicalbook 以及NAPSS 數(shù)據(jù)庫上下載這些化合物的mol 文件，合并成貓豆標(biāo)準(zhǔn)化合物庫，用于化學(xué)成分比對(duì)分析。

2.7 質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理方法 將采集到的質(zhì)譜信號(hào)原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入分析軟件Progenesis QI，使用內(nèi)標(biāo)物亮氨酸腦啡肽進(jìn)行質(zhì)量校正，然后再對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰對(duì)齊、歸一化和峰提取等預(yù)處理。根據(jù)糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果將IC50值小于100 μg/ml 的提取部位歸為低IC50組，其余歸為高IC50組，導(dǎo)入Ezinfo（3.0）軟件進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）。用下列條件對(duì)識(shí)別出的化合物離子碎片進(jìn)行篩選：同一碎片在低IC50組的信號(hào)豐度與在高IC50組的信號(hào)豐度相比＞1.2，方差分析（ANOVA）結(jié)果P＜0.05，vip 值＞1。標(biāo)記篩選出的化合物，即對(duì)α-葡萄糖苷酶具有高抑制作用的化合物。將篩選出的化合物離子碎片信息在分析軟件Progenesis QI 與貓豆標(biāo)準(zhǔn)化合物庫中進(jìn)行比對(duì)分析。如離子碎片中母離子與標(biāo)準(zhǔn)化合物的質(zhì)量誤差小于10 ppm，二級(jí)碎片與理論碎片質(zhì)量誤差小于5 ppm，同位素相似度大于80%，則可標(biāo)記出相應(yīng)的化合物名稱。

3 結(jié) 果

3.1 貓豆提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度（IC50） 貓豆的根、莖、葉、花、豆和豆莢的不同溶劑提取部位對(duì)α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度如表1 所示，大部分提取部位對(duì)α-葡萄糖苷酶均具有抑制作用，其中根的正丁醇提取部位，葉的水提取物Ⅰ和甲醇、正丁醇、氯仿提取部位，豆莢的甲醇、正丁醇和氯仿提取部位，對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50均小于10 μg/ml，顯示出較強(qiáng)的抑制作用。

表1 貓豆不同溶劑提取部位對(duì)α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度（μg/ml）

3.2 高分辨質(zhì)譜分析結(jié)果 質(zhì)譜總離子流圖如圖1、圖2所示。貓豆各植物部位的不同溶劑提取部位的化合物存在明顯的差異。經(jīng)正交偏最小二乘法判別分析及方差分析所篩選出的碎片離子，再與貓豆標(biāo)準(zhǔn)化合物庫進(jìn)行比對(duì)，共比對(duì)出在低IC50組中高表達(dá)的13個(gè)化合物：山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷、山柰酚-3-O-鼠李半乳糖苷、7-羥基-6，4′-二甲氧基異黃酮、大豆異黃酮、花旗松素、柚皮苷查爾酮、高麗槐素、mucunone A 和2′-hydroxy-biochanin A 等9 個(gè)黃酮類化合物，以及3-hydroxy-2-methyl-2，3-dihydrobenzofuran-4-carboxylic acid、新喋呤、3-甲基吲哚、丁二酸等4 個(gè)其它化合物，結(jié)果見表2、表3。這些化合物多分布在正丁醇、甲醇及氯仿提取部位。

圖1 貓豆根、莖、葉各提取部位質(zhì)譜總離子流圖

圖2 貓豆花、豆、豆莢各提取部位質(zhì)譜總離子流圖

表2 貓豆中對(duì)α-葡萄糖苷酶呈強(qiáng)抑制作用的化合物

表3 13個(gè)化合物在貓豆各植物提取部位的分布情況

4 小 結(jié)

貓豆是廣西特色藥用植物，具有鎮(zhèn)靜安眠、降血糖等作用，異黃酮類化學(xué)成分可能是其降血糖的活性成分之一［21］。本實(shí)驗(yàn)從貓豆中篩選出對(duì)α-葡萄糖苷酶具有強(qiáng)抑制作用的13 個(gè)化學(xué)成分，其中山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷、山柰酚-3-O-鼠李半乳糖苷［22］、花旗松素［23］、高麗槐素［24］和mucunone A［21］均已被報(bào)道對(duì)α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往報(bào)道一致。

貓豆對(duì)α-葡萄糖苷酶具有抑制作用的化學(xué)成分多分布在甲醇、正丁醇和氯仿提取部位，經(jīng)質(zhì)譜分析篩選出的13 個(gè)化合物中，有9 個(gè)為黃酮類化合物，且主要分布在正丁醇提取部位，提示其活性成分多為中等極性的化合物。乙醇提取后的藥渣再經(jīng)水提取制備所得的水提取物大部分沒有顯示出活性，提示貓豆中的水溶性大分子化合物缺乏對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性，在后續(xù)的研究中應(yīng)主要圍繞小分子化合物開展實(shí)驗(yàn)。從植物部位來看，有較強(qiáng)抑制活性的提取物主要分布在葉與豆莢，因此貓豆的葉與豆莢有望被開發(fā)成為新的藥用資源。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了貓豆對(duì)α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，并從貓豆中篩選出對(duì)糖苷酶具有強(qiáng)抑制作用的13個(gè)化學(xué)成分，可作為進(jìn)一步研究貓豆降血糖作用的目標(biāo)化合物。