潘翠柳，莫文坤，潘真真，梁臣艷，唐云麗

(廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530200）

紅魚眼是大戟科植物無毛龍眼睛Phyllanthus reticulatusPoir.var.glaber Muell.-Age.或龍眼睛Phyllanthus reticulatusPoir.的干燥莖及葉［1］，其味微澀，性平。紅魚眼是廣西壯族民間草藥，具有祛風、散瘀、消腫的功效，主要用于治療風濕性關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、骨性關節(jié)炎，同時還可用于輔助治療急性肝炎、痢疾等［2-5］。目前已有關于紅魚眼抗炎作用的研究報道［6-8］，但其作用機制尚未明確。因此，本實驗擬采用血清藥理學方法觀察紅魚眼不同極性提取部位含藥血清對脂多糖（LPS）誘導RAW264.7細胞炎癥的影響，從而對紅魚眼的抗炎作用進行初步的探索。

1 實驗材料

1.1 動物 SPF級昆明種（KM）小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證編號：SCXK（湘）2019-0004。實驗經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學倫理委員會審查批準，批準號：DW20200315-43。小鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，符合SPF級要求，溫度20～24 ℃，相對濕度50%～70%，12 h/12 h明暗交替，自由飲水、攝食。

1.2 細胞株 小鼠巨噬細胞株RAW264.7，由廣西中醫(yī)藥大學科學實驗中心提供。

1.3 藥物與試劑 紅魚眼采集于廣西南寧市青秀區(qū)，由廣西中醫(yī)藥大學陸海琳高級實驗師鑒定為大戟科葉下珠屬植物無毛龍眼睛Phyllanthus reticulatusPoir.var.glaber Muell.-Age.或龍眼睛Phyllanthus reticulatusPoir.的地上部分。地塞米松（北京索萊寶科技有限公司，批號：20260511）；噻唑藍（MTT，北京索萊寶科技有限公司，批號：917Q051）；脂多糖（LPS，北京索萊寶科技有限公司，批號：820F033）；二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma-Aldrich公司，批號：1121E0313）；胎牛血清（FBS，北京索萊寶科技有限公司，批號：21070703）；RPMI-1640 不完全細胞培養(yǎng)液（江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：20220106）；青霉素-鏈霉素混合物（北京索萊寶科技有限公司，批號：20180927）；0.25 g/L含乙二胺四乙酸（EDTA）胰蛋白酶（江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：20210927）；一氧化氮（NO）、白介素1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒均購于北京康普同創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司；其他試劑均為分析純。

1.4 儀器 EPOCH BIOTEK 型酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；BC-J160S型二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司）；Fresco 21 型高速冷凍離心機［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；Sorvall-ST-16R型超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9203A 型熱恒溫鼓風干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司）；CKX41 型倒置生物顯微鏡［奧林巴斯（中國）有限公司］；SW-CJ-1FD 型單人單面垂直凈化工作臺（上海蘇競實業(yè)有限公司）。

2 實驗方法

2.1 紅魚眼不同極性提取物的制備 取紅魚眼藥材適量，置于熱恒溫鼓風干燥箱中60 ℃烘干，烘干后將紅魚眼粉碎成粗粉。稱取紅魚眼粗粉1.5 kg，用80%乙醇回流提取3 次，依次保持微沸狀態(tài)2 h、1.5 h、1 h，過濾，合并濾液，用減壓濃縮法將其制成干膏，稱重，得到80%乙醇總浸膏604.4 g，留取220 g 浸膏備用，余下的384.4 g 浸膏用水完全溶解后，依次用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇等溶劑進行萃取，減壓回收溶劑，得到各部位浸膏，并于5～10 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 紅魚眼不同極性部位提取物含藥血清的制備 取小鼠42 只，雌雄各半，隨機分為7 組：空白對照組、地塞米松組、80%乙醇提取物組、石油醚提取物組、乙酸乙酯提取物組、水飽和正丁醇提取物組、水提取物組，每組6 只。空白對照組灌胃給予生理鹽水，地塞米松組灌胃給予地塞米松（劑量為6 mg/kg），其余組灌胃給予紅魚眼不同極性部位提取物（劑量均相當于生藥量30 g/kg），各組灌胃容積均為20 ml/kg，連續(xù)給藥7 d，1次/天。末次給藥1 h后，眼球取血，靜置，以3 000 r/min離心10 min，取血清，過濾除菌，分裝，于-20 ℃下保存，備用。

2.3 細胞培養(yǎng)及傳代 取RAW264.7 細胞加入到含10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素混合液的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在含5%CO2、37 ℃條件下的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液1 次，待細胞生長至80%以上，用0.25 g/L 含EDTA 胰蛋白酶進行消化后，進行1次細胞傳代。使用對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

2.4 細胞活力的測定 采用CCK-8 法進行測定。取對數(shù)生長期的細胞，按細胞濃度為1×106個/ml 分別接種于4 塊96 孔板中，于外圈加入200 μl PBS 緩沖液，置于5%CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h?？瞻讓φ战M加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基100 μl；地塞米松組加入含10%地塞米松血清的培養(yǎng)基100 μl；紅魚眼不同極性部位提取物組分別加入含10%紅魚眼不同極性部位提取物含藥血清的培養(yǎng)基100 μl；空白組無細胞，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基100 μl；每組設置6個復孔。置于含5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h 后，棄細胞上清液，每孔加入100 μl終質(zhì)量濃度為1 mg/ml的MTT溶液［9］，移置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，吸棄細胞的上清液后，每孔加入200 μl DMSO溶液，充分振搖10 min至板底無紫色結晶后，用酶標儀于490 nm 處分別測定其吸光度（OD）值，計算出RAW264.7細胞的存活率。細胞存活率（%）=（給藥組平均OD 值-空白組平均OD 值）/（空白對照組平均OD值-空白組平均OD值）×100%。

2.5 細胞增殖的測定 采用MTT 比色法檢測。取生長狀態(tài)良好的RAW264.7 細胞進行消化，制成細胞混懸液，濃度為1×106個/ml，分別接種于4 塊96 孔板中，外圈加入200 μl PBS 緩沖液，置于5% CO2、37 ℃條件下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實驗分為8 組：空白對照組、LPS模型組、地塞米松組、80%乙醇提取物組、石油醚提取物組、乙酸乙酯提取物組、水飽和正丁醇提取物組、水提取物組。空白對照組加入完全培養(yǎng)液100 μl；LPS模型組加入含0.1 μg/ml的LPS培養(yǎng)基100 μl；地塞米松組加入10%地塞米松含藥血清90μl和0.1 μg/ml LPS 10 μl 的培養(yǎng)基，共100 μl；紅魚眼不同極性部位提取物組分別將10%紅魚眼不同極性部位提取物含藥血清90 μl 先預處理2 h，再分別加入0.1 μg/ml LPS 10 μl共100 μl孵育［10］；每組設置6個復孔。各組在相同條件下分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h 后，棄細胞上清液，并向每孔加入終質(zhì)量濃度為1 mg/ml 的MTT 溶液100 μl，再置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入約200 μl 的DMSO 溶液，充分搖勻，于490 nm 處測OD值，并計算RAW264.7細胞的存活率。

2.6 細胞中IL-1β、IL-6、NO、TNF-α的含量測定 取對數(shù)生長期的RAW264.7 細胞，在96 孔細胞培養(yǎng)板中加入100 μl 濃度為1×106個/ml 的細胞懸液，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實驗分組同“2.5 項”，每組設置6個復孔，各組給藥后在5%CO2、37 ℃的條件下培養(yǎng)12 h，取上清液，以3 000 r/min離心10 min，備用。取處理好的上清液按照ELISA 試劑盒的說明書操作，分別測定NO、IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

2.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 紅魚眼不同極性部位提取物含藥血清對RAW264.7細胞活力的影響 見表1。結果顯示，用紅魚眼不同極性部位提取物含藥血清對RAW264.7細胞進行干預后，隨著培養(yǎng)時間的延長，各組細胞的存活率逐漸降低。尤其是藥物干預24 h 后，80%乙醇提取物含藥血清、乙酸乙酯提取物含藥血清、水飽和正丁醇提取物含藥血清、水提取物含藥血清和地塞米松含藥血清中RAW264.7 細胞的存活率顯著下降（P＜0.05 或P＜0.01），說明紅魚眼不同極性部位提取物含藥血清在24 h后有明顯的細胞毒性，而在6～12 h培養(yǎng)時間范圍內(nèi)，除紅魚眼水提取物含藥血清外，其余不同極性部位提取物含藥血清對RAW264.7細胞活力均無明顯影響。

表1 紅魚眼不同極性部位提取物含藥血清對RAW264.7細胞活力的影響（）

表1 紅魚眼不同極性部位提取物含藥血清對RAW264.7細胞活力的影響（）

注：與空白對照組比較，①P＜0.05，②P＜0.01

組 別空白對照組地塞米松組80%乙醇提取物組乙酸乙酯提取物組石油醚提取物組水飽和正丁醇提取物組水提取物組存活率（%）—66.49 93.76 89.97 92.12 78.96 76.20 n6 6 6 6 6 6 6 6 h OD 0.38±0.15 0.42±0.07 0.53±0.18 0.57±0.18 0.42±0.08 0.47±0.12 0.48±0.10存活率（%）—110.76 141.42 150.60 110.98 125.63 126.51 12 h OD 0.67±0.29 0.52±0.06①0.69±0.13 0.85±0.23 0.63±0.18 0.59±0.06 0.55±0.16①存活率（%）—78.08 103.58 126.88 94.29 88.99 83.26 24 h OD 0.67±0.04 0.56±0.02②0.62±0.03①0.62±0.03①0.66±0.03 0.57±0.05②0.50±0.03②存活率（%）—83.98 91.45 91.45 98.34 85.15 74.79 48 h OD 0.57±0.07 0.38±0.09②0.53±0.12 0.51±0.06 0.52±0.08 0.45±0.07①0.43±0.10①

3.2 紅魚眼不同極性部位提取物含藥血清對LPS 誘導RAW264.7 細胞增殖的影響 見表2。結果顯示，與空白對照組比較，LPS 模型組各培養(yǎng)時間段的OD值明顯降低（P＜0.01），表明LPS 對RAW264.7 細胞具有一定的抑制作用。與LPS 模型組比較，紅魚眼不同極性部位提取物組和地塞米松組各培養(yǎng)時間段的OD值和細胞存活率明顯提高（P＜0.01），表明紅魚眼不同極性部位提取物含藥血清對LPS 誘導的RAW264.7 細胞具有顯著的保護作用。

表2 紅魚眼不同極性部位提取物含藥血清對LPS誘導RAW264.7細胞增殖的影響（）

注：與空白對照組比較，①P＜0.01；與LPS模型組比較，②P＜0.01

組 別空白對照組LPS模型組地塞米松組80%乙醇提取物組乙酸乙酯提取物組石油醚提取物組水飽和正丁醇提取物組水提取物組存活率（%）—17.88 105.95 31.17 121.40 123.01 153.26 129.65 n6 6 6 6 6 6 6 6 6 h OD 1.38±0.33 0.33±0.06①1.67±0.32②1.37±0.25②1.35±0.29②1.74±0.29②1.62±0.22②1.91±0.27②存活率（%）—24.42 121.52 99.14 97.96 126.00 117.53 138.69 12 h OD 1.64±0.54 0.34±0.04①1.58±0.27②1.66±0.29②1.50±0.30②1.73±0.17②1.88±0.23②1.54±0.23②存活率（%）—20.42 96.15 101.02 91.28 105.07 114.30 93.71 24 h OD 0.65±0.03 0.21±0.10①0.68±0.08②0.59±0.09②0.64±0.06②0.73±0.07②0.71±0.03②0.70±0.03②存活率（%）—31.76 105.10 91.78 99.46 113.09 110.46 108.89 48 h OD 0.41±0.19 0.07±0.01①0.44±0.09②0.13±0.01②0.50±0.16②0.51±0.13②0.64±0.10②0.54±0.09②

3.3 紅魚眼不同極性部位提取物含藥血清對NO、IL-1β、IL-6、TNF-α 含量的影響 見表3。結果顯示，與空白對照組比較，LPS模型組RAW264.7細胞上清液的NO、IL-1β、IL-6、TNF-α 含量均顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01）。與LPS模型組比較，紅魚眼乙酸乙酯提取物組、石油醚提取物組、水提取物組和地塞米松組的NO、IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著降低（P＜0.01）；80%乙醇提取物組的IL-6、IL-1β含量均顯著降低（P＜0.01），NO含量明顯升高（P＜0.05），而對TNF-α含量無顯著影響；水飽和正丁醇提取物組的IL-1β、NO、TNF-α 含量顯著下降（P＜0.01），而對IL-6含量無顯著影響。

表3 紅魚眼不同極性部位提取物含藥血清對NO、IL-1β、IL-6、TNF-α含量的影響（）

表3 紅魚眼不同極性部位提取物含藥血清對NO、IL-1β、IL-6、TNF-α含量的影響（）

注：與空白對照組比較，①P＜0.01，②P＜0.05；與LPS模型組比較，③P＜0.01，④P＜0.05

組 別空白對照組LPS模型組地塞米松組80%乙醇提取物組乙酸乙酯提取物組石油醚提取物組水飽和正丁醇提取物組水提取物組TNF-α（pg/ml）256.02±11.19 289.51±5.63①229.56±9.70③287.89±13.85 252.93±6.54③274.88±8.58③258.46±9.45③214.23±3.16③n6 6 6 6 6 6 6 6 NO（μmol/L）120.26±6.29 138.88±6.75①122.93±5.95③148.90±6.59④100.86±9.24③86.10±5.98③124.75±5.99③111.14±7.93③IL-1β（pg/ml）470.62±17.98 490.52±6.25②328.61±8.40③219.15±15.34③306.64±14.87③469.83±10.62③408.54±11.37③425.83±10.81③IL-6（pg/ml）174.06±3.56 190.71±4.32①162.36±4.95③120.48±6.69③145.97±4.75③167.40±4.96③190.40±3.28 104.88±4.81③

4 討 論

LPS 是腸內(nèi)毒素的一類主要代謝成分，可誘導細胞釋放大量細胞因子，從而加重炎癥反應，常用于建立各種炎癥模型［11］。巨噬細胞作為參加炎癥反應的中心細胞，具有一定的吞噬、分泌和呈遞抗原等作用，是炎癥細胞因子的主要來源，其中NO、TNF-α、IL-6是巨噬細胞產(chǎn)生的重要炎癥介質(zhì)［12］。NO具有增強細胞毒性的作用［13］。TNF-α為促炎細胞因子，能促使關節(jié)滑膜細胞增殖，誘導滑膜細胞產(chǎn)生炎癥因子。IL-6含量增加時，可引發(fā)急性期應答誘導、滑膜成纖維細胞增殖等作用。IL-1β大量產(chǎn)生時能引起發(fā)熱和惡病質(zhì)。

研究發(fā)現(xiàn)，紅魚眼醇提物能降低小鼠耳廓腫脹度，且能降低滲出液中前列腺素E2（PGE2）的含量，說明紅魚眼具有一定的抗炎作用［7-8］。目前，常用LPS建立巨噬細胞炎癥模型，當巨噬細胞被激活后，其釋放炎癥介質(zhì)會增加［14-19］。本文通過體外分離手段建立由LPS 抗原誘導出的巨噬細胞RAW264.7 細胞增殖過程的免疫炎癥模型，探討紅魚眼不同極性部位提取物含藥血清對LPS 誘導RAW264.7 細胞炎癥因子分泌的影響。研究中采用MTT 比色法測定紅魚眼不同極性部位提取物含藥血清對RAW264.7 細胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)在6～12 h 培養(yǎng)時間內(nèi)，除紅魚眼水提取物含藥血清外，其余極性部位提取物含藥血清對RAW264.7 細胞活力均無明顯影響，而在24 h 后細胞存活率明顯降低，因此選擇在6～12 h 內(nèi)觀察紅魚眼不同極性部位提取物含藥血清的抗炎效果。實驗結果顯示，與LPS 模型組比較，紅魚眼不同極性部位含藥血清對RAW264.7細胞增殖有促進作用。紅魚眼乙酸乙酯提取物、石油醚提取物、水提取物的含藥血清均能顯著抑制NO、IL-1β、IL-6、TNF-α 的分泌，80%乙醇提取物的含藥血清能顯著抑制IL-6、IL-1β 的分泌，水飽和正丁醇提取物含藥血清能顯著抑制IL-1β、NO、TNF-α 的分泌，表明紅魚眼不同極性部位提取物含藥血清具有一定的抗炎作用，其作用可能是通過抑制炎癥反應中NO、IL-1β、IL-6、TNF-α 的釋放來實現(xiàn)。