◇天津市環(huán)鑒環(huán)境檢測有限公司 宋靜靜

天津市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心 鞏元帥

在水質(zhì)監(jiān)測中，發(fā)光細(xì)菌法測定生物毒性，操作簡單、反應(yīng)快速，該方法廣泛應(yīng)用于毒性檢測。本文分析了鹽度、溫度、pH、溶解氧、反應(yīng)體系、菌液狀態(tài)、表征方式及擬合模型等因素對發(fā)光細(xì)菌法測定生物毒性的影響，以期為發(fā)光細(xì)菌法測定水質(zhì)生物毒性提供參考。

在我國水環(huán)境保護(hù)工作中，評價(jià)江、河、湖泊等各類水體水環(huán)境健康程度，主要依靠常規(guī)理化監(jiān)測分析方法，雖然通過理化監(jiān)測在主要污染物濃度評價(jià)及總量控制方面取得了顯著成效，水質(zhì)得到了明顯改善，但在以生物監(jiān)測為主的水生態(tài)環(huán)境健康方面，國內(nèi)尚未在水生態(tài)環(huán)境保護(hù)工作中深入開展這項(xiàng)工作。目前，在環(huán)境健康監(jiān)測中采用的生物監(jiān)測技術(shù)主要包括人體內(nèi)暴露監(jiān)測、遺傳毒性監(jiān)測及生物毒性監(jiān)測，其中，生物毒性監(jiān)測技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各國家環(huán)境污染評價(jià)中[1]。

生物毒性監(jiān)測是基于生態(tài)毒理學(xué)研究有毒有害物質(zhì)對微生物、植物、動(dòng)物等損害情況的監(jiān)測方法，可以實(shí)現(xiàn)分子、細(xì)胞、個(gè)體等不同水平的毒性檢測[2]。根據(jù)不同生物檢測原理，水環(huán)境安全監(jiān)測中常用的毒性檢測方法有魚法、水蚤法、藻法、發(fā)光細(xì)菌法以及微生物燃料電池法等[3]。在微生物毒性檢測中，發(fā)光細(xì)菌法應(yīng)用最為廣泛，且國內(nèi)現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范GB/T 15441也選用此方法。因此，為更好地利用發(fā)光細(xì)菌法測試生物毒性，本文總結(jié)分析了發(fā)光細(xì)菌法的主要影響因素，以期為水質(zhì)生物毒性監(jiān)測提供參考。

1 環(huán)境因素

1.1 鹽度

發(fā)光細(xì)菌在生長過程中，所處環(huán)境需要保持一定的鹽度，超過或低于臨界值，則會(huì)影響細(xì)菌生長代謝，抑制細(xì)菌活性。對于青海弧菌等淡水發(fā)光菌，在檢測水質(zhì)毒性時(shí)，水樣采集后可直接測定，不需要調(diào)整溶液鹽度；費(fèi)氏弧菌等海洋發(fā)光菌，則需要在測定條件下加入一定量的鹽分。羅巔輝等[4]在海洋費(fèi)氏弧菌培養(yǎng)條件的研究中，對費(fèi)氏弧菌生長的鹽度進(jìn)行了探索，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鹽度在1%-5%期間菌株生長較好；余露軍等[5]在費(fèi)氏弧菌急性毒性微孔板檢測方法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，鹽度控制在1.5%-3.5%最適宜費(fèi)氏弧菌生長，活性較高。

1.2 溫度

發(fā)光強(qiáng)度與發(fā)光細(xì)菌活性的影響，主要是由于細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、核酸及蛋白質(zhì)等物質(zhì)的活性隨溫度變化而改變，低溫活性降低，高溫則會(huì)發(fā)生變性、凝固，導(dǎo)致活性消失。趙洋甬等[6]研究了活化溫度對費(fèi)氏弧菌發(fā)光的影響，結(jié)果表明環(huán)境溫度需控制在10℃-25℃之間。此外，同一溫度條件下，培養(yǎng)時(shí)間不同，細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度也不相同。陳水松等[7]在3%NaCl條件下測試了20℃、25℃、30℃三個(gè)溫度梯度下細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度，在25℃條件下費(fèi)氏弧菌培養(yǎng)15-22h發(fā)光度高且穩(wěn)定。

1.3 pH

在毒性測試時(shí)，主要在于改變細(xì)胞膜電荷和營養(yǎng)物的離子化程度，進(jìn)而改變細(xì)胞的活性。研究表明，當(dāng)水樣pH控制在6-9之間時(shí)，即pH不超標(biāo)的情況下，發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度基本不受pH的影響，無需調(diào)節(jié)水樣pH值。當(dāng)研究特定物質(zhì)毒性時(shí)，在不同pH條件下其分子電離形態(tài)不同，毒性隨著pH的變化而變化，須根據(jù)監(jiān)測需要，調(diào)節(jié)水樣pH值。銅、鉛等重金屬隨著pH的升高而增大[7]，苯酚類化合物毒性隨著pH的升高而減小[8]。

1.4 溶解氧

發(fā)光細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)生命代謝所引起的各種生物化學(xué)反應(yīng)伴隨著物質(zhì)的氧化及還原，因此水體中須保持一定的含氧量。費(fèi)氏弧菌等發(fā)光細(xì)菌作為好氧菌，須要有氧分子的參與[9]。在毒性測試過程中，溶解氧濃度需要大于3.0mg/L[10]。為減小溶解氧對發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的影響，可通過攪拌等方式來增加溶解氧含量。

2 樣品處理方式

2.1 反應(yīng)體系

在利用發(fā)光細(xì)菌測試樣品生物毒性前，需要確定實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系即菌液與樣品反應(yīng)比例，以保證每次監(jiān)測結(jié)果的可比性。國內(nèi)大多按照菌液與溶液總體積1:10反應(yīng)體系[11-12]進(jìn)行測試，也有學(xué)者對不同比例反應(yīng)體系進(jìn)行了比較。余露軍等[5]在研究在微孔板發(fā)光測定中比較了硫酸鋅對1:1、1:5、1:10等不同反應(yīng)體系半數(shù)抑制濃度EC50的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，反應(yīng)體系1:10時(shí)費(fèi)氏弧菌毒性效應(yīng)最強(qiáng)，且測試結(jié)果變異系數(shù)相對較小，此外由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，反應(yīng)體系比值越大，測得的EC50濃度越高。

2.2 菌液狀態(tài)

發(fā)光細(xì)菌測試水樣時(shí)，無論是利用凍干粉還是新鮮培養(yǎng)液制備菌懸液，在加入樣品測試前，需要保持良好的菌液活性，以提高生物毒性測試的靈敏度和準(zhǔn)確度。目前，用于測量菌液活性的檢測方法主要有發(fā)光強(qiáng)度檢測法和吸光度法。對于菌液發(fā)光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測量時(shí)變化范圍在20%-80%之間，則認(rèn)定菌液活性好，測定結(jié)果有效[10]。吸光度法則是通過測定光密度值，指示菌體細(xì)胞密度來反映菌種活性。王娜等[13]以600nm處紫外吸收光度值（OD600）表征菌密度，分別測定了不同化學(xué)物質(zhì)的急性生物毒性，結(jié)果表明菌懸液OD600控制在2.0左右時(shí)，檢測靈敏度最高。

3 結(jié)果處理

3.1 結(jié)果測定

有毒物質(zhì)對發(fā)光細(xì)菌的毒性效應(yīng)主要體現(xiàn)在對細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的抑制，雖然在實(shí)驗(yàn)中使用的發(fā)光細(xì)菌菌液是混勻的懸濁液，但隨著時(shí)間推移，受環(huán)境因素及發(fā)光菌自身代謝影響，菌液的發(fā)光變化情況也不完全一致，測定發(fā)光強(qiáng)度時(shí)易引起誤差，因此提高細(xì)菌發(fā)光測定準(zhǔn)確度尤為重要。馬勇等[11]在發(fā)光強(qiáng)度測定過程中，利用發(fā)光菌空白發(fā)光強(qiáng)度與原始發(fā)光強(qiáng)度的比值來校正測定結(jié)果，并與傳統(tǒng)方法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明在計(jì)算當(dāng)量苯酚濃度時(shí)線性相關(guān)系數(shù)優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

3.2 表征方式

在發(fā)光細(xì)菌生物毒性測試中，基于發(fā)光強(qiáng)度測試結(jié)果的毒性表征方式主要有EC50、最低無效應(yīng)稀釋度、當(dāng)量氯化汞或苯酚濃度、發(fā)光抑制率等。前兩種表征方式歐美國家應(yīng)用較多，強(qiáng)調(diào)無毒或低毒效應(yīng)，國內(nèi)則主要采用當(dāng)量氯化汞或苯酚濃度、發(fā)光抑制率等，用于反映污染物風(fēng)險(xiǎn)[14]。孫成華等[15]在污染源監(jiān)測中對不同表征方式進(jìn)行了探討比較，結(jié)果表明對于發(fā)光抑制率小于60%且無法求出EC50的水樣，采用當(dāng)量毒性參照物濃度表征，對大于60%的水樣，采用最低無效應(yīng)稀釋度表征更直觀可靠。

4 結(jié)束語

在生物毒性監(jiān)測中，發(fā)光細(xì)菌法與其他生物監(jiān)測方法相比，具有快速、簡單、靈敏的特點(diǎn)，但發(fā)光細(xì)菌作為微生物，在測定過程中容易受到擾動(dòng)，從而影響測定結(jié)果，因此在以后的應(yīng)用中，還需做好以下幾方面工作：①在菌液培養(yǎng)中，優(yōu)先選擇品質(zhì)好的菌種，減小菌液本身產(chǎn)生的誤差；②根據(jù)菌液活性劑存儲(chǔ)時(shí)間，在監(jiān)測過程中發(fā)現(xiàn)菌液活性不滿足要求時(shí)，及時(shí)進(jìn)行更換；③在數(shù)據(jù)擬合模型應(yīng)用中，研究非線性模型數(shù)據(jù)擬合方法，提高監(jiān)測結(jié)果準(zhǔn)確性。

隨著“十四五”期間水生態(tài)評價(jià)及生物多樣性評價(jià)的日益關(guān)注，生物監(jiān)測已成為水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測的發(fā)展方向，生物毒性監(jiān)測作為生物監(jiān)測的一種，在評價(jià)水體水質(zhì)安全中得到了廣泛應(yīng)用。利用生物毒性監(jiān)測數(shù)據(jù)，結(jié)合其他水質(zhì)及生物監(jiān)測指標(biāo)，建立水生態(tài)評價(jià)體系開展評價(jià)將是水生態(tài)環(huán)境管理發(fā)展的重點(diǎn)方向。