朱正望， 朱平生， 苗明三

河南中醫(yī)藥大學(xué) a. 第一臨床醫(yī)學(xué)院， b. 藥學(xué)院， 鄭州 450046

膽汁淤積性肝?。╟holestasis liver disease，CLD）是指各種原因引起的肝內(nèi)外膽汁生成、分泌、排泄障礙為主要特征的一系列肝膽系統(tǒng)疾?。?-2］。早期可無(wú)不適或非特異性癥狀，若不及時(shí)干預(yù)，病情進(jìn)展迅速，嚴(yán)重者有肝硬化、肝衰竭甚至死亡的風(fēng)險(xiǎn)［3-4］。近年來(lái)慢性肝病患者膽汁淤積發(fā)生率有明顯上升趨勢(shì)［5］。由于CLD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前對(duì)該病的認(rèn)識(shí)尚不夠完善，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型在疾病的基礎(chǔ)研究中有著十分重要的價(jià)值，建立與臨床CLD 發(fā)病及病理生理過(guò)程相似的動(dòng)物模型對(duì)于更好地研究其發(fā)生發(fā)展機(jī)制、治療方法等具有重要意義。本研究結(jié)合CLD現(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)與中醫(yī)證候特點(diǎn)，對(duì)目前常用的CLD 動(dòng)物模型的造模方法、作用機(jī)制、模型特點(diǎn)與臨床吻合度進(jìn)行分析，以期為CLD動(dòng)物模型的進(jìn)一步研究及評(píng)價(jià)提供參考。

1 CLD病因病機(jī)

1.1 病因與發(fā)病機(jī)制 CLD 被認(rèn)為是由于肝內(nèi)外各種原因造成膽汁形成、分泌和排泄障礙，膽汁不能正常流入十二指腸而在肝臟中蓄積并進(jìn)入血液的病理狀態(tài)［6］。引起CLD 的常見(jiàn)病因有遺傳因素、病毒、細(xì)菌、自身免疫、藥物、毒物、酒精、寄生蟲(chóng)感染、結(jié)石、腫瘤等［7-8］，其發(fā)生機(jī)制與膽汁酸穩(wěn)態(tài)失衡、線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等密切相關(guān)，多種因素誘導(dǎo)膽汁分泌、排泄障礙，膽汁酸正常代謝失衡，引起肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞損傷［9-10］。

1.2 中醫(yī)病因病機(jī) CLD 可歸屬為中醫(yī)學(xué)“黃疸”范疇，病因不外乎外感、內(nèi)傷兩個(gè)方面，外感多屬濕熱疫毒所致，內(nèi)傷則常與飲食、勞倦、病后有關(guān)，其病位主要在肝、膽、脾、胃，病理因素有濕邪、熱邪、寒邪、疫毒、氣滯、血瘀等［11-12］。病機(jī)總的來(lái)說(shuō)是濕邪為患，濕邪困遏脾胃，壅塞肝膽，疏泄失常，膽汁外溢，發(fā)為黃疸，繼而形成了中醫(yī)“祛濕利小便”的黃疸治療大法。

2 CLD診斷標(biāo)準(zhǔn)

2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)《膽汁淤積性肝病管理指南（2021）》《膽汁淤積性肝病診斷和治療共識(shí)（2015）》［13-14］，CLD診斷標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。參考動(dòng)物模型評(píng)價(jià)新方法［15］對(duì)其進(jìn)行賦值：因患者早期可無(wú)不適或非特異癥狀，故臨床表現(xiàn)各賦值10%；目前有關(guān)CLD的診斷標(biāo)準(zhǔn)和具體指標(biāo)尚未統(tǒng)一，故實(shí)驗(yàn)室檢查賦值10%；影像學(xué)檢查是區(qū)分肝內(nèi)和肝外膽汁淤積的主要臨床手段，故各賦值25%；經(jīng)上述檢查仍不能明確診斷時(shí)需要行肝活檢以明確診斷，故賦值20%。

表1 CLD診斷標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Diagnostic criteria for cholestatic liver disease

2.2 中醫(yī)學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》《中醫(yī)內(nèi)科病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》（ZY/T001.1-94）［16-17］，黃疸證型分類(lèi)見(jiàn)表2。將各證型主次癥進(jìn)行歸納分類(lèi)對(duì)動(dòng)物模型中醫(yī)吻合度進(jìn)行判斷，主癥：（1）身目俱黃，黃色鮮明；（2）身目俱黃，黃色晦暗；符合一項(xiàng)賦值20%。次癥：（1）發(fā)熱口渴，小便短少黃赤；（2）頭重身困，胸脘痞滿；（3）上腹、右脅脹悶疼痛，牽引肩背；（4）脘腹痞脹，神疲畏寒；（5）肢軟乏力，大便溏??；符合一項(xiàng)賦值12%。

表2 膽汁淤積性肝病中醫(yī)辨證分型Table 2 Traditional Chinese medicine syndrome differentiation of cholestatic liver disease

3 CLD動(dòng)物模型分析

3.1 模型動(dòng)物的選擇 目前比較成熟的CLD 動(dòng)物模型常以各種系的大、小鼠作為造模對(duì)象，以SD和Wistar大鼠較為多見(jiàn)。由于鼠類(lèi)基因與人類(lèi)序列相似，并且生存力強(qiáng)、價(jià)格低廉、實(shí)驗(yàn)操作方便，是復(fù)制CLD 模型的理想動(dòng)物。而大鼠的膽總管較粗，便于尋找及結(jié)扎，同時(shí)大鼠耐受能力較好、存活率高，在肝內(nèi)、外膽汁淤積模型中均較為常用。

3.2 造模方法與臨床吻合度 CLD 動(dòng)物模型主要分為肝外和肝內(nèi)兩大類(lèi)：肝外主要是通過(guò)不同的膽總管結(jié)扎手術(shù)；肝內(nèi)有α-萘異硫氰酸酯（ANIT）、雌激素、利福平、3，5-二乙氧基羰基-1，4-二氫-2，4，6-三甲基吡啶（DDC）、脂多糖（LPS）、石膽酸（LCA）、氯丙嗪（CPZ）、全腸外營(yíng)養(yǎng)（TPN）等方法，其中以ANIT 誘導(dǎo)最為常用。常見(jiàn)CLD 動(dòng)物模型造模方法及其與中西醫(yī)病證特點(diǎn)吻合度見(jiàn)表3。

表3 CLD動(dòng)物模型評(píng)價(jià)Table 3 Animal model evaluation of cholestatic liver disease

3.3 模型評(píng)價(jià)檢測(cè)指標(biāo) CLD 的模型檢測(cè)指標(biāo)包含以下內(nèi)容。（1）一般情況：動(dòng)物精神、活動(dòng)狀態(tài)、毛發(fā)狀況、皮膚爪甲顏色、二便顏色及性狀等；（2）生化指標(biāo)：肝功能如ALP、GGT、ALT、AST、TBA、TBil 等；（3）病理指標(biāo)：病理學(xué)觀察肝組織結(jié)構(gòu)及肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞病變情況；（4）分子生物學(xué)：PCR、Western Blot 等方法檢測(cè)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如膽鹽輸出泵、Na+-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)體、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽、多藥耐藥相關(guān)蛋白2 等表達(dá)情況。以上檢測(cè)指標(biāo)可為CLD 的模型評(píng)價(jià)、病理機(jī)制、藥物篩選及作用機(jī)理研究提供依據(jù)，從而更加確切地評(píng)價(jià)模型、藥效并探討其發(fā)病機(jī)制。

4 小結(jié)與展望

CLD 具體發(fā)生機(jī)制目前尚不完全清楚，且治療方法有限，因此有必要建立與人類(lèi)疾病本質(zhì)相似的動(dòng)物模型，深入研究其發(fā)生發(fā)展機(jī)制，探索新的治療藥物。

膽總管結(jié)扎方法所致的膽汁淤積大鼠模型因與人類(lèi)發(fā)生肝外膽汁淤積的機(jī)制、生化指標(biāo)變化、病理形態(tài)改變、臨床癥狀具有一定的相似性，是研究肝外膽汁淤積的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，在臨床及基礎(chǔ)研究中廣泛應(yīng)用［27-28］。通過(guò)手術(shù)方法人為結(jié)扎膽總管，造成肝外膽道梗阻，膽道內(nèi)壓力增高，從而引起膽管擴(kuò)張和膽汁淤積［29］。此方法成熟穩(wěn)定、造模時(shí)間短、成功率高，是研究梗阻性原因?qū)е碌哪懼俜e發(fā)病機(jī)制及治療的理想模型，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床吻合度較高。ANIT是用于誘導(dǎo)膽汁淤積模型的一種肝毒性藥物，其誘導(dǎo)的模型所表現(xiàn)的血清生化指標(biāo)及病理改變與人膽汁淤積癥臨床病變相似度較高，是目前使用最多的肝內(nèi)膽汁淤積動(dòng)物模型［30-31］。ANIT 在體內(nèi)直接損傷膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞，使之變性、腫脹、壞死脫落堵塞膽管，誘導(dǎo)膽汁淤積［32-33］。該模型簡(jiǎn)便易操作、重復(fù)性好，能很好地模擬人肝內(nèi)膽汁淤積的病理改變，對(duì)于探討膽汁淤積的發(fā)病機(jī)制、尋找利膽退黃藥物具有重要的臨床意義［34］。相比于以上兩種模型復(fù)制方法，其余方法誘導(dǎo)的動(dòng)物模型應(yīng)用較少，且與CLD 的中西醫(yī)臨床吻合度均較低，多用于特定原因或特殊人群形成的CLD 研究［35］。如苯甲酸雌二醇聯(lián)合黃體酮注射常用于孕婦妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥相關(guān)研究，利福平灌胃用于抗結(jié)核藥引起的膽汁淤積研究，DDC 喂養(yǎng)病理表現(xiàn)與臨床原發(fā)性硬化性膽管炎類(lèi)似，TPN 適用于腸外營(yíng)養(yǎng)相關(guān)性膽汁淤積癥的研究，特異性較高，實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)?zāi)康募皞?cè)重點(diǎn)選擇合適的動(dòng)物模型［20-22，26］。

中醫(yī)藥治療CLD 作用機(jī)制的研究備受關(guān)注，然而現(xiàn)有的造模方法主要是基于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病因、病理機(jī)制建立模型，未能真正體現(xiàn)中醫(yī)“證”的特點(diǎn)，模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)亦是以現(xiàn)代醫(yī)學(xué)指標(biāo)來(lái)判斷，普遍與中醫(yī)臨床證候表現(xiàn)的吻合度不高。因此，建立符合中醫(yī)臨床證候的動(dòng)物模型，才能真實(shí)地反映中醫(yī)藥療效及作用機(jī)理。有學(xué)者［36-37］根據(jù)中醫(yī)學(xué)“方證相應(yīng)”思想，采用“以方測(cè)證”的方法進(jìn)行中醫(yī)證候動(dòng)物模型的研究。另有學(xué)者［38］在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)疾病模型的基礎(chǔ)上根據(jù)中醫(yī)理論施加多種干預(yù)因素來(lái)構(gòu)建中醫(yī)證候模型，既符合膽汁淤積的疾病特點(diǎn)及關(guān)鍵指標(biāo)變化，同時(shí)模型動(dòng)物出現(xiàn)明顯的中醫(yī)證候表現(xiàn)，符合中醫(yī)學(xué)疾病的病因病機(jī)理論?；诖耍芯繒r(shí)可在病因、癥狀、客觀指標(biāo)、治療反證等基礎(chǔ)上對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以更真實(shí)地反映疾病的中西醫(yī)臨床特點(diǎn)。

本研究根據(jù)CLD 的中西醫(yī)臨床病證特點(diǎn)，對(duì)現(xiàn)有的CLD 動(dòng)物模型的造模方法、模型特點(diǎn)與臨床吻合度進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)常用的CLD 動(dòng)物模型與中醫(yī)臨床證候表現(xiàn)吻合度較低，未來(lái)還需進(jìn)一步加強(qiáng)CLD 病證結(jié)合動(dòng)物模型的研究，建立更貼合中西醫(yī)臨床實(shí)際的動(dòng)物模型并完善其評(píng)價(jià)方法。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：朱正望負(fù)責(zé)論文撰寫(xiě)；朱平生負(fù)責(zé)指導(dǎo)論文修改并最后定稿；苗明三負(fù)責(zé)指導(dǎo)論文修改。