廖正波,湯德元,曾智勇,王 彬,黃 濤,陳閶崢,羅 柳,陳 旭,袁盛林

(貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025)

偽狂犬病(pseudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的一種高度傳染性疾病,屬皰疹病毒科,水痘帶狀病毒屬中的一種雙股線狀DNA病毒。能夠感染多種哺乳動(dòng)物,其中豬是該病毒的主要儲(chǔ)存宿主[1]。PRV感染后主要引起母豬的繁殖障礙性疾病以及仔豬的呼吸道和神經(jīng)系統(tǒng)性疾病,新生仔豬具有高發(fā)病率和病死率。育肥豬感染后常呈隱性感染,潛伏于豬的周圍神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system,PNS)中,三叉神經(jīng)節(jié)和骶神經(jīng)節(jié)為主要潛伏部位,在某些應(yīng)激源作用下會(huì)重新激活病毒,引起豬再次感染并向外排毒[2]。我國(guó)早期主要通過(guò)引進(jìn)Bartha疫苗株對(duì)PRV進(jìn)行防控,但隨著變異株出現(xiàn),該疫苗已不能提供完全保護(hù),使PRV在全國(guó)暴發(fā)蔓延[3]。此外,近年來(lái)多次報(bào)道出人類感染PRV,感染后可出現(xiàn)腦炎、眼內(nèi)炎等臨床癥狀[4]。因此,PRV感染不僅給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,還對(duì)人類健康構(gòu)成潛在威脅。

先天免疫系統(tǒng)是宿主抵抗病原體入侵的第一道防線,病原體入侵后被細(xì)胞內(nèi)外的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs)檢測(cè)識(shí)別并結(jié)合獨(dú)特的病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),隨后引發(fā)先天免疫系統(tǒng)中的多種信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子、Ⅰ型干擾素和其他抗病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá),從而消除病原體和受感染的細(xì)胞[5-6]。PRRs包括Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)、視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ樣受體(retinic acid induces gene-I-like receptors,RLRs)、NOD樣受體(NOD-like receptors,NLRs)、環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)[7-11]等。PRRs在與病原體結(jié)合后,關(guān)鍵的銜接蛋白將免疫信號(hào)通過(guò)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)逐步傳遞,最后傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi),激活免疫基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。而過(guò)度的免疫反應(yīng)則會(huì)引起細(xì)胞免疫穩(wěn)態(tài)失衡,如細(xì)胞因子風(fēng)暴的產(chǎn)生可能導(dǎo)致更為嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng),因此,級(jí)聯(lián)反應(yīng)中某些蛋白或細(xì)胞因子會(huì)通過(guò)自我限制減輕過(guò)度免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損傷,以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[12]。

目前,眾多研究表明PRV感染后能夠被PRRs檢測(cè)識(shí)別并與其結(jié)合,啟動(dòng)下游多種信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),如核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、Ⅰ型干擾素(interferon,IFN)和炎性小體信號(hào)通路,導(dǎo)致相應(yīng)的促炎或抗病毒細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生[13]。本文將對(duì)PRV感染結(jié)合PRRs后引起的信號(hào)通路變化和相關(guān)細(xì)胞因子逐一進(jìn)行闡述,為進(jìn)一步探究PRV信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗病毒機(jī)制研究提供參考。

1 Toll樣受體信號(hào)通路

1.1 Toll樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制TLRs是一類非催化性跨膜單體蛋白,是天然免疫細(xì)胞中最重要的PRRs之一,由識(shí)別病原體的富含亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeat,LRR)基序的N端胞外域、跨膜域、以及用于募集銜接蛋白細(xì)胞質(zhì)Toll/白介素-1受體(Toll/interleukin-1 receptor,TIR)同源結(jié)構(gòu)域組成[14]。目前,已鑒定出10個(gè)人類TLRs和12個(gè)小鼠TLRs,其中細(xì)胞表面TLRs(TLR1～TLR6,TLR11)主要識(shí)別微生物膜成分,而細(xì)胞內(nèi)TLRs(TLR3,TLR7～TLR9)主要識(shí)別源自細(xì)菌或病毒微生物的核酸[13]。與特定配體結(jié)合后,可導(dǎo)致受體胞質(zhì)中的TIR結(jié)構(gòu)域的協(xié)同二聚化,隨后被包含TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白(TIR domain containing adaptor protein,TIRAP)、β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR domain containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)和TRIF相關(guān)接頭分子(TRIF-related adaptor molecule,TRAM)檢測(cè)結(jié)合。TIRAP和TRAM分別進(jìn)一步募集髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)和TRIF并與下游信號(hào)分子和激酶組成超分子復(fù)合物,啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[15-16]。

根據(jù)超分子復(fù)合物組成的不同,TLRs信號(hào)通路主要可分為MyD88依賴性途徑和TRIF依賴性途徑。MyD88是TIR家族中第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員,能被除TLR3以外的其他TLRs招募并激活下游NF-κB、分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK/p38)和c-Jun氨基末端蛋白激酶/應(yīng)激激活蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase/stress-activated protein kinase,JNK/SAPK)等信號(hào)通路,誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。此外,在TLR7～TLR9受體信號(hào)中,MyD88激活的NF-κB與干擾素調(diào)節(jié)因子5/7(interferon regulatory factor,IRF)相互作用,誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子或IFN產(chǎn)生[17-19]。TLR3/TLR4則是由TRIF依賴性途徑誘導(dǎo)IFN和炎性細(xì)胞因子表達(dá),在TRIF以及銜接蛋白分子TRAM、TRAF3/6和相關(guān)激酶驅(qū)動(dòng)下,激活下游IRF3、IRF7等信號(hào)通路,使IRF3、IRF7形成同源或異源二聚體,隨后移至細(xì)胞核內(nèi)并驅(qū)動(dòng)Ⅰ型IFN基因和IFN刺激基因(IFN stimulates genes,ISG)的表達(dá),產(chǎn)生干擾素以抵抗病毒感染[20-22]。

1.2 PRV感染后對(duì)TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響研究發(fā)現(xiàn),PRV感染后可激活MAPK/p38和JNK/SAPK通路,并激活下游信號(hào)分子銜接蛋白1(adaptor protein-1,AP1)和激活轉(zhuǎn)錄因子2(activated transcription factor 2,ATF2),ATF2蛋白的磷酸化水平上調(diào)后可促進(jìn)PRV復(fù)制,揭示了宿主蛋白ATF2磷酸化水平與PRV增殖之間的相互作用,使ATF2可為抑制PRV感染提供潛在的新治療靶點(diǎn)[23]。但MAPK還可被受體酪氨酸激酶激活,與PRV感染后引起細(xì)胞凋亡相關(guān)。此外,PRV與TLR2結(jié)合后可引起粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating growth factor,G-CSF)和IL-6在背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)表達(dá)增加,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)炎癥產(chǎn)生,同時(shí)Ⅰ型IFN的表達(dá)會(huì)抑制PRV感染的繼續(xù)發(fā)展,揭示了TLR2和Ⅰ型IFN在調(diào)節(jié)PRV感染早期神經(jīng)炎癥反應(yīng)的機(jī)制[24]。本實(shí)驗(yàn)室研究表明,PRV感染三叉神經(jīng)節(jié)(trigeminal ganglia cell,TG)細(xì)胞后,可通過(guò)MyD88途徑激活NF-κB信號(hào)通路,并引起IL-1、IL-6等炎癥因子的表達(dá)上升。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),PRV感染對(duì)MyD88、TRIF和NF-κB/p65的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平表現(xiàn)為先下調(diào)后上調(diào),以及通過(guò)NF-κB信號(hào)通路上調(diào)IL-6、IL-1β等炎癥因子[25],從而增強(qiáng)細(xì)胞的免疫應(yīng)答。劉曉賀等[26]研究發(fā)現(xiàn),PRV感染TANK結(jié)合激酶1(TANK binds to kinase 1,TBK1)敲除的PK-15細(xì)胞后,IFN-β、ISG15及IL-1β的表達(dá)均被抑制,病毒基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)以及子代病毒的感染力均有所提高。被TLR3/4-TRIF信號(hào)通路活化的TBK1進(jìn)一步促進(jìn)下游IRF3磷酸化以及IFN合成,隨后IFN與細(xì)胞表面受體結(jié)合,并通過(guò)Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase-signal transducers and transcriptional activators,JAK-STAT)信號(hào)通路啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),引起數(shù)百個(gè)ISGs的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),從而實(shí)現(xiàn)抗病毒免疫反應(yīng)。但TBK1的活化還可被RIG-I-MAVS、cGAS-STING(stimulator of interferon genes,干擾素刺激基因)2條信號(hào)通路活化,因此,PRV感染后TBK1主要受上述哪條信號(hào)的活化等問(wèn)題還有待進(jìn)一步探索。

據(jù)報(bào)道,病毒已進(jìn)化出多種免疫逃逸機(jī)制。WANG等[27]首次證明PRV UL24蛋白可以消除腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF)介導(dǎo)的NF-κB激活,TNF-α可充當(dāng)NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)的激活劑,觸發(fā)IκBα快速降解,引起NF-κB二聚體的偶聯(lián)并使之活化。UL24還可選擇性地與P65相互作用,通過(guò)蛋白酶體途徑顯著降解P65來(lái)終止NF-κB激活。隨后,ZHANG等[28]發(fā)現(xiàn)PRV編碼的早期基因蛋白(infected cell protein 0,ICP0)也可顯著抑制TNF-α介導(dǎo)的NF-κB活化,深入研究表明ICP0阻止了IκBα的降解,導(dǎo)致IκBα無(wú)法釋放NF-κB二聚體,同時(shí)ICP0與p65相互作用,抑制p65的磷酸化和核易位并通過(guò)蛋白酶體途徑降低其表達(dá),從而影響NF-κB信號(hào)通路的激活并抑制炎癥因子IL-6和IL-8的表達(dá),證明ICP0在PRV免疫逃逸中的重要作用。ROMERO等[29-30]證明PRV感染后可通過(guò)非典型的方式觸發(fā)NF-κB的持續(xù)激活,并顯著調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)軸,阻止典型的NF-κB信號(hào)反應(yīng)和促炎基因表達(dá),并使感染細(xì)胞對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的典型NF-κB激活產(chǎn)生抗性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),PRV早期蛋白可觸發(fā)DNA損傷應(yīng)答(DNA damage response,DDR)-NF-κB信號(hào)軸,從而觸發(fā)非典型NF-κB信號(hào)通路的持續(xù)激活,這種激活發(fā)生在病毒復(fù)制之前,可能是宿主對(duì)外來(lái)應(yīng)激源的一種早期反應(yīng)。而晚期病毒因子使PRV能夠充分抑制典型NF-κB信號(hào)通路中促炎基因的表達(dá),這一機(jī)制可能與病毒利用機(jī)體實(shí)現(xiàn)潛伏入侵有關(guān),但PRV感染期間非典型DDR-NF-κB信號(hào)軸激活的確切機(jī)制有待深入研究。

此外,針對(duì)TLRs信號(hào)通路研發(fā)出多種具有抗病毒作用的天然藥物,如早期研究發(fā)現(xiàn),維生素E、色氨酸、蘇氨酸等補(bǔ)充劑可調(diào)節(jié)TLRs表達(dá),以此增加機(jī)體對(duì)PRV感染的抵抗力[31-33]。以及木犀草素、白藜蘆醇、虎杖黃酮類的乙酸乙酯提取物、日本粳稻水提取物、楊梅素等都可通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB、MAPK等信號(hào)通路來(lái)激活宿主免疫防御、減輕PRV感染后的炎癥反應(yīng)等抵抗病毒入侵感染[34-38],這為抗PRV藥物的研發(fā)提供了一定的思路和參考。

2 cGAS受體信號(hào)通路

2.1 cGAS受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制多項(xiàng)研究表明,cGAS是一種直接與DNA結(jié)合的細(xì)胞質(zhì)DNA識(shí)別受體,由約520個(gè)氨基酸組成,主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,屬于結(jié)構(gòu)保守的cGAS/DncV樣核苷酸轉(zhuǎn)移酶超家族。后者在原核生物和真核生物中普遍表達(dá),并且可以選擇性地使用嘌呤和嘧啶核苷酸為底物來(lái)合成線性或環(huán)狀二核苷酸甚至三核苷酸化合物,使其充當(dāng)細(xì)胞內(nèi)次級(jí)信使[39]。cGAS通常在識(shí)別雙鏈DNA(double-stranded DNA,dsDNA)后被激活,引起cGAS發(fā)生變構(gòu)效應(yīng)并催化底物三磷酸腺苷和三磷酸鳥苷合成2′-5′/3′-5′環(huán)GMP-AMP(2′3′-cyclic GMP-AMP,2′3′-cGAMP)。2′3′-cGAMP擴(kuò)散到整個(gè)細(xì)胞中,激活STING,并誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素和NF-κB反應(yīng)以引發(fā)保護(hù)性抗病毒免疫[40-41]。

STING是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)上的一種蛋白質(zhì),靜息狀態(tài)下,STING與ER上的基質(zhì)互作分子1(stromal interaction molecule 1,STIM1)結(jié)合,使STING保留于ER中。當(dāng)STING與cGAMP結(jié)合后會(huì)破壞STING和STIM1之間的相互作用,從而啟動(dòng)STING從ER易位到高爾基體內(nèi),并在那募集并磷酸化TBK1和IκB激酶ε(IκB kinase ε,IKKε)[42]。與cGAMP結(jié)合還會(huì)觸發(fā)STING的C端尾部(C-terminal tail,CTT)的釋放和STING二聚體的聚合,釋放的CTT募集TBK1并由反式自磷酸化的STING二聚體激活,活化的TBK1磷酸化STING CTT中的Ser殘基,進(jìn)一步募集IRF3。募集的IRF3被TBK1磷酸化,然后二聚化并易位到細(xì)胞核中以促進(jìn)Ⅰ型IFN及下游ISGs表達(dá)[43-45]。此外,cGAS-STING通路還能促進(jìn)NF-κB的轉(zhuǎn)錄以及招募STAT6等途徑抑制病毒復(fù)制[42]。

2.2 PRV感染后對(duì)cGAS受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響近年來(lái),cGAS-STING信號(hào)通路成為dsDNA病毒研究中的熱點(diǎn)領(lǐng)域。早期研究中,XIE等[46]發(fā)現(xiàn)存在于ER中的豬STING過(guò)表達(dá)可激活I(lǐng)RF3和NF-κB并誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生,而敲除STING后顯著抑制了IFN-β啟動(dòng)子活化和IFN-β mRNA的轉(zhuǎn)錄,表明STING是豬先天免疫信號(hào)傳導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)因子,在抗病毒過(guò)程中可能起著重要作用。隨后,WANG等[47]對(duì)豬cGAS進(jìn)行了分子克隆和功能鑒定,證明了cGAS受體可被PRV激活,引起STING和IRF3蛋白水平變化并促進(jìn)了IFN-β的表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)室后來(lái)還發(fā)現(xiàn),在PRV感染激活cGAS-STING-TBK1-IRF3信號(hào)軸后,通過(guò)該免疫通路及其干擾素-α受體-1可調(diào)節(jié)豬干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白1(porcine interferon-induced transmembrane protein 1,pIFITM1,該蛋白由ISG編碼形成)的表達(dá),受上調(diào)的pIFITM1限制PRV進(jìn)入,其機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動(dòng)性,并在病毒膜與細(xì)胞膜融合前干擾病毒復(fù)制等方式實(shí)現(xiàn)抗病毒功能[48]。同時(shí),該團(tuán)隊(duì)研究表明,通過(guò)溴結(jié)構(gòu)域蛋白4(bromodomain-containing protein 4,BRD4)和ADP-核糖聚合酶1[poly (ADP-ribose) polymerase 1,PARP1]抑制誘導(dǎo)的DDR能激活cGAS-STING信號(hào)通路并抑制PRV的附著。BRD4、PARP1的功能是與組蛋白一同參與DNA損傷后的修復(fù)過(guò)程,BRD4參與表觀遺傳及染色質(zhì)重組過(guò)程,也能調(diào)節(jié)某些病毒基因轉(zhuǎn)錄促進(jìn)病毒感染,PARP1則主要參與單鏈斷裂修復(fù)。在機(jī)制上,抑制BRD4和PARP1后誘導(dǎo)的DDR導(dǎo)致dsDNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中,引起cGAS與dsDNA結(jié)合并激活了cGAS-STING-TB-K1-IRF3信號(hào)軸,從而引起上述一系列免疫反應(yīng)的產(chǎn)生,并且認(rèn)為pIFITM1的上調(diào)可能與抑制BRD4所引起的IFN表達(dá)有關(guān)[49-50]。這與ROMERO等[30]發(fā)現(xiàn)病毒通過(guò)激活DDR-NF-κB非典型途徑可實(shí)現(xiàn)免疫逃逸機(jī)制不同,可能是病毒利用機(jī)體非典型DDR-NF-κB途徑實(shí)現(xiàn)早期的入侵感染,但隨著病毒復(fù)制引起機(jī)體的抗病毒途徑激活,從不同途徑引起免疫逃逸和抗病毒機(jī)制的差異。隨后GUO等[51]發(fā)現(xiàn)抑制組蛋白脫乙酰酶1(histone deacetylase 1,HDAC1)能以相同作用機(jī)制抑制PRV感染,進(jìn)一步完善了通過(guò)DDR激活cGAS信號(hào)通路的分子機(jī)制,同時(shí)也為蛋白/酶抑制劑治療PRV提供一定思路和見解,但PRV感染后機(jī)體如何抑制BRD4、PARP1引起DDR還需進(jìn)一步探索。

此外,某些RNA解旋酶也可參與宿主免疫反應(yīng),如DDX1、DDX21和DHX36等與細(xì)胞質(zhì)中的接頭蛋白TRIF形成復(fù)合物以控制IFN反應(yīng)[52]。近期有研究發(fā)現(xiàn)另一種RNA解旋酶DDX56在PRV感染后可靶向cGAS,與其相互作用并促進(jìn)cGAS表達(dá),以及促進(jìn)IRF3磷酸化和細(xì)胞核易位,從而增強(qiáng)cGAS-STING誘導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生以抵抗PRV入侵感染[53],為研究抗病毒治療藥物提供了新的潛在靶點(diǎn)。

相反,PRV也通過(guò)多種途徑抑制cGAS-STING信號(hào)通路來(lái)逃避宿主的天然免疫。外核苷酸焦磷酸酶磷酸二酯酶1(exonucleotide pyrophosphatase phosphodiesterase1,ENPP1)被鑒定為cGAMP的水解酶,重組ENPP1可有效水解2′3′-cGAMP,從而調(diào)節(jié)cGAMP的穩(wěn)態(tài)。近期一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),ENPP1過(guò)表達(dá)后可經(jīng)過(guò)度水解cGAMP、抑制IRF3磷酸化和減少IFN-β分泌而導(dǎo)致PRV感染增強(qiáng),但還不確定PRV與ENPP1間的相互作用關(guān)系[54]。隨后,BO等[55]為探索PRV與cGAS-STING間的關(guān)系,篩選了50個(gè)PRV ORF,并首次證明PRV UL13通過(guò)磷酸化IRF3并破壞IRF3與IRF3響應(yīng)啟動(dòng)子的結(jié)合來(lái)有效抑制cGAS-STING介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生,以及抑制下游ISG的表達(dá),但并未對(duì)UL13與cGAS-STING之間的關(guān)系作出解釋。之后有學(xué)者證明了UL13可與STING的CDN結(jié)構(gòu)域相互作用,并募集E3泛素蛋白連接酶(E3 ubiquitin protein ligase,RNF5)以促進(jìn)K27-/K29連接的泛素化和STING的降解,從而破壞STING的正常生理功能[56]。在LU等[57]的報(bào)道中,PRV gE可以通過(guò)靶向降解CREB結(jié)合蛋白(CREB-binding protein,CBP)來(lái)中斷IRF3和CBP的結(jié)合,從而對(duì)cGAS-STING介導(dǎo)的IFN-β表達(dá)產(chǎn)生影響,BO等[55]所發(fā)現(xiàn)的UL13則不會(huì)影響IRF3與CBP的結(jié)合。以及LIU等[58]發(fā)現(xiàn)PRV UL24通過(guò)泛素蛋白酶體途徑降解IRF7拮抗cGAS-STING介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)。此外,病毒還可通過(guò)宿主熱休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)將cGAS泛素化后并使其降解,促進(jìn)PRV感染[59],這可能是由病毒某種蛋白與HSP27相互作用后所引起。綜上,PRV可通過(guò)多種途徑影響cGAS-STING通路介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)。

3 RLRs受體信號(hào)通路

3.1 RLRs受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制RLRs是主要位于細(xì)胞質(zhì)中的一類RNA識(shí)別受體,包括RIG-I、黑素瘤分化相關(guān)基因蛋白5(melanoma differentiation-associated gene 5,MDA5)、laboratory of genetics and physiology 2(LGP2),3者的中央解旋酶結(jié)構(gòu)域和羧基末端結(jié)構(gòu)域協(xié)同檢測(cè)病原體RNA。RIG-I和MDA5還具有2個(gè)氨基末端胱天蛋白酶募集域蛋白(caspase recruitment domain-containingprotein,CARDs)以介導(dǎo)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),LGP2無(wú)該結(jié)構(gòu)域,但被認(rèn)為具有調(diào)節(jié)RIG-I和MDA5信號(hào)傳導(dǎo)的功能[60]。RLRs主要識(shí)別RNA病毒,但也以識(shí)別一些dsDNA病毒,這與dsDNA病毒的正負(fù)鏈在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中都可產(chǎn)生dsRNA中間體有關(guān)[61]。

受到病原體刺激后,引起RIG-I/MDA5的構(gòu)象和CARD結(jié)構(gòu)域多聚化改變,這使RIG-I/MDA5的CARD結(jié)構(gòu)域與下游線粒體抗病毒信號(hào)蛋白(mitochondrial antiviral signaling proteins,MAVS)相互作用并招募MAVS[62]。所募集的MAVS激活TRAF、TBK1、IKK等信號(hào)蛋白分子,并引起下游IRF3/IRF7、NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子的激活和核易位,最終引起Ⅰ型干擾素和促炎細(xì)胞因子的分泌以參與機(jī)體的抗病毒反應(yīng)[61]。

3.2 PRV感染后對(duì)RLRs受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響早期研究表明,DNA病毒復(fù)制過(guò)程中所產(chǎn)生的RNA和病毒感染過(guò)程中來(lái)源于宿主產(chǎn)生的RNA可啟動(dòng)RLRs介導(dǎo)的信號(hào)通路[63],證明RLRs介導(dǎo)的抗病毒先天免疫反應(yīng)也可能在防御DNA病毒感染方面發(fā)揮重要作用。近期,研究發(fā)現(xiàn)PRV感染后可對(duì)RLRs介導(dǎo)的信號(hào)通路產(chǎn)生不同的影響。CHEN等[64]發(fā)現(xiàn),ISG家族的寡腺苷酸合成酶樣蛋白(oligonucleotide synthase-like protein synthe-tase,OASL)可促進(jìn)RIG-I介導(dǎo)的IFN表達(dá)以及ISG誘導(dǎo)來(lái)抑制PRV增殖,但PRV的UL24也會(huì)損害RIG-I信號(hào)傳導(dǎo),從而抑制IFN和ISG的轉(zhuǎn)錄以及降低RIG-I誘導(dǎo)的內(nèi)源性O(shè)ASL表達(dá),拮抗OASL抗病毒作用。同時(shí),OASL還可與cGAS結(jié)合并抑制cGAMP合成,在DNA病毒感染期間作為cGAS-STING信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子來(lái)限制Ⅰ型IFN反應(yīng),這可能是機(jī)體維持細(xì)胞自身穩(wěn)態(tài)的一種重要機(jī)制[65]。此外,ZHAO等[66]研究表明,PRV UL13通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化來(lái)抑制RIG-I和MDA5的表達(dá),從而逃避RLRs介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)。以及PRV UL13和UL24可抑制抗病毒因子鋅指CCHC型含蛋白3(zinc refers to CCHC type protein-containing 3,ZCCHC3)的表達(dá),干擾ZCCHC3與RIG-I間的相互作用,從而降低下游干擾素的分泌[67]。

4 NOD樣受體信號(hào)通路

NLRs家族包含20多個(gè)成員,如NOD、NOD樣受體蛋白1/3(NOD-like receptor protein 1/3,NLRP1/3)、NOD樣受體C4/C5(NOD-like receptors C4/C5,NLRC4/5)、IFI16等,以及HIN-200家族的成員黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2,AIM2),在識(shí)別內(nèi)源性或外源性PAMPs/DAMPs細(xì)胞內(nèi)損傷相關(guān)分子模式(danger associated molecular patterns)后激活相應(yīng)骨架蛋白組裝形成炎癥小體。炎癥小體在感受到來(lái)自病原菌的信號(hào)分子后,通過(guò)激活炎癥性含半胱氨酸的胱天蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)并將細(xì)胞因子前體切割成成熟的細(xì)胞因子,進(jìn)而導(dǎo)致白介素(IL-1β和IL-18)等炎癥因子的成熟和分泌以及細(xì)胞焦亡的發(fā)生[68]。其中,NLRP3是表征性最好的炎癥小體之一,也是近年來(lái)研究最多的一種炎癥小體復(fù)合物,由核心蛋白NLRP3和含有半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣分子組成,這兩者都是激活pro-Caspase-1以產(chǎn)生2個(gè)主要效應(yīng)物IL-1β和IL-18所必需的[69]。

炎癥是一把雙刃劍,在新陳代謝中起著至關(guān)重要的作用。輕微的炎癥反應(yīng)可以在一定程度上保護(hù)身體,有助于修復(fù)受損組織和穩(wěn)態(tài)重建。然而,過(guò)度的炎癥可能會(huì)形成“細(xì)胞因子風(fēng)暴”,導(dǎo)致組織損傷。SUN等[70]發(fā)現(xiàn),PRV感染小鼠后激活NLRP3并在大腦內(nèi)形成“細(xì)胞因子風(fēng)暴”和焦亡,這也成為加速小鼠死亡的主要原因。而細(xì)胞內(nèi)NLRP3過(guò)度激活可能與病毒感染后引起ATP的釋放有關(guān),ATP作為DAMPs促進(jìn)了NLRP3炎癥小體的活化并增強(qiáng)了PRV在小鼠急性感染期間的致病性[71]。但PRV與NOD樣受體信號(hào)通路間的分子機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

5 C型凝集素受體

C型凝集素受體(C-type lectin receptor,CLRs)是位于細(xì)胞表面C型凝集素的統(tǒng)稱,根據(jù)結(jié)構(gòu)域的不同分為經(jīng)典C型凝集素受體與非經(jīng)典C型凝集素受體/C型凝集素樣受體。大多數(shù)的CLRs包含1個(gè)或多個(gè)碳水化合物識(shí)別域或C型凝集素樣識(shí)別域,經(jīng)典C型凝集素主要與識(shí)別碳水化合物配體有關(guān),非經(jīng)典C型凝集素參與識(shí)別非碳水化合物配體如蛋白質(zhì)、脂類等,但也可通過(guò)某些途徑參與碳水化合物識(shí)別。CLRs具有與TLRs相類似的生物學(xué)功能,在識(shí)別抗原、參與調(diào)節(jié)機(jī)體先天免疫和維持自身穩(wěn)態(tài)等方面起重要作用[72]。DENAEGHEL等[73]研究表明,PRV感染可導(dǎo)致NK細(xì)胞C型凝集素樣受體NKG2D的配體pULBP1和另一種潛在的NKG2D配體pMIC2的快速和漸進(jìn)性下調(diào),引起NKG2D與感染細(xì)胞表面的結(jié)合減少,從而抑制NK細(xì)胞活性,使PRV實(shí)現(xiàn)免疫逃逸,但PRV如何引起NKG2D配體減少的作用機(jī)制還有待研究。

6 受體酪氨酸激酶

受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTKs)是一種既可充當(dāng)受體又具有酶的生物學(xué)功能的跨膜蛋白,屬于酪氨酸激酶的一個(gè)亞類,包含20個(gè)亞科58種RTK。由細(xì)胞外配體結(jié)合域、跨膜螺旋區(qū)、細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(tyrosine kinase domain,TKD)和一系列酪氨酸殘基組成,與配體結(jié)合后RTK發(fā)生磷酸化并激活下游多條信號(hào)通路,如MAPK、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3-K/Akt)信號(hào)通路等。這些通路參與細(xì)胞的存活、增殖、凋亡、分化和新陳代謝等生理過(guò)程[74]。

CHANG等[75]早期研究表明,PRV感染后可激活PI3-K/Akt信號(hào)通路,而PRV Us3蛋白可誘導(dǎo)該通路的抗凋亡相關(guān)因子表達(dá)增加,如Akt、PDK-1等,從而抑制PRV感染后的宿主細(xì)胞凋亡。隨后,該實(shí)驗(yàn)室以小鼠TG細(xì)胞為研究模型,發(fā)現(xiàn)PRV感染TG細(xì)胞后也可激活細(xì)胞內(nèi)的PI3-K/Akt信號(hào)通路,而在阻斷該通路后TG細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,表明PRV可通過(guò)調(diào)控該通路抑制細(xì)胞凋亡,與CHANG等[76]的研究一致。ESTEVES等[77]發(fā)現(xiàn),PRV的Us3蛋白可在感染神經(jīng)元細(xì)胞早期激活A(yù)kt-mToRC1信號(hào)通路,促進(jìn)病毒在軸突局部的翻譯并增強(qiáng)PRV核衣殼在軸突內(nèi)的有效逆行運(yùn)輸,同時(shí)截?cái)噍S突和遠(yuǎn)端細(xì)胞體間的通信,進(jìn)一步揭示了PRV的潛伏機(jī)制。因此,PI3-K/Akt信號(hào)通路可成為治療PRV的潛在靶標(biāo),如FANG等[78]發(fā)現(xiàn)對(duì)苯二酚可通過(guò)刺激與PI3K-AKT信號(hào)通路相關(guān)的基因,增加AKT mRNA的產(chǎn)生并激活N2a細(xì)胞中的AKT磷酸化,引起TNF-α增加抑制病毒復(fù)制,為研發(fā)抗PRV藥物提供了一定的思路及依據(jù)。盡管PRV感染后可激活PI3-K/Akt信號(hào)通路以及RTK作為該信號(hào)通路的上游受體已得到多項(xiàng)研究的證實(shí),但PRV感染后通過(guò)何種受體與配體結(jié)合以激活下游PI3K途徑還有待確定,未來(lái)可進(jìn)一步研究該通路受體與PRV間的關(guān)系,為抗病毒藥物的潛在靶點(diǎn)提供更多依據(jù)。

7 小結(jié)

綜上所述,當(dāng)PRV入侵感染后機(jī)體可通過(guò)TLRs、cGAS、RLRs、NLRs、CLRs等PRRs激活下游信號(hào)通路防止病毒入侵,同時(shí)PRV還可通過(guò)信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞天然免疫進(jìn)行調(diào)控,使得PRV可從多種途徑逃避機(jī)體的天然免疫。通過(guò)對(duì)這些信號(hào)通路的研究可以更加深入了解病毒的致病機(jī)制和機(jī)體的抗病毒機(jī)制,同時(shí)揭示了PRV潛伏感染的原因,這將對(duì)PRV的靶向治療和預(yù)防提供更多可行性方案。

病毒感染后所激活的信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜,不同通路之間相互聯(lián)系、互相影響,所以信號(hào)通路間的橫向和縱向研究都具有很大的探索空間。本實(shí)驗(yàn)室前期已對(duì)PRV感染TG細(xì)胞后PI3K/Akt和NF-κB通路做了一定研究,后續(xù)將對(duì)PRV感染后引起干擾素變化的相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行探索,以期與廣大科研工作者們一同對(duì)PRV感染機(jī)制及潛伏機(jī)制不斷進(jìn)行補(bǔ)充完善。