李 陽(yáng),李 摯,鄧鈺蓱,馬淑慧,徐 剛*

(1.天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300392;2.中華人民共和國(guó)太原海關(guān),山西 太原 030006)

禽傳染性支氣管炎(infectious bronchitis,IB)是一種急性、高度接觸性傳染病,常見(jiàn)于雞,其病原為傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV),發(fā)病率高且傳染性極強(qiáng),主要影響產(chǎn)蛋雞的生殖功能使其產(chǎn)蛋率及蛋品質(zhì)下降,給國(guó)內(nèi)外養(yǎng)禽行業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。IB在臨床上主要分為3種類(lèi)型:呼吸型、生殖型及腎病型,臨床特征多為氣管啰音、打噴嚏及咳嗽等。IB首次發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)30年代的美國(guó)北達(dá)科他州[3],20世紀(jì)70年代初在我國(guó)開(kāi)始出現(xiàn),并于1982年首次報(bào)道致腎病型病例[4]。在發(fā)現(xiàn)IBV的幾十年以來(lái),IBV毒株不斷變異,血清型眾多,新的血清型也不斷出現(xiàn)?，F(xiàn)有的商品化疫苗通常只能針對(duì)性地預(yù)防1～2種血清型,不能很好地預(yù)防其他血清型病毒的感染,而且免疫持續(xù)的時(shí)間不長(zhǎng),須多次接種疫苗。因此,當(dāng)下的國(guó)內(nèi)養(yǎng)禽業(yè)迫切需要一種針對(duì)大多數(shù)流行血清型免疫效果持久的IBV疫苗?，F(xiàn)將現(xiàn)階段疫苗的種類(lèi)及研發(fā)情況進(jìn)行歸納,并探討現(xiàn)有IBV疫苗的利弊和今后研發(fā)的方向。

1 IBV

冠狀病毒在分類(lèi)上屬于套式病毒目、冠狀病毒科[5],包括α、β、γ和δ 4個(gè)屬,其基因組由單股正鏈RNA組成,大小從27 000到32 000 bp,是最大的RNA病毒[6-7]。IBV屬于γ冠狀病毒屬,基因約為27 000 bp,主要分為6個(gè)基因片段。基因1主要編碼非結(jié)構(gòu)蛋白,占基因組總長(zhǎng)的2/3。占基因組總長(zhǎng)1/3的基因2～6負(fù)責(zé)編碼IBV的4種結(jié)構(gòu)蛋白:纖突蛋白(S)、小囊膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)和4個(gè)輔助蛋白(3a、3b、5a和5b)[8]。其中,S蛋白由3 400個(gè)核苷酸組成,翻譯后在氨基末端裂解為S1亞基,在羧基末端裂解為S2亞基[9]。S1亞基蛋白在受體結(jié)合中起主要作用[10],具有免疫原性,包含中和抗體的多種表位[11-12]。E蛋白是最小的結(jié)構(gòu)蛋白[13-14],具有離子通道活性[13],主要協(xié)同M蛋白參與IBV增殖過(guò)程中的病毒出芽、裝配與釋放[15-17]。M蛋白在病毒蛋白中占比較大,主要負(fù)責(zé)病毒的裝配與成熟[18]。N蛋白為40～50 kDa,其主要作用是與病毒RNA結(jié)合形成保護(hù)基因組結(jié)構(gòu)—核衣殼結(jié)構(gòu)[19-20]。輔助蛋白3a、3b、5a和5b的具體功能未知,可能有增加病毒毒力的作用[21-22],但與病毒復(fù)制關(guān)系甚微[23]。

2 IB常規(guī)疫苗

2.1 減毒活疫苗IB減毒活疫苗的制備方法是將IBV毒株接種于雞胚內(nèi)并連續(xù)傳代將其致弱,免疫原性保留程度較好。但是,免疫效果持續(xù)時(shí)間比較短,需要在接種2～3周后使用相同或其他毒株的組合再次進(jìn)行強(qiáng)化接種才可以達(dá)到良好的免疫效果[24]。目前,Mass型的H120和H52株是世界上使用最廣泛的減毒活疫苗毒株。但在國(guó)內(nèi),QX與TW型是目前較為流行的基因型[25],且都與經(jīng)典的Mass型疫苗株在基因型和血清型上存在較大差異,導(dǎo)致禽類(lèi)免疫M(jìn)ass型疫苗株后仍頻頻發(fā)病。

近年來(lái),許多研究也發(fā)現(xiàn)了針對(duì)QX和TW型IBV流行株的疫苗候選株。通過(guò)傳代減毒致弱選擇的第90代YX10p90毒株[26]、連續(xù)傳代130代得到的SZ130株[27]、IBV QX型弱毒YN(aYN)株[28]、將QX型IBV QXL毒株連續(xù)傳87代致弱得到的QXL87株[29]等都是目前針對(duì)性預(yù)防QX型毒株的良好的疫苗候選株。目前,國(guó)內(nèi)上市的唯一的QX型疫苗——雞新城疫、雞傳染性支氣管炎(LaSota株+QXL87株)二聯(lián)活疫苗中使用的就是QXL87株,免疫效果良好[30]。其次,XU等[31]發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)140次傳代的TW型減毒株aGD株安全性高,對(duì)SPF雞無(wú)明顯致病性,免疫后保護(hù)TW和QX型毒株的侵害,可以作為預(yù)防TW和QX型毒株的疫苗候選。

減毒活疫苗的制備過(guò)程簡(jiǎn)單、成本較低、使用方便,僅需噴霧免疫或飲水免疫就可以群體免疫,并在禽類(lèi)體內(nèi)同時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫[32]。但是,減毒活疫苗的研制耗時(shí)長(zhǎng),安全性較差,雖已經(jīng)過(guò)傳代致弱,但仍然有一定的致病能力,有可能在雞群內(nèi)造成IB的傳播。另外,減毒苗還存在毒力返強(qiáng)或是毒力不穩(wěn)定的問(wèn)題,同時(shí)使用多種減毒苗時(shí),還可能造成減毒苗間或減毒苗和野毒株間重組變異產(chǎn)生新血清型[33-35]。

2.2 滅活疫苗滅活疫苗是指病毒通過(guò)物理或化學(xué)方法滅活使抗原失去致病性保留抗原性的疫苗。滅活苗安全性好,不會(huì)返毒,早在1977年COUGH等[32]就首次使用油乳劑IB滅活疫苗,王紅寧等[36]之后也研制出了IB多價(jià)油乳劑滅活疫苗。近幾年來(lái),滅活苗通常與禽流感、雞新城疫、傳染性法氏囊病等病組成多聯(lián)疫苗,洪素梅等[37]試驗(yàn)表明雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感(H9亞型)三聯(lián)滅活苗(LaSota株+M41株+Re-9株)[三聯(lián)苗(Re-9株)]投入應(yīng)用后免疫效果良好。另外,從多年多個(gè)省市中篩選出的QX型IBV JS-96株制成的油乳劑滅活苗對(duì)QX型IBV的保護(hù)效果良好[38],此株可作為IBV多價(jià)滅活苗的候選毒株。

但是,滅活苗的缺點(diǎn)也十分明顯:滅活苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)很短,因此需要多次接種免疫,同時(shí)需要注射其他減毒活疫苗或者大劑量佐劑,成本較高,應(yīng)用較為困難[39];而且改變注射部位也會(huì)影響其免疫效果,甚至可能產(chǎn)生排斥反應(yīng)[40];滅活苗一般僅針對(duì)地方化流行的IBV免疫效果較好。因此,IBV滅活苗對(duì)于地方流行株應(yīng)用范圍更廣,不宜商品化,無(wú)法在全國(guó)內(nèi)大規(guī)模生產(chǎn)使用。

3 基因工程疫苗

3.1 亞單位疫苗亞單位疫苗是指利用基因工程的方法構(gòu)建,在高效表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)強(qiáng)毒病原體的某種免疫相關(guān)抗原[41],提取抗原后制成的疫苗,安全性高、無(wú)毒、生產(chǎn)成本低、經(jīng)濟(jì)效益高。IB基因工程亞單位疫苗的表達(dá)系統(tǒng)主要包括大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等[32]。IBV的主要免疫原基因?yàn)槔w突蛋白S基因。據(jù)報(bào)道,全長(zhǎng)S1基因重組蛋白免疫小鼠可以產(chǎn)生IBV特異性中和抗體[41]。蘇艷靜等[42]也利用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了IBV GX-YL5毒株的S1蛋白,調(diào)整蛋白濃度后對(duì)成年新西蘭大白兔進(jìn)行免疫,結(jié)果試驗(yàn)動(dòng)物的特異性免疫良好,S1蛋白的免疫原性足以作為亞單位疫苗的首選靶蛋白。另?yè)?jù)報(bào)道,植物系統(tǒng)經(jīng)試驗(yàn)也可以有效表達(dá)IBV S基因——從根瘤菌提取的全長(zhǎng)S基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯并進(jìn)行表達(dá),用獲得的免疫原免疫雛雞且在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)抗體[43]。

S蛋白是IBV主要的免疫原蛋白,但研究發(fā)現(xiàn)N蛋白上也存在一定量抗原決定簇[44],其蛋白抗原指數(shù)比S蛋白要高[45],N蛋白上的線(xiàn)性B細(xì)胞抗原也被證實(shí)[46],因此N蛋白同樣也可以作為制作IBV亞單位疫苗的有效抗原,這為IBV亞單位疫苗的研發(fā)提供了一種新思路。但是,亞單位疫苗相對(duì)于其他類(lèi)型的疫苗來(lái)說(shuō)免疫原性較差,免疫效果較差,在制作時(shí)需要添加大量有活性的佐劑,并不能像活疫苗一樣在一定范圍內(nèi)廣泛使用。

3.2 重組病毒活載體疫苗重組病毒活載體疫苗是利用分子生物學(xué)遺傳工程技術(shù),將某一病原的保護(hù)性抗原基因整合到目的病毒的非必需基因片段,使該保護(hù)性抗原基因表達(dá),一般以痘病毒或腺病毒作為載體。痘病毒是最早作為病毒疫苗載體的病毒,在獸醫(yī)領(lǐng)域第一次使用是在1982年牛痘病毒作為載體表達(dá)外源基因[47]。痘病毒在IBV疫苗中首次被使用是BINNS等[48]利用其作為載體表達(dá)S1蛋白研制出的IBV基因工程疫苗,安全性強(qiáng),在體內(nèi)復(fù)制無(wú)害,可以激發(fā)機(jī)體較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。雖然痘病毒活載體疫苗具有高效、成本低、免疫持久等優(yōu)點(diǎn),但經(jīng)試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn),痘病毒疫苗和減毒疫苗的免疫效果相當(dāng),而痘病毒疫苗組的抗體水平低于減毒疫苗組[49],因此痘病毒載體疫苗仍然有優(yōu)化改進(jìn)的空間。將腺病毒作為重組病毒疫苗的載體時(shí),腺病毒會(huì)導(dǎo)致淋巴組織的持續(xù)性感染[41-50],顯示以腺病毒為載體的重組疫苗安全性較差,適用范圍受到限制。

3.3 重組細(xì)菌活載體疫苗重組細(xì)菌活載體疫苗作為一種新型疫苗,和病毒活載體疫苗同是活載體疫苗的主要種類(lèi)。細(xì)菌活載體疫苗主要以減毒沙門(mén)菌和分枝桿菌為主。由于細(xì)菌的培養(yǎng)方便,耗時(shí)短,易擴(kuò)增,經(jīng)改造后的細(xì)菌毒力低,可以一同運(yùn)輸多抗原和增強(qiáng)免疫的基因的真核表達(dá)質(zhì)粒[41]。王芳等[51]將構(gòu)建的重組減毒鼠傷寒沙門(mén)菌接種小鼠,觀察1個(gè)月后未發(fā)現(xiàn)小鼠有異常現(xiàn)象,解剖后臟器也未見(jiàn)異常,且仍能從小鼠體內(nèi)分離到細(xì)菌,這標(biāo)志著此疫苗能夠使機(jī)體產(chǎn)生足夠的免疫保護(hù)。此外,以減毒鼠傷寒沙門(mén)菌為載體表達(dá)IBV S1基因的重組疫苗防御效果與減毒苗和滅活苗相當(dāng)[52],以分枝桿菌為載體的IBV重組疫苗同樣具有良好的免疫效果,可以保護(hù)SPF雞免受同血清型強(qiáng)毒株的攻擊[53]。雖然以細(xì)菌為載體的重組疫苗具有較好的免疫效果,遞呈抗原及基因能力良好,但是其安全性爭(zhēng)議較大,一些減毒的重組疫苗進(jìn)入機(jī)體免疫后仍會(huì)毒力返強(qiáng)并產(chǎn)生損傷。另外,重組細(xì)菌活載體疫苗在機(jī)體免疫時(shí)會(huì)在一定程度上出現(xiàn)免疫原耐受的現(xiàn)象,導(dǎo)致其免疫效力大幅下降,并不能在禽類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)廣泛使用。

3.4 核酸疫苗核酸疫苗又稱(chēng)基因疫苗,指將含有編碼的免疫源性蛋白質(zhì)基因序列注入特定的宿主細(xì)胞內(nèi),其通過(guò)宿主細(xì)胞表達(dá)抗原蛋白并使宿主細(xì)胞產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)的免疫應(yīng)答,主要分為DNA疫苗和RNA疫苗2種,目前主要以研究DNA疫苗為主。與傳統(tǒng)減毒苗、滅活苗相比,核酸疫苗無(wú)需載體,通過(guò)特定途徑激活免疫機(jī)制,可以大大降低因載體轉(zhuǎn)化造成免疫效力下降的風(fēng)險(xiǎn)[54]。在我國(guó),步志高等[55]最早構(gòu)建了IBV的DNA免疫質(zhì)粒,證明了其可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫。在國(guó)外也很早開(kāi)發(fā)出一種名為pDKArkS1-DP的DNA疫苗,接種后免疫效果顯著,受強(qiáng)毒株攻擊后保護(hù)率也能達(dá)到80%左右[56]。ZUO等[57]利用新設(shè)計(jì)的免疫原開(kāi)發(fā)了DNA疫苗pV-Scon,接種后可誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫,病毒脫落明顯減少,對(duì)于像IBV此類(lèi)高變異性的病毒DNA疫苗有效可行。另外,S1編碼的DNA疫苗比N基因編碼的DNA疫苗的免疫效果強(qiáng),在機(jī)體受到病毒攻擊后提供主要保護(hù),基于此還開(kāi)發(fā)了一種編碼S1、N和M蛋白的IBV的多價(jià)DNA疫苗[58-59]。但是,DNA疫苗大部分都通過(guò)肌肉注射進(jìn)行免疫,這就限制了DNA疫苗在禽類(lèi)當(dāng)中的應(yīng)用[60]。

4 新型佐劑在IB疫苗的應(yīng)用

疫苗佐劑也稱(chēng)抗原佐劑,本身不具有抗原性,是一類(lèi)能夠增強(qiáng)抗原免疫原性的物質(zhì)。加入了佐劑的疫苗能在很大程度上增強(qiáng)疫苗本身的免疫原性,使免疫效果達(dá)到預(yù)計(jì)效果。常用的疫苗佐劑包括鋁鹽佐劑、油乳佐劑、天然佐劑、細(xì)胞因子佐劑、脂質(zhì)體佐劑、納米佐劑、Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)、皂苷佐劑、聚合物佐劑等。目前,我國(guó)獸用的新型佐劑疫苗主要是使用納米佐劑的疫苗。

納米佐劑是指用聚合物等納米粒子材料制成的佐劑[61],其優(yōu)勢(shì)在于納米粒子獨(dú)有的物理特性可以使其穿過(guò)組織間隙或毛細(xì)血管,包裹抗原后表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性,溶解性強(qiáng),被機(jī)體吸收后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的特異性免疫反應(yīng)。LOPES等[62]通過(guò)離子凝膠法制備了一種含有BR-I基因型毒株的IB滅活疫苗,該疫苗用殼聚糖納米顆粒包裹,接種納米顆粒包裹的疫苗組相對(duì)于其他組在氣管和腎臟等主要部位會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)烈的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。此外,CHANDRASEKAR等[63]通過(guò)試驗(yàn)開(kāi)發(fā)了一種新型納米佐劑系統(tǒng),此佐劑系統(tǒng)不僅能使疫苗免疫原性增強(qiáng),還能將病毒抗原分解為供抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)攝取的最佳直徑,促進(jìn)APC對(duì)抗原的吸收與加工。納米佐劑疫苗發(fā)展?jié)摿薮?但是近年來(lái)納米佐劑技術(shù)的發(fā)展并不成熟,納米佐劑的材料選取以及納米技術(shù)是研發(fā)新型納米佐劑疫苗仍要攻克的難關(guān)。

5 反向遺傳技術(shù)在IB疫苗的應(yīng)用

反向遺傳操作技術(shù)是近年來(lái)新興的一種以遺傳學(xué)為基礎(chǔ)通過(guò)改變遺傳物質(zhì)或基因型從而深入研究病毒致病基因的技術(shù)。利用反向遺傳操作技術(shù)定點(diǎn)改造流行毒株毒力基因制成的疫苗稱(chēng)為反向遺傳基因疫苗。脊髓灰質(zhì)炎病毒是最早利用該技術(shù)拯救出來(lái)的RNA病毒[64]。由于冠狀病毒基因組較大,普通的質(zhì)粒無(wú)法作為載體,而且其原生毒性較強(qiáng),其反向遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建一直難以成功,首次成功是20世紀(jì)初ALMZAN等[65]利用細(xì)菌人工染色體技術(shù)成功構(gòu)建的豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的反向遺傳操作系統(tǒng)。之后,CASAIS等[66]利用痘苗病毒為載體成功拯救出IBV Beaudette株,該株無(wú)毒力,可在細(xì)胞中繁殖。近年來(lái),周生等[67]、JIANG等[68]利用反向遺傳操作技術(shù)以IBV H120株為骨架分別替換流行株IBYZ、ck/CH/IBYZ/2011的S基因,構(gòu)建的重組株制作的疫苗免疫后效果良好,安全性較高。

利用反向遺傳技術(shù)制作出的疫苗為活疫苗,不僅具有與活疫苗相同的良好的免疫原性和安全性,在機(jī)體內(nèi)也能夠誘導(dǎo)較好的免疫反應(yīng)。該技術(shù)可以人為地改變流行毒株的毒力基因并較快地致弱毒株,在大規(guī)模制作疫苗時(shí)可以省去傳統(tǒng)致弱活疫苗冗長(zhǎng)的步驟以及其他新型疫苗繁瑣的程序,降低生產(chǎn)成本,在一定程度上解決IBV血清型眾多而沒(méi)有針對(duì)性疫苗引發(fā)的問(wèn)題。

近幾年國(guó)內(nèi)對(duì)于IB疫苗的研究大多都集中于天然無(wú)毒力的IBV Beaudette株,雖然此毒株可以在細(xì)胞中繁殖,便于研究,但是它對(duì)禽類(lèi)并無(wú)致病性,那么基于此株研究出的疫苗在實(shí)際生產(chǎn)生活中是沒(méi)有實(shí)際意義的。如果能將反向遺傳操作技術(shù)利用在我國(guó)現(xiàn)有的流行株上,針對(duì)性地尋找并改造流行株的關(guān)鍵致弱位點(diǎn)或基因,就能在IBV新的血清型出現(xiàn)時(shí)快速地研發(fā)出疫苗,降低養(yǎng)殖戶(hù)成本損失,造福行業(yè)。

6 小結(jié)與展望

IB是危害禽類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)的主要傳染病,接種IB疫苗仍然是當(dāng)前我國(guó)預(yù)防和控制IB最有效的手段,主要以減毒活疫苗與滅活苗等常規(guī)疫苗使用較為普遍?；贗B病原的研究和當(dāng)代分子生物學(xué)基礎(chǔ)的基因工程疫苗在安全性、免疫效果、持久性等方面都有了提升,新型佐劑疫苗的研究也為IB的預(yù)防提供了新思路。但是,IB疫苗的開(kāi)發(fā)和使用仍然面臨著一些問(wèn)題:IBV基因突變率高,血清型種類(lèi)眾多,一些新血清型仍在暴發(fā)式地出現(xiàn),不同血清型的毒株之間交叉保護(hù)程度較小甚至沒(méi)有;疫苗的貯存、運(yùn)輸、接種方式與飼養(yǎng)管理也同時(shí)影響著免疫效果。

目前,傳統(tǒng)疫苗仍是最經(jīng)濟(jì)有效的疫苗,尤其是減毒活疫苗,但是與其他類(lèi)型的疫苗相比,其最大的缺點(diǎn)就是時(shí)效性太差。制備針對(duì)流行毒株的減毒活疫苗時(shí),常規(guī)傳代致弱通常需要1年以上的時(shí)間。如此耗時(shí)對(duì)于及時(shí)研發(fā)針對(duì)流行毒株的疫苗工作存在較大弊端,因此,有必要尋找更為穩(wěn)定而且便捷的方法及時(shí)獲得可防控流行毒株的減毒活疫苗。近年來(lái),利用反向遺傳技術(shù)針對(duì)IBV傳代后毒力減弱的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),單獨(dú)突變S基因或復(fù)制酶基因1ab上的關(guān)鍵區(qū)域,可導(dǎo)致病毒毒力顯著減弱,說(shuō)明S基因或復(fù)制酶基因1ab是影響IBV毒力或致病性的關(guān)鍵[31,69-70]。如果能進(jìn)一步探究這些關(guān)鍵區(qū)域位點(diǎn)的普遍性,確定影響IBV毒力的決定性氨基酸位點(diǎn),就可以利用反向遺傳技術(shù),快速精準(zhǔn)的改造流行毒株的毒力決定位點(diǎn),實(shí)現(xiàn)對(duì)流行毒株的快速致弱,可以更有效、更快捷地研發(fā)出更實(shí)用、高效、安全的新型IBV疫苗,減少傳統(tǒng)疫苗給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)的不便與危害。